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문제 정의
- NO와 함께 강력한 염증 매개물질로 작용하는 것으로 보고되어 진 PGE2와 COX2 생성에 대한 GMS-SE의 효과를 알아보기 위해 약리학적인 효능 평가를 실시하였다. 그 결과, LPS처리에 의해 증가된 COX2 발현은 100 ㎍/㎖ 농도 이상에서 양성대조군 DEX에 유의적으로 현저하게 억제되는 것을 확인하였다 (Fig.
- 하지만, 한방건강보험의 경우 총 69종의 단미엑스산제를 혼합한 56개 처방에서만 건강보험급여로 인정되는 제한된 한약시장과 한약제제에 대해서는 안전성, 유효성 자료도 면제되는 정책에 의해 한약제제에 대한 연구가 소홀하여 국민들의 신뢰도도 떨어지는 실정이다. 따라서 본 연구에서는 한약탕제의 고유한 쓴맛을 없애 먹기 편한 시럽 형태의 한방건강보험용 가미소요산 혼합단미연조엑스제 (GMS-SE)의 새로운 제형으로 개발함으로써, 이에 대한 항산화, 항염증 효능도 확인하여 유효성을 검증하였다.
- 본 연구에서는 LPS에 의해 유도된 TNF-α, IL-6, IL-1β의 생성에 대한 가미소요산 혼합단미연조엑스제 (GMS-SE)의 억제 효과를 cytokine 분비량을 ELISA법으로, mRNA 발현을 RT-PCR로 분석한 결과 TNF-α, IL-6, IL-1β 단백질 분비와 mRNA 발현 모두에서 매우 유사한 경향을 나타냄을 확인 하였다 (Fig 4). 또한, 가미소요산 혼합단미연조엑스제 (GMS-SE)가 어떠한 신호전달을 통해 억제하는지 알아보기 위해 전사인자인 MAPKs의 인산화를 억제하는지 알아보았다. 현재까지 비교적 잘 알려진 염증반응의 분자신호 전달기전 MAPK superfamily에 속하는 세 가지 효소들로 extracellularregulated protein kinase (ERK), c-Jun NH2-protein kinase (JNK)/stress- activated protein kinase (SAPK), serine/threonine protein kinase인 p38 MAPK 등을 들 수 있다.
- 본 연구에서는 가미소요산의 새로운 제형으로써 혼합단미연조엑스제 (GMS-SE) 개발에 따른 항산화 및 항염증 효능을 검증하여 다음과 같은 결론을 얻었다. 본 연구에서는 최초로 건강보험용 가미소요산 혼합단미 연조엑스제의 새로운 제형을 개발하여 품목허가를 받았다.
- 본 연구에서는 가미소요산의 새로운 제형으로써 혼합단미연조엑스제 (GMS-SE) 개발에 따른 항산화 및 항염증 효능을 검증하여 다음과 같은 결론을 얻었다. 본 연구에서는 최초로 건강보험용 가미소요산 혼합단미 연조엑스제의 새로운 제형을 개발하여 품목허가를 받았다.
- 7 세포에서의 지질 과산화생성을 억제한다는 보고가 된 바 있다27,28). 이러한 가미소요산의 효능을 바탕으로 본 연구는 가미소요산 혼합단미연조엑스제 (GMS-SE)의 항염증 및 항산화 효과를 대식세포내 염증조절기전에 대한 규명으로 효과적인 항산화, 항염증 치료제로도 개발할 수 있는 근거가 됨을 밝혔다.
- 현재 우리나라에서 한방건강보험 급여적용 한약제제는 혼합단미엑스제로 단미엑스산 69종 및 혼합단미엑스제 56처방으로 일부 처방 및 산제 제형의 건강보험용 한약제제로 국한되어 있다14,15). 이에 본 연구는 복용이 편리한 제형 개발 및 보험급여 등재로 한약제제의 활성화 및 보장성 확대를 위하여 가장 대표적인 가미소요산 (加味逍遙散)처방에 대하여 혼합단미연조엑스제 (GMS-SE)를 개발함으로써, 이에 대한 유효성을 확인하였다.
