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문제 정의
- 약물의 용출은 생체이용률과 깊은 상관관계가 있으므로 먼저 용출시험을 행하여 대조약 및 시험약이 생물학적으로 동등할 것인지를 추정하고자 하였다. 즉, 동일성분을 동일량 함유하는 제제라 하더라도 원료, 부형제 및 제조공정 등에 따라 약물흡수의 전제조건이 되는 용출률이 다르게 나타날 수 있으므로 대조약과 시험약의 용출률을 비교하기 위하여 비교 용출시험을 행하였다.
- 400 mg)로 하였다. 한편, 가바펜틴의 최종상의 반감기는 5.9~6.6시간3)으로 보고되어 있어 생물학적 동등성시험기준 제 18조 제 4항 휴약기간의 산정기준에 따라 충분한 휴약기간을 두고자 7일로 하였다.
제안 방법
- 이 때, Cmax와 Tmax는 실즉치를 사용하였으며 AUCt 는 사다리꼴 면적계산 공식을 이용하여 최종 채혈시점까지의 값을 통상의 방법에 따라 구해 사용하였다. "뉴론틴 캡슐 400밀리그람"에 대한 "가바틴 캡슐 400밀리그람"의 생물학적동등성 여부는 식품의약품안전청이 고시한 생물학적동등성시험기준4)에 따라 AUCt, Cmax 및 Tmax 등을 평가하였다.
- 고려제약 주식회사에서 발매하고자 하는 가바펜틴 제제인 "가바틴 캡슐 400밀리그람"이 기존의 가바펜틴 제제인 한국화이자제약 주식회사의 "뉴론틴 캡슐 400밀리그람"과 그 생체이용률에 있어서 통계학적으로 동등하다는 것을 입증하기 위해서 식품의약품안전청이 고시한 생물학적동등성시험기준4)에 따라 건강한 성인 남자(평균연령 23.58세) 26명을 대상으로 2기 2제 라틴 방격법에 따라 시험하여 얻은 가바펜틴의 Tmax와 로그변환한 AUCt 및Cmax에 대하여 통계검정과 분산분석을 행하였다. 또한 대한약전 제 8개정 용출시험법 중 제 2법(패들법)에 따라 비교 용출시험을 행하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 대조약 "뉴론틴 캡슐 400밀리그람"과 시험약 "가바틴 캡슐 400 밀리그람" 각 12캡슐씩을 취하여 대한약전 제 8개정 용출 시험법 중 제 2법(패들법)에 따라 37℃에서 50rpm으로 시험하였다. 용출액은 용출시험 조건에 따라 pH 1.
- 따라서, 본 연구에서는 고려제약 주식회사에서 발매하고자 하는 가바펜틴 제제인 "가바틴 캡슐 400밀리그람"이 기존의 가바펜틴 제제인 "뉴론틴 캡슐 400밀리그람"과 그 생체이용률에 있어서 통계학적으로 동등하다는 것을 입증하기 위해서 식품의약품안전청이 고시한 생물학적동등성시험기준4)에 따라 건강한 성인 남자(평균연령 23.58세) 26명을 대상으로 라틴 방격법에 따라 생체내 이용률 시험을 한 후, 얻어진 가바펜틴의 혈청 중 약물농도-시간 곡선하 면적(AUCt), 최고 혈청 중 농도(Cmax)와 최고 혈청 중 농도 도달시간(Tmax)에 대하여 Tmax를 제외한 AUCt와Cmmx는 로그변환한 후 통계검정과 분산분석 (ANOVA, analysis of variance)을 통하여 생물학적동등성을 비교 판정하였다. 아울러, "가바틴 캡슐 400밀리그람과 "뉴론틴 캡슐 400밀 리그람"에 대하여 대한약전 용출시험법 제 2법(패들법)에 따라 비교 용출시험을 행하였다.
