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문제 정의
- 본 연구는 율피를 이용한 항비만 소재 및 비만치료제 개발을 위한 선행연구로써 3T3-L1 지방전구세포에 율피 추출물을 처리한 후, 세포독성 여부와 지방세포 분화 정도를 Oil red-O 염색을 통한 축적된 지방(Lipid droplet)의 함량측정과 세포학적인 변화, 세포내 triglyceride의 함량을 측정하여 율피 추출물의 지방세포 분화에 미치는 영향을 관찰하고 그 결과를 보고한다.
- 그러나 율피 혹은 율피 추출물로 부터 유래한 물질의 항비만 효과와의 연관성에 대한 연구는 없었다. 본 연구자는 율피가 예정부터 사용되어온 약재이며, 함유성분이 비만에 효과적이라는 점에서 비만억제에 효과적일 것이라는 가설을 설정하고 미만연구에 사용되는 3T3-L1 지방전구세포를 이용하여 율피 주출물의 항비만 효과에 대한 선행연구를 수행하였다.
제안 방법
- 배양 2일 후, 세포가 80% 정도 성장하였을 때, 배지를 분화유도 배지(DMEM, 10% FBS(Fetal Bovine Serum; GibcoBRL, USA), 1 μM Dexamethasone(Sigma Co. USA), 0.5 mM methylisobutylxanthine(IBMX; Sigma, USA), 5 ㎍/㎖ Insulin(Sigma, USA))로 바꿔준 뒤, 율피 추출물을 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖의 농도로 처리한 후, 37℃, 5% CO2 조건하에서 2일간 배양하였다.
- 본 실험에 사용한 율피는 시중에서 구입한 생밤을 세척하여 표피를 제거하고, 껍질 내부의 섬유질 부분을 취하여 실험의 재료로 사용하였다. 채취한 율피를 건조, 파쇄한 후, 율피 건조 분말 100 g에 증류수 300 ㎖의 비율(w/v)로 첨가하여 100℃에서 3시간 전탕 추출하였다. 그 후 추출액을 실온에서 13,000 xg로 30분간 원심분리하여 상층액을 분리한 후, 상층액은 1 ㎛ disk filter(Sartorius, Germany)를 이용하여 불순물을 제거하였다.
- 조건하에서 24시간 배양하였다. 배양 후, 배지를 모두 제거하고 혈청이 포함되지 않은 배지를 90 ㎕/well 씩 첨가하였고 시료는 10~200 ㎍/㎖의 농도가 되도록 혈청이 포함되지 않은 배지를 이용하여 희석, 농도별로 10 ㎕/well에 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 0.
- Louis MO, USA)를 넣어 세포내에 생성된 formazan을 15분간 교반하여 용출한 후, ELISA reader를 이용하여 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 각 실험은 Triplicate로 수행하였으며 이에 대한 평균값과 표준오차를 분석하여 세포독성 여부를 확인하였다.
- 5 mM methylisobutylxanthine(IBMX; Sigma, USA), 5 ㎍/㎖ Insulin(Sigma, USA))로 바꿔준 뒤, 율피 추출물을 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖의 농도로 처리한 후, 37℃, 5% CO2 조건하에서 2일간 배양하였다. 그 후, 분화유지 배지(DMEM, 10% FBS, 5 ㎍/㎖ Insulin)로 교체하고 율피 추출물을 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하였다. 그 후, 2일 간격으로 분화 유지배지와 시료를 교체하면서 9일 동안 추가적으로 배양하였다.
- 4% paraformaldehyde는 제거하고 60% isopropanol을 이용하여 3회 washing한 후, 각 well이 완전히 마를 때까지 정치하였다. 그 후, 각 well에 Oil red-O working solution(0.5% Oil Red-O in 70% Isopropanol)을 첨가하고 20분간 교반 염색하였다. Oil Red-O working solution을 제거하고 즉시 D.