제안 방법
- 총 폴리페놀 함량은 표준물질로 gallic acid (Sigma, USA)를 이용하여 검량선을 작성하여 나타내었다.10) 총 플라보노이드 함량 측정 GMS-SE을 1000 ㎍/㎖의 농도에 함유된 총 플라보노이드 함량은 Singleton VL 등 25)의 방법을 일부 변경하여 측정하였다. 표준물질로 quercetin (Sigma, USA)를 이용하여 총 플라보노이드 함량 검량선을 작성하였다.
- 그 후, 5% Skin milk를 처리하여 비 특이적인 단백질에 대한 blocking을 하였고, 각각의 1차 항체 iNOS, COX2, P-ERK, P-P38, β-actin primary antibody (1:1000 dilution)로 4℃에서 overnight 반응한 후, TBS-T로 3회 세척하고, HRPconjugated secondary anti-body (1:1000 dilution)로 1시간동안 실온에서 반응시켰다. 3회 세척 후, immunopositive bands는 enhanced chemi-luminescent (ECL, Thermo Scientific, USA)에 의해 감광시켜 chemiluminescent detection system을 이용하여 현상하였다.
- GMS-SE의 염증억제효과를 확인하기 위해 세포배양액 내 Nitric oxide (NO)량을 측정하였다. AW264.7 세포 (1X105 cells/well)에 GMS-SE를 각각 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도로 전처리하고 2 시간 후, LPS (0.1 ㎍/㎖)를 처리하여 18 시간 배양하였다. NO의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 Griess Reagent System을 이용하여 측정하였다.
- GMS-SE 처리에 의한 세포독성 검사를 위해서 RAW264.7 대식세포에 GMS-SE 농도별로 처리하여 24시간 배양한 후 MTS assay를 수행하였다(Fig. 1). RAW264.
- GMS-SE를 각각 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도로 2 시간 전처리를 한 후, LPS (0.1 ㎍/㎖)를 5 시간 배양한 RAW264.7 세포를 수거한 후 RNAiso (Takara, Japan)를 이용하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 total RNA는 1 ㎍로 정량하여 oligo-dT, DEPC와 함께 70℃에서 5 분간 반응시킨 후 바로 ice에서 반응을 중지시킨다.
- GMS-SE의 염증억제효과를 확인하기 위해 세포배양액 내 Nitric oxide (NO)량을 측정하였다. AW264.
- GMS-SE의 항산화 활성을 측정하기 위하여 우선적으로 항산화 활성 물질로 잘 알려진 페놀 및 플라보노이드의 함량을 측정하였다. 그 결과, 총 폴리페놀 함량을 gallic acid를 표준 물질로 하여 측정한 결과 73.
- 1 ㎍/㎖)를 처리하여 18 시간 배양하였다. NO의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 Griess Reagent System을 이용하여 측정하였다. 즉, 세포배양액 100 ㎕에 동량의 Griess reagent를 넣고 교반기에서 10 분간 반응시킨 후 microplate reader (tecan Infinite M200)를 이용, 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- RAW264.7 세포 (1X105 cells/well)에 GMS-SE를 각각 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도로 2 시간 전처리를 한 후, LPS (0.1 ㎍/㎖)를 처리하여 18 시간 배양한 후 세포배양액을 수거하여 cytokine 측정에 이용하였다. 배양액은 각 cytokine 측정에 적절한 농도로 희석한 후, TNF-α, IL-6, IL-1β, PGE2의 농도를 ELISA kit (R&D System, USA)를 이용하여 측정하였다.
- RAW264.7 세포 (2X105 cells/well)에 GMS-SE를 각각 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도로 2 시간 전처리를 한 후, LPS (0.1 ㎍/㎖)를 처리하여 MAPK 활성을 측정하기 위하여 각 cytokine의 시간조건 별로 반응하였다. 1X PBS로 세척 후, protease&phosphatase inhibitor cocktail을 포함하는 RIPA buffer (PIERCE, USA)로 균질화하였다.
- Shahidi DPPH 방법23)을 변형하여 GMS-SE을 100, 200, 500, 1000 ㎍/㎖의 농도로 100 ㎕를 96 well plate에 분주하였다. 실험 직전에 제조한 0.