- 약물 투약은 2시기 2제품의 라틴 방격법에 따른 교차시험법으로 투약계획을 세우고 26명의 피험자를 군당 13인씩 임의로 A, B 2군으로 나누고 제 Ⅰ기 때 A군에는 대조약인 "뉴론틴 캡슐 400밀리그람"을,B군에는 시험약인 "가바틴 캡슐 400밀리그람"을 투여하였고 제 Ⅱ기 때에는 그 반대로 투여하였으며 투여량은 1캡슐(가바펜틴 400 mg)로 하였다. 한편, 가바펜틴의 최종상의 반감기는 5.
- 가바펜틴 표준품을 50% 메탄올에 녹여 농도가 1000 μg/ml가 되도록 만든 후 냉장 보관시키고, 이 용액을 냉동 보관하였던 blank 혈청을 가하여 가바펜틴의 혈청 중 농도가 각각 0, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5 및 10 μg/ml 농도가 되도록 표준혈청시료를 만들었다. 각각의 검량선용 표준혈청 50 μl에 내부표준물질(raminobutyric acid(GABA) 0.
- 건강 성인의 대조혈청과 대조혈청에 내부표준물질인 GABA와 가바펜틴을 함께 가한 것 및 가바펜틴 캡슐 투여 후 1.5시간째의 혈청을 본 시험방법에 따라 HPLC로 분석하여 얻은 크로마토그램을 Fig. 1에 나타내었다. 가바펜틴 피이크의 출현 시간은 약 15.
- 물과 함께 복용시켰다. 다음 각 피험자로부터 투약직전, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 6, 8, 12 및 24시간째(총 12시점)에 약 5ml의 혈액을 채취하여 혈구분리용 원심분리관에 넣고 3,000rpm 에서 20분간 원심분리한 후 즉시 혈청분리관을 사용하여 혈청을 채취하고 분석시까지 영하 80℃에서 보관하였다.
- 상층에서 50 μl를 취하여 HPIC에 주입시켰다. 여기에서 얻은 내부표준물질의 피이크 면적에 대한 가바펜틴의 피이크 면적비를 가지고 검량선을 작성하였으며 하루에 실험을 5번 시행하여 일내 재현성을 구하고 연속하여 5일간 실험을 행하여 일간 재현성을 구하였다.
- 용출액은 용출시험 조건에 따라 pH 1.2, 4.0, 6.8 및 물의 용출액을 각각 900 mZ씩 사용하여 용출시험하였다.
- 05 에서 분산분석을 실시하여 순서효과(sequence effect)를 검증한 후, 각 변동요인간의 유의성 여부를 검토하였고 90% 신뢰 한계를 구하였다. 이 때, Cmax와 Tmax는 실즉치를 사용하였으며 AUCt 는 사다리꼴 면적계산 공식을 이용하여 최종 채혈시점까지의 값을 통상의 방법에 따라 구해 사용하였다. "뉴론틴 캡슐 400밀리그람"에 대한 "가바틴 캡슐 400밀리그람"의 생물학적동등성 여부는 식품의약품안전청이 고시한 생물학적동등성시험기준4)에 따라 AUCt, Cmax 및 Tmax 등을 평가하였다.
- 50세이었다. 이들로부터 동의서를 받은 후 생물학적동등성시험을 실시하였다.
- 것인지를 추정하고자 하였다. 즉, 동일성분을 동일량 함유하는 제제라 하더라도 원료, 부형제 및 제조공정 등에 따라 약물흡수의 전제조건이 되는 용출률이 다르게 나타날 수 있으므로 대조약과 시험약의 용출률을 비교하기 위하여 비교 용출시험을 행하였다.
- 피험자들 모두에게 heparin-locked catheter를 팔 또는 손등의 정맥부위에 설치하고 대조약 또는 시험약 각각 1캡슐씩을 240 ml의 물과 함께 복용시켰다. 다음 각 피험자로부터 투약직전, 1, 1.
