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문제 정의
- 이에 저자는 dopamine 分泌細胞에 대한 加味逍遙散의 抗酸化的 效果를 알아보고자 항산화효과와 6-OHDA로 유도된 SH-SY5Y human neuroblastoma cell 및 태아중뇌 dopamine 세포 보호효과를 관찰하였다.
- 이에 저자는 加味逍遙散의 神經細胞保護效果를 알아보고자, 加味逍遙散 추출물의 항산화 효과 및 human neuroblastoma cell과 태아 중뇌 도파민 세포에서 6-OHDA 로 유도된 細胞毒性에 대한 保護效果를 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 96 well plate에 2.5×104/well의 SHSY5Y 세포를 분주하고 37℃, 5% CO2에서 48시간 배양 후, 농도별 GMSYS (1, 10, 25, 50, 75 및 100㎍/㎖) 100㎕를 PBS에 녹여 24시간 동안 배양하였다.
- 96 well plate에 2.5×104/well의 SHSY5Y 세포를 분주하고 37℃와 5% CO2에서 48시간 배양 후, 농도별 GMSYS (1, 10, 25, 50, 75 및 100㎍/㎖) 100㎕와 6-OHDA을 처리하였다.
- ABTS radical cation inhibition activity를 측정하기 위해 7mM ABTS와 2.45mM potassium persulfate를 혼합하여 상온의 암실에서 24시간 반응시켰다. ABTS와 potassium persulfate 혼합액을 pH 7.
- DPPH free radical inhibition activity를 측정하기 위해 0.2mM DPPH ethanolic solution 100㎕에 농도별 GMSYS(1, 10, 100, 500 및 1,000㎍/㎖)를 100㎕씩 가하여 반응시켰다. 반응 30분 후 37℃에서 spectrophotometer(Versamax; Molecular Device, Sunyvale, USA)를 이용하여 517㎚에서 optical density(이하 OD)를 측정하였으며, DPPH free radical inhibition activity는 아래와 같이 계산하였고, IC50을 측정하였다.
- FBS가 없는 MEM에서 胎兒中腦細胞에 0.2와 1㎍/㎖의 GMSYS를 가하고 6시간 배양 후 10μM의 6-OHDA를 처리하였다.
- Gelatin-coated slide에 coverslip을 mounting 후, 각 군당 무작위로 4개의 sample을 선택하고 각 sample당 9구역에서 현미경 (Axioskop 2; Carl Zeiss Inc., Göttingen, Germany)를 이용하여 세포수를 계측 (100X) 후, 무처치 대조군에 대한 백분율 (%)로 표시하였다.
- 2와 1㎍/㎖의 GMSYS 및 10μM의 6-OHDA를 처리하여 20시간 배양한 다음, 배양액 100㎕을 회수하여 Griess reagent 100㎕를 첨가하고 상온 암실에서 10분간 반응시켰다. Spectrophotometer를 이용하여 540㎚에서 흡광도를 측정하였으며, sodium nitrite를 이용해 표준곡선을 그려 NO 농도를 결정하였다.
- 그 후 MTT 1㎎/㎖를 처리하여 3시간 배양하고, 생성된 formazan을 DMSO로 녹여 15분간 shaking 하였다. Spectrophotometer를 이용하여 570㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 세포 생존율은 무처치 대조군에 대한 백분율 (%)로 표시하였다.
- 총 폴리페놀 함량을 측정하기위해 GMSYS 10㎎/㎖를 증류수로 희석한 후, 2N folin 200㎕와 Na2CO3 2㎖를 첨가하여 상온 암실에서 1시간 동안 반응시켰다. Spectrophotometer를 이용하여 725㎚에서 흡광도를 측정하였으며, total polyphenolic contents는 tannic acid를 이용하여 작성한 표준 곡선으로부터 함량을 구하였다.
- 加味逍遙散의 神經細胞 保護效果를 알아보고자, GMSYS의 抗酸化 效果 및 human neuroblastoma cell과 태아중뇌 dopamine 세포에서 6-OHDA로 유도된 細胞毒性에 대한 保護效果를 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 胎兒中腦細胞에 0.2와 1㎍/㎖의 GMSYS 및 10μM의 6-OHDA를 처리하여 20시간 배양한 다음, 배양액 100㎕을 회수하여 Griess reagent 100㎕를 첨가하고 상온 암실에서 10분간 반응시켰다.