- 즉, 세포배양액 100 ㎕에 동량의 Griess reagent를 넣고 교반기에서 10 분간 반응시킨 후 microplate reader (tecan Infinite M200)를 이용, 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. sodium nitrite의 농도별 표준곡선을 이용하여 배양액 내의 NO 농도를 결정하였다.
- 배양액은 각 cytokine 측정에 적절한 농도로 희석한 후, TNF-α, IL-6, IL-1β, PGE2의 농도를 ELISA kit (R&D System, USA)를 이용하여 측정하였다. 각 cytokine의 농도는 standard curve와 비교해 계산하였다.
- 대조군은 시료를 첨가하지 않은 물로 하였다. 각 시료에 대한 DPPH 라디칼 소거능 억제강도는 양성대조군으로 butylated hydroxy-anisole (BHA) 100, 1000 ㎍/㎖를 사용하여 비교하였다.
- 그 후, 5% Skin milk를 처리하여 비 특이적인 단백질에 대한 blocking을 하였고, 각각의 1차 항체 iNOS, COX2, P-ERK, P-P38, β-actin primary antibody (1:1000 dilution)로 4℃에서 overnight 반응한 후, TBS-T로 3회 세척하고, HRPconjugated secondary anti-body (1:1000 dilution)로 1시간동안 실온에서 반응시켰다.
- 01 mM DPPH 용액을 가하여 25℃에서 30 분간 반응시킨 후, 516 nm에서 흡광도를 측정하여 소거능을 다음 공식에 의하여 산출하였다. 대조군은 시료를 첨가하지 않은 물로 하였다. 각 시료에 대한 DPPH 라디칼 소거능 억제강도는 양성대조군으로 butylated hydroxy-anisole (BHA) 100, 1000 ㎍/㎖를 사용하여 비교하였다.
- MAPKs는 세포의 성장과 분화 및 cytokine과 stress 제어에 중요한 역할을 한다. 따라서 GMS-SE의 염증 억제가 분자기전적으로 MAPKs를 경유하는지 알아보기 위해 ERK와 P38의 인산화를 Western blot을 통해 확인하였다. 그 결과, LPS에 의해 활성화된 RAW264.
- NO는 iNOS에 의해 생성되어 염증 상태에서 혈관 투과성, 부종 등의 염증반응을 촉진시킬 뿐만 아니라 염증매개체의 생합성을 촉진하여 염증을 심화시키는 것으로 알려져 있다. 따라서 NO를 생성하게 하는 iNOS의 mRNA와 단백질 발현을 측정하였다. 그 결과, LPS처리에 의해 형성되는 iNOS mRNA 발현은 200 ㎍/㎖ 농도에서 47.
- 따라서 TNF-α, IL-6, IL-1β에 대한 GMS-SE의 효과를 알아보기 위해 이들의 mRNA 발현에 대한 효과를 확인하기 위하여 RT-PCR을 수행하였고, ELISA를 이용하여 세포 배양액 중에 존재하는 단백질량을 측정하였다.
- 또한, 가미소요산 혼합단미연조엑스제 (GMSSE) 제형개발에 필요한 부형제는 식품공전 및 의약품 첨가제 평가 가이드라인의 공정서에서 제시하는 품목으로 벤조산나트륨은 보존제로, γ-사이클로덱스트린은 포접제, 자일리톨, 스테비아는 감미제, 구연산은 산도제, 대추향은 착향제, CMC-Na는 점증제로서 각각의 역할로 기준치를 넘지 않는 구성 비율로 혼합한 후 제조하였다 (표 1).
- 7 세포에 대한 독성 농도를 알아보기 위하여 MTS assay를 수행하였다. 먼저 1X104 cells/well의 RAW 264.7 세포를 분주하고 GMS-SE를 농도 별 (0, 31.3, 62.5, 125, 250, 500, 1000 ㎍/㎖)로 처리하여 24 시간 배양하였다. 그 후, MTS solution을 첨가하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 2 시간 동안 반응시켜 microplate reader (Tecan)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 배양액은 각 cytokine 측정에 적절한 농도로 희석한 후, TNF-α, IL-6, IL-1β, PGE2의 농도를 ELISA kit (R&D System, USA)를 이용하여 측정하였다.
