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문제 정의
- 이에 저자는 加味逍遙散이 P815세포의 세로토 닌에 대해 미치는 영향을 통해 간접적으로 우울 증에 대한 효과를 가늠해보고자 했다. 배양된 P815세포를 이용해서 항산화 효능과 P815세포 내의 serotonin 함량 및 TPH, AAADC, MAOa 의 활성 변화 등을 연구하여 약간의 지견을 얻었다.
- 이에 저자는 임상에서 加味逍遙散이 肝火上炎으로 인한 우울증에 널리 활용되고 있는 점을 감안하여, P815세포의 세로토닌에 대해 미치는 영향을 알아보고자 배양된 P815세포를 이용해서 항산화 효능과 P815 세포 내의 세로토닌 함량 및 TPH 활성 및 AAADC 활성 변화 등을 연구하여 약간의 지견을 얻었기에 報告하는 바이다.
제안 방법
- 대조 유전자인 β-actin으로 사용하였다. Beta-actin mRNA을 control로 이용 하여 타겟 mRNA를 정량하여 유전자 발현을 비교하였다.
- C18역상 HPLC를 사용하여 加味逍遙散의 수용성 성분을 분석하였다. 역상 HPLC 분석 결과 앞부분의 수용 성분을 확인하였다(Fig.
- 96-웰 플레이트의 각 웰에 sample solution 20㎕를 첨가한 후 reagent solution 200 ㎕를 넣은후 마지막으로 enzyme working solution을 넣어준 후, 37도에서 20분간 반응시켰다. ELISA reader를 이용하여 O.D 450 ㎜에서 측정하여 SOD activity(inhibition rate %)를 계산하였다.
- 이후 세포증식을 MTT분석법에 의해서 분석하였다. MTT 분석법은 배양이 완료된 세포에 50 ㎍/㎖ MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)을 희석 처리하여 반응시킨 다음 Microplate reader로 570 ㎚에서 측정하였다.
- P815 세포를 加味逍遙散을 함유한 배지에서 2 일 동안 배양한 후 세포 증식를 각각 측정하였다.
- P815세포 pellet에 RNAzolB을 첨가하여 세포를 용해시킨 후 chloroform 200 ㎕를 넣고 inverting 을 반복하여 고르게 섞은 다음 4℃에서 5분 동안 방치시키고, 이를 14,000 rpm에서 15분 동안 원심분리(4℃)하여 무색의 상층액 만을 400 ㎕ 취한 뒤 동량의 isopropanol을 넣고 inverting을반복하여 섞은 다음 4℃에서 15분 동안 방치시키고 14,000 rpm에서 15분 동안 원심분리(4℃)하여 얻은 pellet(RNA)에 75% ethanol(DEPC treated water) 500 ㎕를 넣어 15,000 rpm에서 15분 동안 원심분리(4℃)하고 ethanol을 완전히 제거한 후에 DEPC water 50 ㎕를 넣어서 RNA를 용해 하여 A260 ㎚에서 흡광도를 측정하여 RNA 함량을 계산하였다. 분리한 RNA에 해당 유전자들의 oligo dT primer와 DEPC water를 넣고 65℃ 에서 10분 동안 반응시킨 후 실온에서 3분 동안 방치한 다음 10 x buffer, 10 ㎜ dNTP, AMV Reverse transcriptase, 50 ㎜ ㎎ Cl2 및 DEPC treated water를 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응 시켜서 reverse transcriptase(RT) product를 만들었다.
- 加味逍遙散의 수용성 성분을 분석하기 위하여 C18역상 HPLC columne을 장착한 HPLC를 사용하였다. 전체 분석시간은 30분으로 이동상의 구성은 초기 5분 동안 H2O를 흘려주었고, 이후 20 분 동안은 acetonitrile gradient를 하여 acetonitrile 을 100%까지 올렸으며, 그 상태를 5분간 지속하 였다.