- 胎兒中腦細胞에 0.2와 1㎍/㎖의 GMSYS 및 10μM의 6-OHDA를 처리하여 20시간 배양한 다음, 배양액 50㎕을 incubation buffer 50㎕와 diluent buffer가 포함된 rat TNF-α 항체코팅 96 well plate에 가하였다.
- 2mM DPPH ethanolic solution 100㎕에 농도별 GMSYS(1, 10, 100, 500 및 1,000㎍/㎖)를 100㎕씩 가하여 반응시켰다. 반응 30분 후 37℃에서 spectrophotometer(Versamax; Molecular Device, Sunyvale, USA)를 이용하여 517㎚에서 optical density(이하 OD)를 측정하였으며, DPPH free radical inhibition activity는 아래와 같이 계산하였고, IC50을 측정하였다.
- 반응 종결후 ELISA reader를 이용하여 450㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 0pg/㎖∼1,000pg/㎖의 TNF-α standard를 이용한 standard curve에 측정한 흡광도를 대입하여 TNF-α 의 농도(pg/㎖)를 구하였다.
- 이 때 pre-treatment 군은 먼저 농도별 GMSYS를 21시간 처리 후 6-OHDA 200μM을 3시간 처리하여 배양하였고, co-treatment군은 농도별 GMSYS와 6-OHDA 150μM를 동시에 처리한 후 24시간 배양하였으며, posttreatment군은 먼저 6-OHDA 150μM를 3시간 처리 후 농도별 GMSYS을 가하여 21시간 배양하였다.
- 02가 되게 하였다. 이 희석 용액에 최종농도가 1, 10, 100, 500 및 1,000㎛/㎖가 되도록 GMSYS를 가하여 5분간 상온에서 반응시킨 후, spectrophotometer를 이용하여 732㎚에서 흡광도를 측정하였으며, ABTS radical cation inhibition activity 는 아래와 같이 계산하였고, IC50을 측정하였다.
- 5×104/well의 SHSY5Y 세포를 분주하고 37℃, 5% CO2에서 48시간 배양 후, 농도별 GMSYS (1, 10, 25, 50, 75 및 100㎍/㎖) 100㎕를 PBS에 녹여 24시간 동안 배양하였다. 이후 MTT 1㎎/㎖를 처리하여 3시간 배양한다음 DMSO로 생성된 formazan을 녹여 15분간 shaking하고, spectrophotometer 로 570㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 세포 생존율은 무처치 대조군에 대한 백분율(%)로 표시하였다.
- 총 폴리페놀 함량을 측정하기위해 GMSYS 10㎎/㎖를 증류수로 희석한 후, 2N folin 200㎕와 Na2CO3 2㎖를 첨가하여 상온 암실에서 1시간 동안 반응시켰다. Spectrophotometer를 이용하여 725㎚에서 흡광도를 측정하였으며, total polyphenolic contents는 tannic acid를 이용하여 작성한 표준 곡선으로부터 함량을 구하였다.
대상 데이터
- Neuroblastoma cell 保護效果 연구에 사용한 Dulbeco's modified Eagle's medium (이하 DMEM), minimum essential medium (MEM), fetal bovine serum(이하 FBS) 및 1% penicillin-streptomycin 등은 Gibco Industries Inc.(Auckland, New Zealand)에서, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(이하 MTT), 6- hydroxydopamine(이하 6-OHDA), dimethyl sulfoxide(이하 DMSO) 및 Griess reagent 등은 Sigma-Aldrich(St. Louis, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- Orient Bio.(Osan, Korea)에서 14일 된 Sprague-Dawley 태아를 구입하여 forceps으로 태아 중뇌 조직을 얼음위에서 박리하고 10% FBS를 포함한 MEM에 모은 후, pipet을 이용하여 기계적으로 dissociation 하였다. 조직에 trypsin을 처리하여 세포수를 counting한 후, PLL로 미리 coating한 coverslip에 1.