- 본 연구에 사용한 GMS-SE는 공정서 (대한민국 한약(생약) 규격집, KHP)에 표기된 가미소요산 (GMS)의 개별 한약재 1 ㎏을 정선하여 대한약전 제제총칙 엑스제의 제법에 따라 절도 및 분말도에 따라 조절로 하고, 약탕기 (대웅약탕기, 서울, 한국)로 정제수 10 배량을 가해 100℃에서 3시간 침출한 다음 Whatman filter paper (No. 4)로 여과하고, 생약의 침출액을 농축 (85℃이하, 감압농축)한 연조엑스를 얻은 것으로 KHP에 따른 수율과 고형물 함량에 대비하여 혼합 용량을 설정하였다(표 1). 또한, 가미소요산 혼합단미연조엑스제 (GMSSE) 제형개발에 필요한 부형제는 식품공전 및 의약품 첨가제 평가 가이드라인의 공정서에서 제시하는 품목으로 벤조산나트륨은 보존제로, γ-사이클로덱스트린은 포접제, 자일리톨, 스테비아는 감미제, 구연산은 산도제, 대추향은 착향제, CMC-Na는 점증제로서 각각의 역할로 기준치를 넘지 않는 구성 비율로 혼합한 후 제조하였다 (표 1).
- 그 후, MTS solution을 첨가하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 2 시간 동안 반응시켜 microplate reader (Tecan)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포독성 정도는 시료를 처리하지 않은 대조군 (CON)과 약물 처리군의 비율로 계산하였다.
- 이 template DNA와 Taq polymerase 등이 포함된 반응 혼합액 (itron, USA)과 각각의 Primer sequuence인 GGC AGG TCT ACT TTG GAG TCA TTG C (forward), ACA TTC GAG GCT CCA GTG AAT TCG G (reverse); TNF-α, CCG GAG AGG AGA CTT CAC AG (forward), GGA AAT TGG GGT AGG AAG GA (reverse); IL-6, CCA AAC CTC TTC GAG GCA CA (forward), AAC ACG CAG GAC AGG TAC AG (reverse); IL-1β, AAA GCC ACG AGG CTC TGA CA (forward), GTG AGA GGC AAA GGA GGA GA (reverse); iNOS로 PCR 증폭 후, 1.5% Agarose gel 전기영동으로 분석하였다.
- 7 세포에 대한 GMS-SE의 세포독성은 GMS-SE를 처리하지 않고 배양한 대조군의 세포생존율 100%를 기준으로 500 ㎍/㎖ 농도까지는 95% 정도 및 그 이상의 생존율을 보여 세포독성이 거의 없는 것으로 판단되지만, 1000 ㎍/㎖ 처리군에서는 80% 이하로 감소되었다. 이후 본 연구는 안전한 200 ㎍/㎖ 이하의 농도범위에서 수행하였다.
- 10) 총 플라보노이드 함량 측정 GMS-SE을 1000 ㎍/㎖의 농도에 함유된 총 플라보노이드 함량은 Singleton VL 등 25)의 방법을 일부 변경하여 측정하였다. 표준물질로 quercetin (Sigma, USA)를 이용하여 총 플라보노이드 함량 검량선을 작성하였다.
대상 데이터
- β-actin 1,2차 항체는 Santa Cruz Biotechnology (USA)에서 구입하였다.
- 실험에 사용된 시약 중 lipopolysac-charide (LPS), griess reagent은 sigma (USA), aqueous one solution cell proli-feration Assay (MTS) kit 및 agarose는 promega (USA), TNF-α, IL-6, IL-1β, PGE2 enzyme linked immuno sorbent (ELISA) assay kit를 R&D system (USA)에서 구입하여 사용하였다. 단백질분석 실험에 사용한 1차 항체인 iNOS monoclonal antibody (mAb)는 BD biosience (USA)에서, COX2, P-ERK, P-P38 mAb는 cell signaling techonolgy (USA)에서 구입하였다. β-actin 1,2차 항체는 Santa Cruz Biotechnology (USA)에서 구입하였다.
