This research is performed to obtain positive evidences of Mori cortex, a kind of oriental medicinal herbs, in the cellular levels. The extracts of M. cortex have shown anti-inflammatory effects against cutaneous inflammation and clinical effects on pulmonary asthma and congestion in oriental medici...
This research is performed to obtain positive evidences of Mori cortex, a kind of oriental medicinal herbs, in the cellular levels. The extracts of M. cortex have shown anti-inflammatory effects against cutaneous inflammation and clinical effects on pulmonary asthma and congestion in oriental medicine. Thus BV2 cells were chosen because microglia are considered as the main immunocompetent cells in the central nervous system. Lipopolysaccharide (LPS)-induced microglial activation of cultured BV2 cells and subsequent release of nitric oxide (NO) and Prostaglandin E2 (PGE2) were effectively suppressed by methylene chloride extract of Morus alba L. (MEMA). From the inflammation-mediated mRNA and protein analyses, we showed that inducible NO synthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2), interleukin-$1{\beta}$ (IL-$1{\beta}$) and tumor necrosis alpha (TNF-${\alpha}$) induced by LPS were markedly decreased by MEMA treatment. From the observation of nuclear factor-kB (NF-${\kappa}B$) which is controlling and mediating inflammation through COX-2 and iNOS, there showed that p65, a subunit of NF-${\kappa}B$, was increased in nuclear and $I{\kappa}B$, a competitor of NF-${\kappa}B$, was recovered in cytosol after MEMA treatment. These are corresponding with results of iNOS, COX-2, IL-$1{\kappa}$ and TNF-${\alpha}$, and confirm some suppressive effect against transcriptional activation of NF-${\kappa}B$. In conclusion, the anti-inflammatory action of M. cortex against BV2 microglia cells is expected to protect nerve tissues through suppression of neuronal inflammation in various neurodegenerative diseases.
This research is performed to obtain positive evidences of Mori cortex, a kind of oriental medicinal herbs, in the cellular levels. The extracts of M. cortex have shown anti-inflammatory effects against cutaneous inflammation and clinical effects on pulmonary asthma and congestion in oriental medicine. Thus BV2 cells were chosen because microglia are considered as the main immunocompetent cells in the central nervous system. Lipopolysaccharide (LPS)-induced microglial activation of cultured BV2 cells and subsequent release of nitric oxide (NO) and Prostaglandin E2 (PGE2) were effectively suppressed by methylene chloride extract of Morus alba L. (MEMA). From the inflammation-mediated mRNA and protein analyses, we showed that inducible NO synthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2), interleukin-$1{\beta}$ (IL-$1{\beta}$) and tumor necrosis alpha (TNF-${\alpha}$) induced by LPS were markedly decreased by MEMA treatment. From the observation of nuclear factor-kB (NF-${\kappa}B$) which is controlling and mediating inflammation through COX-2 and iNOS, there showed that p65, a subunit of NF-${\kappa}B$, was increased in nuclear and $I{\kappa}B$, a competitor of NF-${\kappa}B$, was recovered in cytosol after MEMA treatment. These are corresponding with results of iNOS, COX-2, IL-$1{\kappa}$ and TNF-${\alpha}$, and confirm some suppressive effect against transcriptional activation of NF-${\kappa}B$. In conclusion, the anti-inflammatory action of M. cortex against BV2 microglia cells is expected to protect nerve tissues through suppression of neuronal inflammation in various neurodegenerative diseases.
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문제 정의
다음으로 중요한 염증 매개 산물인 PGE2의 증가에 상백피 추출물이 미치는 영향을 조사하였다. NO 측정과 마찬가지 조건으로 MEMA와 EEMA를 처리하여 24시간 경과 후 PGE2를 측정한 결과, LPS 처리에 의해 최대 130±9.
제안 방법
따라서 한방임상에서 항염작용이 있는 것으로 알려진 상백피의 약리작용을 이해하고 인지기능성 뇌질환에 응용할 수 있는지를 확인하기 위하여 상백피를 알콜 추출하고, LPS로 산화성 손상을 BV2세포에 처리하여 NO와 TNF-α, IL-1β, 그리고 COX-2 등의 발현양상을 관찰하였다.
그 후 모아진 세포를 TRIzol reagent (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)에 lysis 시켜 total RNA를 분리하고, 동량의 RNA에 iNOS, COX-2, glyceraldhyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), IL-1β, IL-6, TNF-α의 primer, DEPC water, ONE-STEP RT-PCR PreMix Kit (Intron, Korea)를 각각 혼합하여 Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)로 증폭시켰다.