- 加味逍遙散이 AAADC mRNA발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 加味逍遙散을 함유한 배지에서 2일간 배양한 후 AAADC mRNA를측정하였다. 加味逍遙散에 의한 AAADC mRNA 발현은 각각 0.
- 加味逍遙散이 MAOa mRNA발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 加味逍遙散을 함유한 배지에서 2일간 배양한 후 MAOa mRNA를 측정 하였다. 加味逍遙散에 의한 MAOa mRNA 발현은 각각 0.
- 加味逍遙散이 P815세포의 세로토닌에 대해 미치는 영향을 실험적으로 고찰하기 위하여 배양된 P815세포를 이용해서 항산화 효능과 P815세포 내의 TPH, AAADC, monoamine oxidase A 의 활성 변화 등을 관찰한 결과, 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 加味逍遙散이 TPH-1 mRNA발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 加味逍遙散을 함유한 배지에서 2일간 배양한 후 TPH-1 mRNA를 측정 하였다. 加味逍遙散에 의한 TPH-1 mRNA 발현은 각각 0.
- 각각의 유전자들의 염기 서열은 Table Ⅱ과 같다. 각 Sample의 추출된 RNA 에 2X SYBR Green Master Mix(Bio-Rad) 25 ㎕와각각의 유전자들과 10pM forward and reverse primers를 1 ㎕씩 첨가하여 각각 50 ㎕ 반응이 이루어졌으며 95℃에서 10분 후 30초간 40 cycle 을 돌린 다음 60℃에서 30초 72℃에서 30초 동안 반응을 일으켰다. 대조 유전자인 β-actin으로 사용하였다.
- 분리한 RNA에 해당 유전자들의 oligo dT primer와 DEPC water를 넣고 65℃ 에서 10분 동안 반응시킨 후 실온에서 3분 동안 방치한 다음 10 x buffer, 10 ㎜ dNTP, AMV Reverse transcriptase, 50 ㎜ ㎎ Cl2 및 DEPC treated water를 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응 시켜서 reverse transcriptase(RT) product를 만들었다. 만들어진 RT product(template cDNA) 를 사용하여 Real-Time PCR(Bio Rad)를 사용하여 측정하였다.
- 이에 저자는 加味逍遙散이 P815세포의 세로토 닌에 대해 미치는 영향을 통해 간접적으로 우울 증에 대한 효과를 가늠해보고자 했다. 배양된 P815세포를 이용해서 항산화 효능과 P815세포 내의 serotonin 함량 및 TPH, AAADC, MAOa 의 활성 변화 등을 연구하여 약간의 지견을 얻었다.
- P815세포 pellet에 RNAzolB을 첨가하여 세포를 용해시킨 후 chloroform 200 ㎕를 넣고 inverting 을 반복하여 고르게 섞은 다음 4℃에서 5분 동안 방치시키고, 이를 14,000 rpm에서 15분 동안 원심분리(4℃)하여 무색의 상층액 만을 400 ㎕ 취한 뒤 동량의 isopropanol을 넣고 inverting을반복하여 섞은 다음 4℃에서 15분 동안 방치시키고 14,000 rpm에서 15분 동안 원심분리(4℃)하여 얻은 pellet(RNA)에 75% ethanol(DEPC treated water) 500 ㎕를 넣어 15,000 rpm에서 15분 동안 원심분리(4℃)하고 ethanol을 완전히 제거한 후에 DEPC water 50 ㎕를 넣어서 RNA를 용해 하여 A260 ㎚에서 흡광도를 측정하여 RNA 함량을 계산하였다. 분리한 RNA에 해당 유전자들의 oligo dT primer와 DEPC water를 넣고 65℃ 에서 10분 동안 반응시킨 후 실온에서 3분 동안 방치한 다음 10 x buffer, 10 ㎜ dNTP, AMV Reverse transcriptase, 50 ㎜ ㎎ Cl2 및 DEPC treated water를 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응 시켜서 reverse transcriptase(RT) product를 만들었다. 만들어진 RT product(template cDNA) 를 사용하여 Real-Time PCR(Bio Rad)를 사용하여 측정하였다.