- 한편, 혈청 시료의 분석은 먼저 피험자로부터 각 시간별로 채취하여 -80℃에 보관했던 혈청 시료를 실온에 방치하여 녹인 후 3초간 진탕한 다음 이 혈청 50 μl에 내부표순물질로 GABA 수용액(0.5μg/ml) 50 μl를 가한 후 상기 검량선 작성 방법과 동일한방법으로 전처리한 후 HPLC에 주입하여 얻어진 크로마토그램으로부터 내부표준물질의 피이크 면적에 대한 가바펜틴의 피이크 면적비를 구하여 미리 작성된 검량선에 의해 혈청 시료 중 가바펜틴의 농도를 산출하였다.
- 혈청 중 가바펜틴 정량은 이미 보고된 가바펜틴 HPLC 분석법6-8)을 다소 수정하여 당 연구실에서 검증하여 보고한 분석법9)에 따라 상기 기기 조건하에서 이동상으로는 20 mM potassium phosphate# 함유한 water: acetonitrile: methanol=50:40:10 (v/v/v) 혼합용액을 사용하였고, 유속 1.2 ml/min, 주입량 50 μl 및 형광검출기를 이용하여 정량하였으며 다음과 같이 검량선을 작성하였다.
대상 데이터
- 시험에 사용된 시험약은 의약품임상시험관리기준5) 제36조 및 제 37조의 규정에 따라 제조한 고려제약 주식회사의 "가바틴 캡슐 400밀리그람"(제조번호: D1, 사용기한: 2006. 6. 19), 대조약은 식품의약품안전청으로부터 허가를 받아 한국화이자제약 주식회사에서 시판하고 있는 "뉴론틴 캡슐 400밀리그람"(제조번호 1612-2104, 사용기한: 2005. 4. 14)으로 가바펜틴을 400 mg 함유하는 캡슐제이다.
- 모집하였다. 39명의 지원자가 이 시험에 대한 설명회에 참석하였다. 이들 중 전남대학교병원(광주)에서 전문의사의 건강진단을 실시하여 건강인으로 판정된 자 26인을 선정하였다.
- 가바펜틴 표준품은 고려제약 주식회사로부터 제공받았으며 , 내부표준물질로 사용한 GABA(Sigma Chemical Co., St Louis, MO, 미국), HPLC용 메탄올(Fisher Sdentific., Fair Lawn, NJ, 미국), 생리식염수 및 헤파린(이상 중외제약, 한국)은 시판품을, 증류수는 Milli Q(Millipore Co., Milford, MA, 미국)에서 18MΩ-cm로통과시킨 것을 사용하였다. 인산일수소칼륨, 인산이수소 칼륨 및 기타 시약들은 특급 및 1급 시약들을 사용하였다.
- 비교용출시험용 기기로는 용출시험기(DST-810, 화인기계, 한국) 및 액체크로마토그래피 (7000series, Hitachi, 일본)를 사용하였으며, 혈중 약물농도 분석기 기로는 Shimadzu LC lOADvp system(Shimadzu, Tbkyo, 일본), Luna C18(2) 컬럼 (particle size 5 μm, 4.6×250 mm I.D., Phenomenex, CA, 미국)과 security C18 guard cartridge(4.0×3.0 mm I.D., Phenomenex, CA, 미국), 형광검출기 (Em. 330 nm, Ex. 440 nm, Shimadzu, Tbkyo, 일본), 원심분리기 (UNION 55R, Hanil Sdence Indestrial Co., 인천, 한국), pH 측정기 (Model 7, Coming Ltd., Halstead Essex Efland, 영국) 및 탁상용 혼합기 (G560, Sdentific Co., Bohemia, NY, 미국)를 사용하였다.
- 39명의 지원자가 이 시험에 대한 설명회에 참석하였다. 이들 중 전남대학교병원(광주)에서 전문의사의 건강진단을 실시하여 건강인으로 판정된 자 26인을 선정하였다. 피험자로 선정된 사람들의 평균 체중은 66.