- 5% Oil Red-O in 70% Isopropanol)을 첨가하고 20분간 교반 염색하였다. Oil Red-O working solution을 제거하고 즉시 D.W.를 이용하여 4회 세척한 후, 지방이 축적된 세포 사진을 촬영하였다. 그 후 염색된 중성지방의 함량을 확인하기 위하여 100% isopropanol을 가하여 10분간 교반, 중성지방에 침착한 Oil Red-O를 용출시켰다.
- 를 이용하여 4회 세척한 후, 지방이 축적된 세포 사진을 촬영하였다. 그 후 염색된 중성지방의 함량을 확인하기 위하여 100% isopropanol을 가하여 10분간 교반, 중성지방에 침착한 Oil Red-O를 용출시켰다. 용출된 용액은 1.
- 그 후 염색된 중성지방의 함량을 확인하기 위하여 100% isopropanol을 가하여 10분간 교반, 중성지방에 침착한 Oil Red-O를 용출시켰다. 용출된 용액은 1.5 ㎖ microtube에 옮겨 담고 20℃에서 10,000 x g로 원심분리한 후, 200 ㎕의 상층액을 96 well ELISA plate에 옮겨 510 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하여 지방축적 정도를 계산하였다.
- 3T3-L1 지방전구세포의 분화유도중에 생성된 triglyceride를 효소적인 방법으로 확인하였다. 분화 유도 및 유지된 세포를 PBS를 이용하여 3회 수세한 후, 200 ㎕의 M-PER mammalian cell extraction solution(Pierce, USA)를 넣어 세포를 삼투압 파쇄 방법으로 분쇄하였다.
- 3T3-L1 지방전구세포의 분화유도중에 생성된 triglyceride를 효소적인 방법으로 확인하였다. 분화 유도 및 유지된 세포를 PBS를 이용하여 3회 수세한 후, 200 ㎕의 M-PER mammalian cell extraction solution(Pierce, USA)를 넣어 세포를 삼투압 파쇄 방법으로 분쇄하였다. 분쇄한 세포용액은 1.
- 540 ㎚에서 final absorbance (FA)를 측정한다. IA와 FA를 이용하여 sample내의 glycerol, true triglyceride, total triglyceride의 농도를 산출하였다.
- 율피 추출물의 3T3-L1 preadipocyte에 대한 세포독성의 유무를 확인하기 위하여 3T3-L1세포에 율피 추출물을 각각 10, 20, 50, 100 ㎍/㎖의 농도로 처리한 후 MTT법에 의한 세포 생존률(Cell Viability Rate)을 측정하였다. 그 결과, Control의 경우는 100±9.
- 3T3-L1 지방전구세포를 성숙된 지방세포로의 분화로 유도하고 이를 Oil Red-O 염색으로 확인 하였으며, 3T3-L1 지방전구세포에서 지방세포로 분화 유도하는 과정에서 율피 추출물을 50, 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 지방세포로의 분화에 영향을 미치는지 관찰하였다.
- 3T3-L1 지방전구세포가 지방세포로 분화되는 과정은 배양액에 첨가한 혈청중의 분화유도인자인 Insulin, Dexamethason, IBMX와 같은 유도물질의 존재 하에서 지방세포로 분화하는 특징을 가지고 있고32-34), 분화시 생화학적 형태학적으로 포유류의 지방조직 성장과 유사한 것으로 알려져35) 비만에 대한 효과검증에 사용된다. 본 실험에서 3T3-L1 지방전구세포를 성숙된 지방세포로의 분화로 유도하고, 분화과정중에 생성되는 Lipid droplet을 Oil red O 염색으로 확인 하였으며, 3T3-L1 지방전구세포에서 지방세포로 분화 유도하는 과정에서 율피 추출물을 50, 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 지방세포로의 분화에 미치는 영향을 관찰하였다. 그 결과 control은 100.
- 밤나무 과실의 속껍질인 율피의 항비만 효과를 검증하기 위하여 시료를 열수 추출하고, 3T3-L1 지방전구세포에 율피 추출물을 농도별로 처리하여 세포독성 여부 및 adipogenesis 저해효과를 검증하였다. 그 결과 100 ㎍/㎖이하의 농도에서 세포독성이 확인되지 않았다.