- 상층액을 C18 column에 시료용액(150 ㎕)을 trichloroacetic acid(1 M, 150 ㎕), HIAA(10 μM, 50 ㎕ 내부표준)를 가한 다음 10,000 rpm으로 원심 분리하였다. 상층액을 Millex-GV (0.2원심㎛)로 여과한 후 HPLC에 주입하여 serotonin 함량을 측정하였다.
- 세포 내부의 세로토닌 농도를 분석하기 위하여, 약물을 처리한 세포의 배지를 제거한후, 1 × PBS pH 7.2의 완충액을 이용하여 세포를 2번 세척하였다.
- DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)는 산화/환원 환경에 따라 색을 띄는 라디칼로 시료의 라디칼 제거능력을 측정 할 수 있다. 시료의 free radical 소거 활성은 stable radical인 DPPH에대한 환원력을 측정한 것으로, 시료를 Phosphate buffer에 녹여 100 ㎕에 200 ㎜ DPPH 900 ㎕를 shaking 한 후에 상온에서 10분간 방치 후에 Eppendorf tube에서 96-웰 플레이트의 각 웰에 분주하여 O.D 517 ㎜에서 측정 한다.(Blank : phosphate buffer, Control : phosphate buffer + DPPH ) Free radical scavenging activity(%) = [1-(Absorbance of test compound/Absorbance of control)] × 100.
대상 데이터
- FBS(Gibco-BRL, U.S.A), DMEM(Gibco-BRL, U.S.A), 10 ㎜ HEPES, 2 ㎜ L-glutamine, 1 ㎜ sodium pyruvate, 100 U/㎖ penicillin, 100 ㎍/㎖ streptomycin, 50 μM 2-mercaptoethanol, D-PBS dulbecco's phosphate buffered saline(Gibco-BRL, U.S.A), POTASSIUM PHOSPHATE DIBASIC, POTASSIUM PHOSPHATE MONOBASIC, Trypsin -EDTA(Gibco-BRL, U.S.A.), Isopropanol, 3-(4.5-dimethylthiazol-2yl)-2.5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide(MTT), NaOH, Dimethyl Sulfoxide(DMSO), DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)(Sigma, U.S.A), Trizol(Life Technologies, Gaithersburg), Superscript II reverse transcriptase(Life Technologies, Gaithersburg), IQ SYBR green supermix(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA), Berberine hydrochloride, Palmatine hydrochloride, Coralyne hydrochloride, L-tryptophan, 5-hydroxytryptophan, Catalase, DL-6-methyl-5,6,7,8-tetrahydropterin(4H-PT), Serotonin, Dithiothreitol 및 5-hydroxyindoleacetic acid(HIAA)(Sigma, U.S.A), 세포배양용 fetal calf serum 및 penicillin/streptomycin, DMEM배지 (Gibco, U.S.A), SOD assay kit(Dojindo, Japan), EAE(ethyl ascorbyl ether)(Cosmol. Korea)를 구입하여 사용하였으며, 기타 일반 시약은 특급 시약을 사용하였다.
- P815세포는 부산 대학교 의과대학(해부학 교실) 에서 분양 받았으며, 배양은 10% fetal calf serum, 100 unit/㎖ penicillin과 100 ㎍/㎖ streptomycin을 포함한 DMEM 배지, 10 ㎜ HEPES, 2 ㎜ L-glutamine, 1 ㎜ sodium pyruvate를 사용하여, cell culture용 dish에서 37℃, 5% CO2 상에서 배양하였다.
- 대조 유전자인 β-actin으로 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 加味逍遙散 약물은 대전대학교 부속한방병원에서 구입한 후 정선하여 사용하 였고, 처방 1첩(貼)의 내용과 분량은 Table I과 같다.