- 피험자는 식품의약품안전청이 고시한 생물학적동등성시험기준4)에 근거하여 만 19~55세의 건강한 성인 남성 지원자를 공고를 통하여 모집하였다. 39명의 지원자가 이 시험에 대한 설명회에 참석하였다.
데이터처리
- "뉴론틴 캡슐 400밀리그람" 및 "가바틴 캡슐 400밀리그람"을 각각 1캡슐씩 26명의 지원자에게 라틴 방격법에 따른 교차 시험법에 따라 경구 투여하여 얻은 각 제품의 혈청 중 약물농도-시간 곡선으로부터 약물속도론적 파라미터인 AUG, 및 Tmx 를 구하였으며, 이들 두 제품에서 각각 얻은 값에 대해 Tmax를 제외한 AUCt와 Cmax의 로그변환치를 생물학적동등성시험 통계처리용 프로그램인 Equiv Test10)를 이용하여 유의수준 a=0.05 에서 분산분석을 실시하여 순서효과(sequence effect)를 검증한 후, 각 변동요인간의 유의성 여부를 검토하였고 90% 신뢰 한계를 구하였다. 이 때, Cmax와 Tmax는 실즉치를 사용하였으며 AUCt 는 사다리꼴 면적계산 공식을 이용하여 최종 채혈시점까지의 값을 통상의 방법에 따라 구해 사용하였다.
이론/모형
- 58세) 26명을 대상으로 라틴 방격법에 따라 생체내 이용률 시험을 한 후, 얻어진 가바펜틴의 혈청 중 약물농도-시간 곡선하 면적(AUCt), 최고 혈청 중 농도(Cmax)와 최고 혈청 중 농도 도달시간(Tmax)에 대하여 Tmax를 제외한 AUCt와Cmmx는 로그변환한 후 통계검정과 분산분석 (ANOVA, analysis of variance)을 통하여 생물학적동등성을 비교 판정하였다. 아울러, "가바틴 캡슐 400밀리그람과 "뉴론틴 캡슐 400밀 리그람"에 대하여 대한약전 용출시험법 제 2법(패들법)에 따라 비교 용출시험을 행하였다. 그리고 본 시험은 식품의약품안전청으로부터 시험계획서의 승인을 얻은 후 시험계획서에 따라 수행되었으며 모든 피험자의 동의를 받아서 이루어졌다.
- 58세) 26명을 대상으로 2기 2제 라틴 방격법에 따라 시험하여 얻은 가바펜틴의 Tmax와 로그변환한 AUCt 및Cmax에 대하여 통계검정과 분산분석을 행하였다. 또한 대한약전 제 8개정 용출시험법 중 제 2법(패들법)에 따라 비교 용출시험을 행하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
성능/효과
- 1. 대조악인 "뉴론틴 캡슐 400밀리그람"과 시험약인 "가바틴 캡슐 400밀리그람"에 대하여 대한약전 Ⅷ에 수재된 제 2법(패들법)에 따라 용출시험한 결과 pH 1.2, 4.0, 6.8 및 물에서 모두 10분 이내에 85% 이상 용출되었다.
- 2. 대조약인 "뉴론틴 캡슐 400밀리그람"의 평균 AUCt(μg·hr/ml)는 22.60±7.74, 시험악인 "가바틴 캡슐 400밀리그람"은 23.06 ±7.40으로 대조약에 대한 평균치 차가 2.04%이었고, Cmax(μg/ml)는 2.72±0.91과 2.62±0.75로 368%의 차이를 보였으며 Tmax(hr)는 2.62 ±1.27과 3.06±1.37으로 16.79%의 차이를 나타내 대조약에 대한 시험약의 평균치 차이는 대조약의 ±20% 이내이어야 한다는 생물학적동등성 평가를 위한 전제 조건을 만족하였다.