- (Carlsbad, USA)에서, tyrosine hydroxylase (이하 TH)-rabbit in goat primary antibody 는 Chemicon International Inc.(Temecula, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- American Type Culture Collection(Rockville, USA)로부터 human neuroblastoma cell인 SH-SY5Y를 분양받아, 60㎜ dish에서 10%(v/v) FBS, 1% penicillin/streptomycin을 포함하는 DMEM으로 37℃와 5% CO2에서 배양하였다.
- 抗酸化 效果 연구에 사용한 1.1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(이하 DPPH), 2,2'-azinobis -3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid(이하 ABTS), potassium persulfate, tannic acid 및 folin 등은 Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 실험에서 사용한 處方은 OO대학교 한의과대학 부속한방병원의 慶熙韓方處方集에 收載된 加味逍遙散(HK013)을 따랐으며, 각 약재들은 경희대학교 한의과 대학 부속한방병원 약재과에서 구입하여 사용하였고, 약재의 구성과 1貼의 분량은 Table 1과 같다.
데이터처리
- 실험 결과는 SPSS ver 12.0K for windows를 이용하여 one-way ANOVA test로 통계적 유의성을 검증하였으며, p<0.05인 경우를 통계적 유의성이 있는 것으로 하였다.
성능/효과
- 1. DPPH free radical inhibition activity와 ABTS radical cation inhibition activity를 측정한 결과, 농도의존적인 소거활성 증가를 나타내었고 IC50은 각각 133.60㎍/㎖과 106.20㎍/㎖이었으며, GMSYS 10㎎/㎖의 총 페놀 함량은 0.78%로 관찰되었다.
- 10㎎/㎖ GMSYS의 total polyphenolic contents를 tannic acid 표준곡선으로부터 구한 결과 0.78%로 나타났다.
- 2. 모든 농도의 GMSYS는 SH-SY5Y세포의 cell viability에 영향을 미치지 않았다.
- 3. SH-SY5Y세포에 6-OHDA와 GMSYS 를 처리한 결과, co-treatment 시에는 25㎍/㎖ 이하에서, post-treatment 시에는 모든 투여군에서 세포보호 효과가 관찰되었다.
- 4. 태아중뇌세포에서 6-OHDA에 의해 감소된 도파민 세포를 0.2㎍/㎖ GMSYS가 유의하게 증가시켰다.
- 5. 태아중뇌세포에서 6-OHDA에 의해 증가된 NO와 TNF-α를 0.2㎍/㎖ GMSYS가 유의하게 감소시켰다.
- 6-OHDA 처리 순서에 따른 농도별 GMSYS의 SH-SY5Y cell 보호효과를 관찰한 결과에서는, pre-treatment군의 경우 10㎍/㎖ 이하의 GMSYS에서 cell viability 가 6-OHDA 단독에 비하여 세포 생존율이 증가하였으나 통계적으로 유의하지 않았고, co-treatment군의 경우는 25㎍/㎖이하의 GMSYS에서 6-OHDA 단독에 비하여 유의한 cell viability 증가를 보였으며, post-treatment군의 경우 모든 농도의 GMSYS에서 6-OHDA 단독투여군에 비하여 증가된 세포 생존율을 나타내어, 6-OHDA로 유발된 산화적 stress에 대하여 비교적 저농도의 GMSYS가 뇌세포에 대한 보호 및 치료효과가 있음을 알 수 있었다.
- . 6-OHDA로 유발된 신경손상에 대한 GMSYS의 효과를 관찰하기에 앞서, 뇌신경 세포인 SH-SY5Y cell에 대한 농도별 GMSYS의 영향을 관찰한 결과, 모든 농도의 GMSYS은 cell viability에 영향을 미치지 않았다.
- . GMSYS 10㎍/㎖의총 페놀 함량을 tannic acid 표준곡선으로부터 구한 결과 0.78%로 나타나, 이상의 결과를 통해 GMSYS의 抗酸化 效果를 확인할 수 있었다.
- GMSYS post-treatment군의 경우 6-OHDA 150μM 단독에 의한 cell viability는 control에 비해 32.59%로 감소되었고, 모든 농도의 GMSYS에서 6-OHDA 단독에 비하여 cell viability가 통계적으로 유의하게 (p<0.001) 증가하였다(Fig. 4).