- 본 연구에 사용된 기기는 열탕추출기(대웅, Korea), Rotary vaccum evaporator(Büchi B-480, Switzerland), Freeze dryer(EYELA FDU-540, Japan), CO2 incubator(Forma scientific Co., U.S.A), Clean bench(Vision scientific Co., Korea), Autoclave (Sanyo, Japan), Micro-pipet(Gilson, France), Water bath(Vision scientific Co., Korea), Vortex mixer (Vision scientific Co., Korea), Spectrophotometer (Shimazue, Japan), Centrifuge(Sigma, U.S.A), Deep-freezer(Sanyo, Japan), Thermocycler system (MWG Biotech., Germany), Ice-maker(Vision scientific Co., Korea), Homogenizer(OMNI, U.S.A), Plate shaker(Lab-Line, U.S.A) 및 ELISA reader(Molecular Devices, U.S.A), C18역상 HPLC columne(Hypersil, U.S.A), HPLC(Shimazu, Japan)등의 기기를 사용하였다.
데이터처리
- 실험결과는 mean±standard error로 기록하였다.
- 유의성 검증은 Student's t-test를 이용하여 분석하였으며 P<0.05 이하에서 유의성을 검증하 였다.
이론/모형
- serotonin 함량은 HPLC-형광광도계법으로 측정하였다. 세포 내부의 세로토닌 농도를 분석하기 위하여, 약물을 처리한 세포의 배지를 제거한후, 1 × PBS pH 7.
- 각 유전자 발현 정도를 Real-Time PCR을 이용해 측정하였다. 각각의 유전자들의 염기 서열은 Table Ⅱ과 같다.
- 단백질함량은 각각의 시료중의 단백질 함량을 측정하여 보정하였으며, bovine serum albumin 을 표준물질로 하고 Bradford`s method를 이용 하여 측정하였다.
- 이후 세포증식을 MTT분석법에 의해서 분석하였다. MTT 분석법은 배양이 완료된 세포에 50 ㎍/㎖ MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)을 희석 처리하여 반응시킨 다음 Microplate reader로 570 ㎚에서 측정하였다.
성능/효과
- 1. SOD와 DPPH의 활성도는 대조군에 비하여 유의성 있게 증가하였다.
- 2. TPH-1 mRNA 발현은 100 ㎍/㎖ 실험군에서 대조군에 비하여 유의하게 감소하였다.
- 3. AAADC mRNA 발현은 모든 실험군에서 대조군과 비교하여 유의하게 감소하였다.
- DPPH를 이용한 유리 라디칼 소거 반응으로 加味逍遙散의 항산화 작용을 측정한 결과, 100 ㎍/㎖ 일 때, 17.18 ± 1.65의 DPPH radical 소거 작용을 나타났고, 10 ㎍/㎖ 일 때는 6.49 ± 2.59 의 DPPH radical 소거작용을 나타내 농도에 따라 유의성 있게 증가하였다(Table Ⅲ).
- SOD 활성을 측정한 결과, 100 ㎍/㎖에서는 17.18 ± 1.65 %, 10 ㎍/㎖는 6.49 ± 2.59 %, 1 ㎍/㎖에서는 5.51 ± 4.48 %, 로 나타나 농도에 따라 유의성 있게 증가하였다(Fig. 3).
- 加味逍遙散에 의한 AAADC mRNA 발현은 각각 0.0017 ± 0.0008 (50 ㎍/㎖ 加味逍遙散)과 0.0021 ± 0.0009 (100 ㎍/㎖ 加味逍遙散)으로 모두 대조군에 비해 유의하게 감소하였다(Fig. 5).
- 加味逍遙散에 의한 MAOa mRNA 발현은 각각 0.0008 ± 0.0001(50 ㎍/㎖ 加味逍遙散)과 0.0009 ± 0.0004(100 ㎍/㎖ 加味逍遙散)으로 나타나 대조군과 비교하여 유의한 차이가 없었다.