대상 데이터
- 실험에 사용한 3T3-L1(CL-173; ATCC, USA) 지방전구세포는 American type cell collection(ATCC, USA)로부터 구입하였으며, 사용한 배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium; Cambrex Bio Science, Walkersville MD, USA) 배지에 10% BS(Bovine Serum; GibcoBRL, USA)과 1%의 Penicillin(100 U/ml)/Streptomycin(100 ㎍/㎖)을 첨가한 후, 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양, 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 율피는 시중에서 구입한 생밤을 세척하여 표피를 제거하고, 껍질 내부의 섬유질 부분을 취하여 실험의 재료로 사용하였다. 채취한 율피를 건조, 파쇄한 후, 율피 건조 분말 100 g에 증류수 300 ㎖의 비율(w/v)로 첨가하여 100℃에서 3시간 전탕 추출하였다.
- 시간 경과 후, 4℃에서 10,000 x g로 원심분리하여 상청액을 실험에 사용하였다. Glycerol standard (Sigma, USA)을 이용하여 농도별로 희석한 후(39.0625 ~ 2500 ㎍/㎖), 대조군으로 사용하였다. 96 well ELISA plate에 160 ㎕의 Free glycerol reagent를 넣고 5 ㎕의 water (Blank), glycerol standard, sample을 각각의 well에 넣었다.
- 성숙한 지방세포내에 존재하는 순수한 triglyceride 함량를 측정하기 위하여 효소법을 이용한 kit를 사용하였다. 양성대조군으로 isopreterenol을 사용하였다. 그 결과 control은 196.
데이터처리
- 통계분석은 Prism 5 통계 프로그램을 사용하여 평균과 표준편차로 나타내었고, 유의수준은 p<0.05로 하였다.
- 05로 하였다. 각 실험군간의 통계분석은 one way ANOVA로 처리하고 사후검정은 Turkey`s test로 하였다.
이론/모형
- 율피 추출물이 3T3-L1 세포의 분화를 억제하는지 여부를 확인하기 위하여 지방전구세포 분화에서 형성되는 중성지방을 특이적으로 염색시키는 Oil red-O 염색법을 이용하였다. 먼저 배양 중인 세포에서 배지를 제거하고, 3% paraformaldehyde를 1 ㎖/well씩 넣어 5분간 실온에서 세포를 고정하였다.
- 성숙한 지방세포내에 존재하는 순수한 triglyceride 함량를 측정하기 위하여 효소법을 이용한 kit를 사용하였다. 양성대조군으로 isopreterenol을 사용하였다.
성능/효과
- 그 결과 control은 100.0±4.04 %, caffeine 5 mM은 98.35±5.00%, 율피 추출물 50 ㎍/㎖은 76.78±1 .37%, 율피 추출물 100 ㎍/㎖은 53.86±6.50%등으로 나타나 50 ㎍/㎖에서 23.22%, 100 ㎍/㎖에서 46.14%의 억제가 유의하게 나타났다(Fig. 2).
- 그 결과 control은 100.0±4.04%, caffeine 5 mM은 98.35±5.00%, 율피 추출물 50 ㎍/㎖은 76.78±1 .37%, 율피 추출물 100 ㎍/㎖은 53.86±6.50%등으로 나타나 50 ㎍/㎖에서 23.22%, 100 ㎍/㎖에서 46.14%의 억제가 유의하게 나타났다(Fig. 2).
- 그 결과, Control의 경우는 100±9.60%, 율피 추출물 10 ㎍/㎖은 101.1±2.0%, 20 ㎍/㎖은 99.96±9.95%, 50 ㎍/㎖은 98.63±7.34%, 100 ㎍/㎖은 95.21±1.49%를 나타내어 실험에 사용할 농도에서는 세포독성이 없음을 확인하였다(Fig. 1)
- 세포내 지방 축적을 현미경으로 관찰한 결과 대부분 세포에서 분화가 일어나 lipid droplet을 형성하였으며, 양성대조군인 isopreterenol을 이용하여 검증한 결과 세포내에서 존재하는 lipid droplet이 대조군에 비하여 형태가 세밀하게 형성되어 lipid accumulation이 감소한 것을 현미경상에서 확인하였으며 시료 처리군에서도 동일하게 관찰되었다(Fig. 3)
- 그 결과 control은 196.8±3 .70㎍/well, isopreterenol은 123.9±2 .28 ㎍/well, 율피 추출액은 172.8±18.80 ㎍/well을 나타내어 감소하였으나 통계학적인 유의성은 없었다(Fig. 4).