- 마우스의 대식세포주인 RAW264.7 세포는 한국세포주은행 (KCLB)에서 분양 받았으며, 세포 배양을 위해 항생제 및 항균제인 1% penicillin-streptomucin, 10% FBS를 첨가한 DMEM 배지를 배양액으로 하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
- 본 연구에 사용된 가미소요산 처방 구성 약재들 중 당귀, 작약, 복령, 백출, 시호, 치자, 목단피, 감초는 ㈜휴먼허브(경북 경산, 한국)에서 구입하였고, 박하는 ㈜옴니허브 (대구, 한국)에서 각각 구입하였다. 연조엑스제 제조에 필요한 첨가제는 모두 화성화공약품상사(주)에서 구입하였다.
- 세포 배양액인 fetal bovine serum (FBS), dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM), penicillin-streptomucin, phos-phate buffered saline (PBS) 등의 세포배양용 시약들은 hyClone (USA)에서 구입하였다.
- 실험에 사용된 시약 중 lipopolysac-charide (LPS), griess reagent은 sigma (USA), aqueous one solution cell proli-feration Assay (MTS) kit 및 agarose는 promega (USA), TNF-α, IL-6, IL-1β, PGE2 enzyme linked immuno sorbent (ELISA) assay kit를 R&D system (USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 가미소요산 처방 구성 약재들 중 당귀, 작약, 복령, 백출, 시호, 치자, 목단피, 감초는 ㈜휴먼허브(경북 경산, 한국)에서 구입하였고, 박하는 ㈜옴니허브 (대구, 한국)에서 각각 구입하였다. 연조엑스제 제조에 필요한 첨가제는 모두 화성화공약품상사(주)에서 구입하였다.
데이터처리
- 실험결과의 통계 처리는 SPSS package를 이용하였으며, 모든 측정값은 mean±SEM (n=3)로 표시하였고 분석에 대한 유의성은 one-way-ANOVA를 실시, 분석결과에 대한 p<0.05의 수준에서 LSD 다중검정법으로 사후검정을 실시하여 각 처리구간의 평균치에 대한 유의성을 분석하였다.
이론/모형
- GMS-SE의 RAW264.7 세포에 대한 독성 농도를 알아보기 위하여 MTS assay를 수행하였다. 먼저 1X104 cells/well의 RAW 264.
- NO는 활성산소 중 하나이며, 최근 염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 NO 생성에 대한 GMS-SE의 효과를 알아보기 위해 Griess assay 방법을 이용하여 측정하였다. GMS-SE는 100, 200 ㎍/㎖의 처리농도에서 각각 29.
성능/효과
- 1. GMS- SE는 RAW264.7 대식세포에서 1000 ㎍/㎖ 농도에서만 80% 이하의 세포독성이 나타났다.
- 2. GMS-SE는 RAW264.7 대식세포에서 농도 의존적으로 염증 매개 물질인 NO, iNOS, COX-2, PGE2의 분비와 발현을 유의적으로 억제시켰다.
- 3. GMS-SE는 RAW264.7 대식세포에서 농도 의존적으로 전염증성 Cytokine인 TNF-α, IL-6, IL-1β의 유전자와 단백질 생성을 억제시켰다.
- 4. GMS-SE는 RAW264.7 대식세포에서 농도 의존적으로 ERK 1/2와 p38의 인산화를 억제시켰다.
- 5. GMS-SE는 총 폴리페놀과 총 플라보노이드 함량 수치는 낮았지만, DPPH 라디칼 소거능은 1000 ㎍/㎖의 농도에서 대조군 BHA와 함께 유의적인 항산화 활성을 나타내었다.
- 따라서 NO 생성에 대한 GMS-SE의 효과를 알아보기 위해 Griess assay 방법을 이용하여 측정하였다. GMS-SE는 100, 200 ㎍/㎖의 처리농도에서 각각 29.86%, 46.15%로 농도 의존적이고, 양성대조군인 Dexamethasone (DEX)의 32.58%에 유의적으로 NO 생성이 억제되는 것으로 나타났다 (Fig. 2A). NO는 iNOS에 의해 생성되어 염증 상태에서 혈관 투과성, 부종 등의 염증반응을 촉진시킬 뿐만 아니라 염증매개체의 생합성을 촉진하여 염증을 심화시키는 것으로 알려져 있다.