- 3. "뉴론틴 캡슐 400밀리그람"에 대한 "가바틴 캡슐 400밀리그람"의 분산분석 결과, 로그변환한 AUCt 및 Cmax에 대해 유의수준 α=0.05에서 군간 순서효과는 나타나지 않았으며, 90% 신뢰 한계는 각각 log(0.91)~log(1.16) 및 log(0.87)~log(l.ll)로 나타나 log(0.8)~log(1.25) 이어야 하는 생물학적동등성시험기준을 만족하였다. 한편, 참고값인 Tmax(hr)에 대한 90% 신뢰한계(δ, %)는 -4.
- 2에 나타내었으며, 혈청 중 약물농도시간 곡선으로부터 산출한 약물속도론적 파라미터 (AUCt, Cmax 및 Tmax)를 Table Ⅱ에 나타내었다. 대조약인 "뉴론틴 캡슐 400밀리그람"의 평균 AUCt(μg·hr/ml)는 22.60±7.74, 시험약인 "가바틴 캡슐 400밀리그람"은 23.06±7.40으로 대조약에 대한 평균치 차가 2.04%이었고, Cmax(μg/ml)는 2.72±0.91과 2.62±0.75 로 -3.68%의 차이를 보였으며 Tmax(hr)는 2.62±1.27과 3.06± 1.37으로 16.79%의 차이를 나타내 대조약에 대한 시험약의 평균치 차이는 대조약의 ±20% 이내이어야 한다는 생물학적동등성평가를 위한 전제 조건을 만족하였으므로 이하 분산분석을 행하였다.
- 이상의 시험결과를 종합해 보면 시험약인 "가바틴 캡슐 400밀리그람"은 대조약인 "뉴론틴 캡슐 400밀리그람"에 대하여 생물학적 동등성시험의 판단기준인 2항목(AUCt 및 Cmax)에서 모두 동등한 것으로 나타나 두 제제는 생물학적으로 동등하다고 사료되었다.
- 대조약과 시험약에 대하여 대한약전에 수재된 패들법에 따라 용출시험한 결과 pH 1.2, 4.0, 6.8 및 물에서 모두 10분 이내에 85% 이상 용출되어, 두 제제간의 용출은 차이가 없는 것으로 판단하였을 뿐만 아니라 가바펜틴 제제는 용출이 약물의 흡수에는 영향을 미치지 않을 것으로 판단하였다.
- 1~10 μg/ml 범위에서 양호한 직선성을 나타내었다. 또한, 이 농도범위에 있어서 가바펜틴의 일내 및 일간 변동계수(C.V)는 모두 15% 이내로 나타났고 0.1, 0.2, 1 및 50 μg/ml의 농도에서 5회 반복 측정하여 얻은 표준편차(%, deviation)도 모두 15% 이내로 나타났다(Table Ⅰ). 이로부터 혈청 중 가바펜틴에 대한 상기 HPLC 분석법은 인체에 대한 생체이용률 시험에 이용될 수 있는 적합한 정밀성 및 정확성을 갖고 있음을 알 수 있었다.
- 먼저 유의수준 α가 0.05일 때 Tmax와 로그변환한 AUCt 및 Cmax값에 대한 F비(FG)가 F분석표의 한계값인 F(L24)= 4.260 보다 모두 작게 나타나 교차시험이 제대로 이루어졌음을 확인할 수 있었다.
- 2, 1 및 50 μg/ml의 농도에서 5회 반복 측정하여 얻은 표준편차(%, deviation)도 모두 15% 이내로 나타났다(Table Ⅰ). 이로부터 혈청 중 가바펜틴에 대한 상기 HPLC 분석법은 인체에 대한 생체이용률 시험에 이용될 수 있는 적합한 정밀성 및 정확성을 갖고 있음을 알 수 있었다.
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