- 본 실험에서 성숙한 지방세포내에 존재하는 순수한 triglyceride 함량을 효소법으로 측정한 결과 control은 196.8±33.70 ㎍/well, 양성대조군인 isopreterenol은 123.9±2 .28 ㎍/well, 시험군인 율피 추출액 100 ㎍/㎖ 처리군은 172.8±18.80 ㎍/well을 나타내어, control에 비하여 15%정도의 감소를 나타내었으나 양성대조군과 비교할 때 통계적 유의성은 없었다(Fig. 4).
- 율피 추출물의 세포독성여부를 판단하기 위하여 실험대상인 지방전구세포를 이용하여, MTT법으로 측정한 결과 control의 경우는 100±9.60%, 율피 추출물 10 ㎍/㎖은 101.1±2.0%, 20 ㎍/㎖은 99.96±9.95%, 50 ㎍/㎖은 98.63±7.34%, 100 ㎍/㎖은 95.21±1.49%를 나타내어 처리한 농도에서 세포독성은 확인되지 않았다(Fig. 1).
- 또한, 세포내 지방 축적을 현미경으로 관찰한 결과 lipid droplet을 형성하였으며, 대조군에 비하여 잘게 쪼개진 형태로 세포분화가 일어났고, lipid accumulation이 감소한 것으로 확인하였다(Fig. 3).
- 그 결과 100 ㎍/㎖이하의 농도에서 세포독성이 확인되지 않았다. Oil Red-O 염색을 통한 세포내 Lipid accumulation은 control에 비하여 50 ㎍/㎖에서 23.22%, 100 ㎍/㎖에서 46.24% 정도 저해가 통계적으로 유의하게 확인하였으며 지방세포로 분화유도 후 Triglyceride의 세포내 침착은 control에 비하여 15% 감소하였으나 통계적으로 유의하지는 않았다. 이상의 결과로 율피 추출물은 처리한 농도에서 세포독성 없이 지방세포로의 분화를 억제(Inhibition of adipogenesis)하는 것으로 확인되었으며, 향후, 분자생물학적, 생화학적인 표식인자의 검증 및 대사 경로에 대한 연구와 동물실험과 같은 지속적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
후속연구
- . 지방세포의 증식과 지방세포에서 분비되는 물질들에 대한 이해와 그 생체 내 조절기전에 대한 규명이 비만 및 그로 인한 여러 질병을 이해하고 효과적인 치료제를 개발할 수 있는 근거가 되므로, 지방세포 조절에 대한 연구가 필요하다.
- 율피 내에는 coumarin, gallic acid, cathechin등이 다량으로 함유되어 있으며 천연 항산화제로 사용할 수 있음을 제안하고 있다21). 특히 gallic aicd와 cathechin은 비만을 억제하는 효능이 보고22,23)되었지만, 율피를 이용한 지방세포의 분화 및 비만과의 상관관계에 어떠한 영향을 미치는지에 대한 연구는 미비한 실정이며, 폐자원인 율피를 이용한 항미만 소재 개발 및 비만치료제로서 활용성에 관련된 연구가 필요하다.
- 24% 정도 저해가 통계적으로 유의하게 확인하였으며 지방세포로 분화유도 후 Triglyceride의 세포내 침착은 control에 비하여 15% 감소하였으나 통계적으로 유의하지는 않았다. 이상의 결과로 율피 추출물은 처리한 농도에서 세포독성 없이 지방세포로의 분화를 억제(Inhibition of adipogenesis)하는 것으로 확인되었으며, 향후, 분자생물학적, 생화학적인 표식인자의 검증 및 대사 경로에 대한 연구와 동물실험과 같은 지속적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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