- 1). RAW264.7 세포에 대한 GMS-SE의 세포독성은 GMS-SE를 처리하지 않고 배양한 대조군의 세포생존율 100%를 기준으로 500 ㎍/㎖ 농도까지는 95% 정도 및 그 이상의 생존율을 보여 세포독성이 거의 없는 것으로 판단되지만, 1000 ㎍/㎖ 처리군에서는 80% 이하로 감소되었다. 이후 본 연구는 안전한 200 ㎍/㎖ 이하의 농도범위에서 수행하였다.
- 따라서 GMS-SE의 염증 억제가 분자기전적으로 MAPKs를 경유하는지 알아보기 위해 ERK와 P38의 인산화를 Western blot을 통해 확인하였다. 그 결과, LPS에 의해 활성화된 RAW264.7 대식세포에 GMS-SE를 처리한 경우 ERK와 P38 인산화를 50 ㎍/㎖의 농도에서부터 농도의존적으로 억제하는 것을 확인하였다(Fig. 5A, B).
- 와 COX2 생성에 대한 GMS-SE의 효과를 알아보기 위해 약리학적인 효능 평가를 실시하였다. 그 결과, LPS처리에 의해 증가된 COX2 발현은 100 ㎍/㎖ 농도 이상에서 양성대조군 DEX에 유의적으로 현저하게 억제되는 것을 확인하였다 (Fig. 3A). 이와 같이 GMS-SE는 100, 200 ㎍/㎖의 처리 농도 에서 각각 70.
- 따라서 NO를 생성하게 하는 iNOS의 mRNA와 단백질 발현을 측정하였다. 그 결과, LPS처리에 의해 형성되는 iNOS mRNA 발현은 200 ㎍/㎖ 농도에서 47.30%, 단백질 발현 100, 200 ㎍/㎖에서 24.84%, 57.62%로 현저한 억제 양상을 나타내었다(Fig. 2B, C).
- 그 결과, mRNA발현에서는 LPS 자극원을 처리하였을 때 TNF-α, IL-6, IL-1β 생성이 현저히 증가하였고, GMS-SE를 처리하였을 때 TNF-α, IL-6, IL-1β 모두 200 ㎍/㎖의 농도에서 유의성 있는 감소를 나타내었다 (Fig. 4A).
- 그 결과, 총 폴리페놀 함량을 gallic acid를 표준 물질로 하여 측정한 결과 73.93±6.87 ㎍/㎖, 총 플라보노이드 함량은 표준물질 quercetin으로 정량 측정하여 698.75±6.78 ㎍/㎖로서 높은 항산화 물질 함량을 나타내었고 (Fig 6A), DPPH 라디칼 소거능을 알아보기 위해 합성 항산화제로 잘 알려진 BHA와 비교한 결과, Fig 6B와 같이 GMS-SE의 DPPH 라디칼 소거능은 농도에 의존적으 로 증가했으며, 500 ㎍/㎖의 농도 이상에서 BHA 100 ㎍/㎖와 유사한 효과를 나타내었다 (Fig 6B).
- 그리고 다수의 항염증 약물들의 작용기전은 prostaglandin 합성을 억제하며 이는 COX2의 생성 및 효소 활성저해에 의한 것이다. 따라서 COX2에 의한 prostaglandin의 합성은 염증반응을 매개하는 것으로 여겨지고 있다고 보고 가미소요산 혼합단미연조엑스제 (GMS-SE)가 LPS에 의해 형성되는 PGE2를 유의성 있게 감소시키며 이는 COX2 발현저해에 의한 것임을 확인 할 수 있었다 (Fig 3). 염증매개물질인 TNF-α, IL-6, IL-1β는 in vivo 및 in vitro 모두에서 중추적으로 염증반응을 조절하는 것으로 알려져 있다.
- 또한, LPS 자극원에 의해 세포 배양액으로 분비되는 단백질량은 TNF-α는 25.64%, 48.98%, 84.19%, IL-6는 89.33%, 99.45%, 99.40%로 저농도인 50㎍/㎖의 농도에서부터 농도의존적으로 유의성 있게 감소하였고, IL-1β는 최종농도인 200 ㎍/㎖의 농도에서 47.09%로 유의성 있는 감소를 나타내었다(Fig. 4B).