- 加味逍遙散에 의한 TPH-1 mRNA 발현은 각각 0.035 ± 0.0009(5 ㎍/㎖ 加味逍遙散)과 0.033 ± 0.0009 (100 ㎍/㎖ 加味逍遙散)으로 대조군에 비해 감소하였다.
- 加味逍遙散이 세포 내부의 세로토닌 농도에 미치는 영향을 분석하기 위하여, HPLC-형광광 도계 법으로 측정한 결과, 각각 1.57 ± 0.16 nmol/mg (20 μg/ml 加味逍遙散), 1.55 ± 0.12 nmol/mg (40 μg/ml 加味逍遙散), 1.58 ± 0.17 nmol/mg (60 μg/ml 加味逍遙散), 1.58 ± 0.15 nmol/mg (80 μg/ml 加味逍遙散)로 나타나 대조군의 1.53 ± 0.23 nmol/mg에 비하여 함량이 다소 증가했지만 통계적으로 유의하지 않았다(Table Ⅳ).
- 加味逍遙散이 세포내 serotonin 함량에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 P815 배양 세포에 加味 逍遙散을 처리한 후 HPLC-형광광도계법으로 측정한 결과, 각각 1.57 ± 0.16 nmol/mg(20 μg/ml 加味逍遙散), 1.55 ± 0.12 nmol/mg(40 μg/ml 加 味逍遙散), 1.58 ± 0.17 nmol/mg(60 μg/ml 加味 逍遙散), 1.58 ± 0.15 nmol/mg(80 μg/ml 加味逍 遙散)로 나타나 대조군의 1.53 ± 0.23 nmol/mg 에 비하여 함량이 다소 증가했지만 통계적으로 유의하지 않았다(Table Ⅳ).
- 본 실험에서 DPPH를 이용한 유리 라디칼 소거 반응으로 加味逍遙散의 항산화 작용을 측정한 결과, 100 ㎍/㎖ 일 때, 17.18 ± 1.65의 DPPH radical 소거작용을 나타났고, 10 ㎍/㎖ 일 때는 6.49 ± 2.59의 DPPH radical 소거작용을 나타내 농도에 따라 유의성 있게 항산화능이 증가하였다(Table Ⅰ).
- 본 실험에서 P815 세포를 加味逍遙散을 함유한 배지에서 2일 동안 배양한 후 세포 증식를 각각 측정한 결과, 加味逍遙散을 첨가 배양한 세포 대조군과 차이는 加味逍遙散 20 ㎍/㎖에서 101.46 ± 1.88로 加味逍遙散 60 ㎍/㎖에서 101.21 ± 4.37로 加味逍遙散 120 ㎍/㎖에서는 100.59 ± 1.95로 세포 증식에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다(Fig. 2).
- 본 실험에서 SOD 활성 측정결과, 100 ㎍/㎖ 에서는 17.18 ± 1.65%, 10 ㎍/㎖는 6.49 ± 2.59%, 1 ㎍/㎖에서는 5.51 ± 4.48%로 효능을 나타냈으며 농도 의존적으로 효능을 갖는 것으로 확인되어 加味逍遙散은 농도에 따라 유의성 있게 항산 화능이 증가하였다(Fig. 3).
- 이상의 실험결과를 종합하면 加味逍遙散은 항산화 효능은 있으나 P815세포내의 TPH, AAADC 활성을 억제하는 경향을 보여 세로토닌 분비에 긍정적인 영향을 주지 못하는 것으로 판단된다.
- 이처럼 TPH-1와 AAADC mRNA 발현에서 실험군이 대조군에 비해 감소한 것으로 보아 加 味逍遙散의 작용이 비만세포의 세로토닌을 억제 하는 경향이 있는 것을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 유리기(free-radical)로인한 산화 스트레스의 관점에서 본다면 분명 유의한 효과를 기대해볼만 하다. 향후 우울증의 병인론에 대한 지속적 연구와 임상적 응용이 필요 하다고 사료된다.
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