세포 배양용 6 well plate에 BV2 세포를 6×105cells/ml로 분주하여 24시간 안정화시킨 후, MEMA (methylene chloride extract of Morus alba L.)를 농도별로 1시간 선처리 후 LPS (0.5 μg/ml)를 후처리하여 24시간 배양하였다.
세포 배양용 6 well plate에 BV2 세포를 6×105cells/ml로 분주하여 24시간 안정화시킨 후, EEMA (ethanol extract of Morus alba L.)와 MEMA (methylene chloride extract of Morus alba L.)를 농도별로 1시간 선처리 후 LPS (0.5 μg/ml)를 후처리하여 24시간 배양하였다.
세포 배양용 6 well plate에 BV2 세포를 6×10 5cells/ml로 분주하여 24시간 안정화시킨 후, EEMA (ethanol extract of Morus alba L.)와 MEMA (methylene chloride extract of Morus alba L.)를 농도별로 1시간 선처리 후 LPS (0.5 μg/ml)를 후처리하여 24시간 배양하였다.
모든 실험에서 BV2 세포는 Morus alba L. 추출물을 1시간 선 처리한 후 LPS (0.5 μg/ml)를 후처리하여 24시간 배양하였다.
)는 경북 영주약초시장에서 구입하고 동의대학교 한의과대학 본초학교실에서 표준품 확인을 받은 것으로, 흐르는 물에 수회 세척하여 그늘에서 하루동안 건조시킨 후 잘게 분쇄하였다. 상백피의 에탄올 및 메틸렌클로라이드 추출물(ethanol extract of Morus alba L., EEMA; methylene chloride extract of Morus alba L., MEMA)을 얻기 위하여 건조된 상백피 200 g에 에탄올 및 메틸렌클로라이드를 각각 1.5 l씩 첨가하여 에탄올은 100rpm, 60℃에, 메틸렌클로라이드는 100rpm, 35℃ 조건에서 5일간 교반하였다. 그 후 상층액만 분리하여 건조하고, 분말을 200 mg/ml 농도로 dimethylsulfoxide (DMSO)에 용해시켰다.
5% H3PO4) 100 μl와 혼합하여 96 well plate에 분주하였다. ELISA reader에 흡광도 540 nm로 NO 함량을 측정한 후, sodium nitrite (NaNO2)의 standard curve를 바탕으로 NO 농도를 계산하였다.
, Carlsbad, CA, USA)에 lysis 시켜 total RNA를 분리하고, 동량의 RNA에 iNOS, COX-2, glyceraldhyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), IL-1β, IL-6, TNF-α의 primer, DEPC water, ONE-STEP RT-PCR PreMix Kit (Intron, Korea)를 각각 혼합하여 Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)로 증폭시켰다. 그 후 ethidium bromide (EtBr)이 포함된 1% agarose gel에 각 sample을 loading하여 100V에서 전기영동시킨 후 UV 하에서 mRNA 발현량을 관찰하였다.
세포 배양용 100 mm dish에 BV2 세포를 2.5×106cells/ml로 분주하여 상기한 방식대로 배양한 후 세포들을 모아서 lysis buffer[25 mM Tris-Cl (pH7.5), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM phenymethylsulfonyl fluoride (PMSF), 5 mM dithiothreitol (DTT)]에 1시간 가량 lysis시킨 후 Bio-rad 단백질 정량 시약과 그 사용방법을 따라 정량하였다.
상백피 추출물이 LPS로 유도된 NO의 증가에 미치는 영향을 조사하기 위하여 MEMA와 EEMA를 각각 단독 처리(75 μg/ml)하거나 1시간 선처리한 후 LPS(0.5 μg/ml)를 처리하여 Griess assay를 통해 NO 생성량을 측정하였다.
Cayman chemicals (Ann Arbor, MI, USA)에서 구입한 EIA kit를 통해 PGE2 생성량을 측정하였다. 세포 배양용 6 well plate에 BV2 세포를 5×105cells/ml로 분주하여 24시간 안정화시킨 후, MEMA (methylene chloride extract of Morus alba L.
5 μg/ml)를 후처리하여 24시간 배양하였다. 그 후 각 well에서 세포배양액을 취하여 EIA kit에 제시된 방법에 따라 처리한 다음 ELISA reader에 흡광도 420 nm로 PGE2의 생성량을 측정하였다.