- SH-SY5Y cell에서 농도별 GMSYS 처리에 따른 6-OHDA에 대한 cell viability를 측정한 결과, GMSYS pre-treatment 군의 경우 6-OHDA 200μM 단독에 의한 cell viability는 control에 비해 68.84%로 감소되었고, 10㎍/㎖ 이하의 GMSYS에서는 6-OHDA 단독에 비하여 cell viability가 증가되었으나 통계적으로 유의하지 않았다.
- . 농도별 GMSYS 처리 후 ABTS radical cation 소거 활성을 측정한 결과, 대체로 농도 의존적으로 증가하여 500㎍/㎖에서 94.67%의 최대 inhibition activity를 나타내었으며, IC50은 106.20㎍/㎖이었다.
- 의 DPPH에 대한 항산화 효과가 보고된 바 있다. 농도별 GMSYS 처리 후 DPPH free radical inhibition activity는 농도 의존적으로 증가하여 1,000㎍/㎖에서 93.67%의 최대 inhibition activity를 나타내었으며, IC50은 133.60㎍/㎖이었다.
- 농도별 GMSYS의 ABTS radical cation inhibition activity를 측정한 결과, 대체로 농도 의존적으로 증가하였으며 최대 활성은 500㎍/㎖ GMSYS에서 94.67%로 나타났으며, IC50은 106.20㎍/㎖이었다(Fig. 2).
- 농도별 GMSYS의 DPPH free radical inhibition activity를 측정한 결과, 농도 의존적으로 증가하여 최대 활성은 1,000㎍/㎖ GMSYS에서 93.67%로 나타났으며, IC50은 133.60㎍/㎖이었다(Fig. 1).
- 농도별 GMSYS의 SH-SY5Y cell에 대한 cell viability를 측정한 결과, 모든 농도의 GMSYS에서 통계적으로 유이한차이가 없었다(Fig. 3).
- 은 산화적 stress가 중요한 역할을 담당하며, 항산화제가 도파민 분비세포 퇴화를 막을 수 있다고 보고한 바 있다. 도파민 분비세포에 대한 GMSYS의 효과를 6-OHDA에 대한 태아중뇌세포 보호 효과를 TH-immunopositive cell을 통해 관찰한 결과, 0.2㎍/㎖ GMSYS 투여군에서 6-OHDA 단독투여군에 비하여 통계 적으로 유의한 세포 생존율 증가를 나타내어 저농도 GMSYS의 뇌세포 보호효과를 재확인 하였다.
- 태아 중뇌세포에 GMSYS과 6-OHDA를 처리한 배양액 내 NO와 TNF-α의 농도를 관찰한 결과, 0.2㎍/㎖ GMSYS 투여군이 6-OHDA 단독투여군에 비하여 통계적으로 유의한 NO와 TNF-α의 농도 감소를 나타내었다.
- 태아중뇌세포를 이용하여 GMSYS의 6-OHDA 처리 후 배양액 내 NO 농도를 측정한 결과, 6-OHDA 10μM 단독의 경우 control에 비하여 155.76%로 통계적으로 유의하게(p<0.001) 증가되었다.
- 태아중뇌세포를 이용하여 GMSYS의 6-OHDA 처리 후 배양액 내 TNF-α 농도를 측정한 결과, 6-OHDA 10μM 단독의 경우 8.63±0.81pg/㎖로 control에 비하여 통계적으로 유의하게(p<0.001) 증가되었다.
- 태아중뇌세포를 이용하여 GMSYS의 6-OHDA에 대한 세포보호 효과를 측정한 결과, 6-OHDA 10μM 단독의 경우 control에 비하여 32.13%로 통계적으로 유의하게(p<0.001) 도파민 세포의 분화및 생존을 억제시켰다.
후속연구
- 이상의 연구결과를 종합해 볼 때, GMSYS은 항산화 효과를 통한 뇌세포 보호 효과가 있음을 알 수 있었으며, 특히 6-OHDA로 유발된 산화적 stress에 대하여 저농도에서 보다 양호한 효과를 보여 향후 이에 관한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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