- 또한, 가미소요산 혼합단미연조엑스제 (GMS-SE)의 항산화 활성은 농도 의존적인 활성을 나타내었고, 특히 1000 ㎍/㎖의 농도에서는 항산화제로 잘 알려진 대조군 BHA의 100 ㎍/㎖과 유사하게 나타남을 확인할 수 있었다 (Fig 6). 이러한 결과들을 통하여 한의학에서 스트레스성 장애와 같은 부인과 질환에 사용되어온 가미소요산의 항염증 기전을 밝힘으로써 그 과학적 근거를 제시하고, 가미소요산 혼합단미연조엑스제(GMS-SE)의 우수한 품질 한약제제 제공에 기여할 것으로 사료되어진다.
- 현재까지 비교적 잘 알려진 염증반응의 분자신호 전달기전 MAPK superfamily에 속하는 세 가지 효소들로 extracellularregulated protein kinase (ERK), c-Jun NH2-protein kinase (JNK)/stress- activated protein kinase (SAPK), serine/threonine protein kinase인 p38 MAPK 등을 들 수 있다. 본 연구에서는 ERK 1/2와 p38 MAPK의 인산화의 염증 전구물질의 형성을 억제함을 확인하였다 (Fig 5).
- 본 연구에서는 LPS에 의해 유도된 TNF-α, IL-6, IL-1β의 생성에 대한 가미소요산 혼합단미연조엑스제 (GMS-SE)의 억제 효과를 cytokine 분비량을 ELISA법으로, mRNA 발현을 RT-PCR로 분석한 결과 TNF-α, IL-6, IL-1β 단백질 분비와 mRNA 발현 모두에서 매우 유사한 경향을 나타냄을 확인 하였다 (Fig 4).
- LPS와 TLR4가 결합하여 활성화 되면 염증매개물질들인 NO, Prosta- glandins (PGs) 그리고 proinflamma- tory cytokines 등을 조절한다31). 이러한 사실에 기초하여 가미소요산 혼합단미연조엑스제 (GMS-SE)가 RAW264.7 세포에서 LPS에 의해 유도된 NO의 생성을 저해함을 확인하였고, RT-PCR과 Western blot으로 iNOS의 mRNA와 단백질 발현 억제를 분석한 결과 NO 형성 억제와 유사한 경향을 나타냄으로써 가미소요산 혼합단미연조엑스제(GMS-SE)이 LPS에 의해 유도된 iNOS의 전사와 번역 모두를 저해한다고 추정된다(Fig 2). 그리고 다수의 항염증 약물들의 작용기전은 prostaglandin 합성을 억제하며 이는 COX2의 생성 및 효소 활성저해에 의한 것이다.
- 3A). 이와 같이 GMS-SE는 100, 200 ㎍/㎖의 처리 농도 에서 각각 70.93%, 91.34%로 농도 의존적으로 PGE2 생성이 양성대조군 DEX 87.11 %에 비교하여 유의 있게 억제되는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 3B).
후속연구
- 따라서 가미소요산 혼합단미연조엑스제는 항염증 및 항산화 활성이 있으며, 향후 복용이 편리한 건강보험용 한약제제 제품으로 개발함으로서 우수성 및 품질향상을 확보할 수 있을 것으로 기대된다.
- 또한, 가미소요산 혼합단미연조엑스제 (GMS-SE)의 항산화 활성은 농도 의존적인 활성을 나타내었고, 특히 1000 ㎍/㎖의 농도에서는 항산화제로 잘 알려진 대조군 BHA의 100 ㎍/㎖과 유사하게 나타남을 확인할 수 있었다 (Fig 6). 이러한 결과들을 통하여 한의학에서 스트레스성 장애와 같은 부인과 질환에 사용되어온 가미소요산의 항염증 기전을 밝힘으로써 그 과학적 근거를 제시하고, 가미소요산 혼합단미연조엑스제(GMS-SE)의 우수한 품질 한약제제 제공에 기여할 것으로 사료되어진다.
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