상백피 추출물이 BV2 세포에 독성을 나타내지 않는 조건에서 항염증효과를 조사하기 위해 상백피 메틸렌클로라이드 추출물(MEMA)과 에탄올 추출물(EEMA)을 각각 단독 처리한 군과 1시간 선처리한 후 LPS를 처리한 군에서 MTT assay를 시행하여 BV2 세포의 생존율을 측정하였다. 그 결과 Fig.
다음으로 iNOS, COX-2 등 세포 증식 유전자의 발현을 조절하여 염증반응을 매개하는 전사인자 NF-κB의 활성을 조사하였다.
3). 이러한 PGE2 생성 억제효과는 NO 생성 억제효과와 마찬가지로 EEMA 처리군보다 MEMA 처리군에서 현저하였으며, 따라서 상대적으로 효과가 좋은 MEMA를 선택하여 이후의 실험을 진행하였다.
MEMA의 BV2 세포에 대한 NO 및 PGE2 생성 억제 효과가 이들을 만들어내는 유전자의 mRNA 및 단백질 변화와 관련있는 지 알아보기 위하여 Fig. 4에서는 각각 NO와 PGE2를 생산하는 iNOS와 COX-2 유전자의 변화를 RT-PCR과 웨스턴블롯을 통해 관찰하였다. 그 결과 iNOS와 COX-2 유전자의 mRNA 및 단백질 발현이 LPS에 의해 증가하였으나 MEMA를 처리하자 농도의존적으로 현저히 감소하였다.
대상 데이터
세포 배양에 사용된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), fatal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycin은 모두 Gibco (Grand Island, NY)에서 구입하였다.
본 실험에 사용된 상백피(Morus alba L.)는 경북 영주약초시장에서 구입하고 동의대학교 한의과대학 본초학교실에서 표준품 확인을 받은 것으로, 흐르는 물에 수회 세척하여 그늘에서 하루동안 건조시킨 후 잘게 분쇄하였다. 상백피의 에탄올 및 메틸렌클로라이드 추출물(ethanol extract of Morus alba L.
세포 배양에 사용된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), fatal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycin은 모두 Gibco (Grand Island, NY)에서 구입하였다. mRNA 분석을 위한 primer (Bioneer, Taejeon, Korea)는 Table 1에 나타내었고, 단백질 분석을 위한 모든 1차 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였으며, anti-rabbit 및 anti-mouse 2차 항체는 Amersham Life Science Corp. (Arlington Heights, IL, USA)에서 구입하였다. 별도 표기하지 않은 모든 시약은 Sigma (St.
(Arlington Heights, IL, USA)에서 구입하였다. 별도 표기하지 않은 모든 시약은 Sigma (St. Louis, MO)에서 구입하였다.
실험에 사용된 BV2 세포는 울산대학교 의과대학 생화학교실 (서울 아산병원)로부터 제공받았으며, 10% fatal bovine serum (FBS)에 1% penicillin-streptomycin이 포함된 DMEM 배지를 사용하여 37℃ 및 5% CO2 조건에서 배양하였다. 모든 실험에서 BV2 세포는 Morus alba L.
이론/모형
MTT Assay를 통해 세포생존율을 측정하였다. 세포 배양용 6 well plate에 BV2 세포를 6×10 5cells/ml로 분주하여 24시간 안정화시킨 후, EEMA (ethanol extract of Morus alba L.
Griess Assay를 통해 NO 생성량을 측정하였다. 세포 배양용 6 well plate에 BV2 세포를 6×105cells/ml로 분주하여 24시간 안정화시킨 후, EEMA (ethanol extract of Morus alba L.
5 μg/ml) for 24 h. The rates of cell viability were measured by MTT assay. The data shown are means±SD of three independent experiments.
성능/효과
그 결과 Fig. 2에 나타난 바와 같이 LPS 처리 후 최대 15.27±1.18 μM까지 증가했던 NO 생성량이 MEMA와 EEMA 처리에 의해 농도의존적으로 각각 유의하게 감소하여 최고농도인 75 μg/ml에서 MEMA 처리군은 5.07±0.25 μM, EEMA 처리군은 6.7±0.35 μM까지 NO 생성량을 감소시켰다.
따라서 BV2 세포의 생존율에 큰 영향을 미치지 않는 조건인 75 μg/ml을 최종농도로 하여 MEMA와 EEMA를 농도별로 1시간 선처리한 후, 역시 세포독성을 나타내지 않는 농도의 LPS(0.5 μg/ml)를 후처리하여 24시간 경과 후에 생존율을 측정한 결과 Fig. 1B에서 나타난 바와 같이 MEMA 처리군과 EEMA 처리군 모두 생존율이 90% 이상으로서 BV2 세포에 대한 독성을 나타내지 않았다.
그 결과 Fig. 1A에 나타난 바와 같이 MEMA와 EEMA 단독 처리 시 75 μg/ml 처리군까지는 BV2 세포가 90% 이상 생존하였으나, MEMA 100 μg/ml 처리군에서는 생존율 76%로 세포독성을 나타내었다.
NO 측정과 마찬가지 조건으로 MEMA와 EEMA를 처리하여 24시간 경과 후 PGE2를 측정한 결과, LPS 처리에 의해 최대 130±9.8 pg/ml까지 증가했던 PGE2 생성량이 MEMA(75 μg/ml)에 의해 60.5±4.94 pg/ml, EEMA(75 μg/ml)에 의해 104.3±5.02 pg/ml까지 각각 감소하였다(Fig. 3).
세포질에서 NF-κB와 결합하여 NF-κB를 불활성화시키는 IκB도 LPS에 의해 분해되었다가 MEMA 처리 시 다시 회복되는 경향을 보였다.
Fig. 5에서 나타난 바와 같이 세포질과 핵을 분리하여 관찰한 결과, LPS(0.5 μg/ml) 처리 15분부터 30분까지 핵 내에 NF-κB의 subunit인 p65가 증가하였으나, MEMA(75 μg/ml) 처리에 의해 억제되었으며, 세포질에서는 이와 반대로 LPS 처리로 감소했던 p65가 MEMA에 의해 다시 증가되는 것을 관찰하였다.
한 가지 특이할 사항으로 이들 유전자의 mRNA 발현이 MEMA(75 μg/ml) 단독 처리 시 다소 증가하는 경향을 보였는데, 이는 MEMA(75 μg/ml) 선처리에 의해 염증 매개 유전자의 발현이 다소간 증가하고, 그 결과 세포의 음성적 피드백을 일으켜 LPS를 처리했을 시 이들 유전자의 발현을 효과적으로 억제한 것으로 보인다.
다음으로 microglia가 활성화되어 분비하는 대표적 전구염증 cytokine인 IL-1β와 TNF-α의 mRNA 변화를 관찰한 결과, 마찬가지로 LPS 처리에 의해 증가된 발현이 MEMA에 의해 감소되는 것을 관찰하였다.
4에서는 각각 NO와 PGE2를 생산하는 iNOS와 COX-2 유전자의 변화를 RT-PCR과 웨스턴블롯을 통해 관찰하였다. 그 결과 iNOS와 COX-2 유전자의 mRNA 및 단백질 발현이 LPS에 의해 증가하였으나 MEMA를 처리하자 농도의존적으로 현저히 감소하였다. 다음으로 microglia가 활성화되어 분비하는 대표적 전구염증 cytokine인 IL-1β와 TNF-α의 mRNA 변화를 관찰한 결과, 마찬가지로 LPS 처리에 의해 증가된 발현이 MEMA에 의해 감소되는 것을 관찰하였다.
다음으로 microglia가 활성화되어 분비하는 대표적 전구염증 cytokine인 IL-1β와 TNF-α의 mRNA 변화를 관찰한 결과, 마찬가지로 LPS 처리에 의해 증가된 발현이 MEMA에 의해 감소되는 것을 관찰하였다. 이 결과는 MEMA가 염증 매개 유전자들을 조절하여 염증 산물을 억제한 것임을 보여준다. 한 가지 특이할 사항으로 이들 유전자의 mRNA 발현이 MEMA(75 μg/ml) 단독 처리 시 다소 증가하는 경향을 보였는데, 이는 MEMA(75 μg/ml) 선처리에 의해 염증 매개 유전자의 발현이 다소간 증가하고, 그 결과 세포의 음성적 피드백을 일으켜 LPS를 처리했을 시 이들 유전자의 발현을 효과적으로 억제한 것으로 보인다.
또한 NO와 PGE2의 생성과 관련된 단백질 및 mRNA의 발현 追試로부터 iNOS와 COX-2가 MEMA에 의해 농도 의존적으로 현저히 감소되었으며, 염증매개물질(cytokine)인 IL-1β와 TNF-α의 mRNA도 전사수준에서 마찬가지로 감소되었음을 알 수 있었고, 이러한 억제기전은 NF-κB p65 핵내 전위(nuclear translocation) 감소와 관련되어 있는 것으로 나타났다.
백피 추출물이 BV2 세포에 대해 독성을 나타내지 않는 농도인 75 μg/ml에서 LPS(0.5 μg/ml)에 의하여 유도된 NO와 PGE2의 생성 증가를 억제하였으며, 특히 ethanol 추출물보다 methylene chloride 추출물에서 더 현저한 효과가 있었다.
RT-PCR 및 western blot에서 NO와 PGE2의 핵심효소인 iNOS와 COX-2가 함께 농도의존적으로 현저히 억제된 것은 염증과 암의 예방에 효과적인 것을 나타내며, IL-1β와 TNF-α의 mRNA가 농도의존적으로 감소한 것 또한 전신성 및 뇌내 염증과정에 유효할 것으로 추정되는 결과이다.
PGE2(Prostaglandin E2)는 eicosanoid family의 하나로서 혈관 투과성을 증가시키고 cellular recruitment를 일으켜 염증을 매개하며31) 뇌손상과 염증은 eicosanoids를 생산하는 효소들의 발현을 증가시킨다32). 따라서 본 실험에서 독성이 없는 MEMA가 NO뿐만 아니라 PGE2까지 억제한 것은 일차적으로 뇌내 염증과정에 있어서 광범위한 개선작용이 있음을 추정할 수 있다.
본 실험에서 세포질과 핵을 분리하여 관찰한 결과, LPS(0.5 μg/ml) 처리 후 핵 내에 NF-κB의 subunit인 p65가 증가하였으나, MEMA(75 μg/ml) 처리에 의해 억제되었으며, 세포질에서는 이와 반대로 LPS 처리로 감소했던 p65가 MEMA에 의해 다시 증가되었다.
본 연구의 결과는 상백피 추출물이 NF-κB의 활성을 차단함으로써 염증 매개 유전자 및 그 산물을 저해함을 보여주었으며, 이는 상백피가 강력한 항염증 효능을 가지고 있음을 의미한다.
후속연구
본 연구의 결과는 상백피 추출물이 NF-κB의 활성을 차단함으로써 염증 매개 유전자 및 그 산물을 저해함을 보여주었으며, 이는 상백피가 강력한 항염증 효능을 가지고 있음을 의미한다. 따라서 상백피 추출물의 microglia에 대한 항염증효과는 퇴행성 뇌질환의 중요한 원인이 되는 만성적인 신경계 염증을 억제함으로써 신경퇴행성 질환 등 다양한 신경계 질환에서 신경보호역할을 할 것으로 기대된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
상백피의 효능은 무엇인가?
퇴행성 뇌질환의 원인으로 만성적인 염증과 산화성 손상이 제시되고 있으며20) 이에 근거하여 상백피에 주목하였다. 桑白皮는 瀉肺平喘과 利水消腫하는 효능을 가지고 있어 국내에서 항산화작용21)과 항염증작용22,23) 및 천식24)이나 폐손상25)에 관한 연구들이 있었고, 최근에는 신경세포 보호에 관한 연구26)도 보고되었다. 이들 대부분은 물추출물을 사용하였는데 예컨대 안27)은 桑白皮 熱水추출물은 LPS 또는 INF-ϒ로 유도된 NO와 TNF 생성을 억제시켰으나 IL-1 억제는 미약하다고 하였고, 김16), 김현정은 N18-RE-105 세포모델에서 상백피 methanol 추출물의 hexane층 10 μg/ml 농도에서 71.
상백피란 무엇인가?
상백피는 뽕나무과(Moraceae)에 속한 다년생 식물인 뽕나무(Morus alba L.) 및 동속 근연식물의 根皮를 건조한 것1)으로 조2)와 유3) 등에 의해 피부병변에서의 항염효과에 대한 임상보고가 제시된 바 있다. 뽕나무는 우리나라를 비롯한 아시아뿐만 아니라 유럽, 미국, 아프리카 등에도 광범하게 분포하며4) 藥用 외에도 양잠산업과도 관련이 깊다.
뽕나무는 어느나라에 분포하여 있나?
) 및 동속 근연식물의 根皮를 건조한 것1)으로 조2)와 유3) 등에 의해 피부병변에서의 항염효과에 대한 임상보고가 제시된 바 있다. 뽕나무는 우리나라를 비롯한 아시아뿐만 아니라 유럽, 미국, 아프리카 등에도 광범하게 분포하며4) 藥用 외에도 양잠산업과도 관련이 깊다. <東醫寶鑑>에서도 本草書를 인용하여 “治肺氣 喘滿 水氣 浮腫 消痰 止渴 去肺中水氣 利水道 治咳嗽 唾血 利大小腸 殺腹藏虫 又可縫金瘡(本草)”5)라 하였는데 이는 의료용 縫合絲로 사용되었음을 말한다.
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