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제안 방법
- PCR 은 PCR premix kieBioneer, Korea)을 이용하여 25 pg template DNA와 유전자 특이 primer를 각각 10pM를 첨가하여 수행하였으며, PCR 반응조건은 Table 1과 같다. PCR이 끝난 후 증폭된 유전자 부위의 확인을 위해 ethidium bromide가 함유된 1.
- PCR 은 PCR premix kieBioneer, Korea)을 이용하여 25 pg template DNA와 유전자 특이 primer를 각각 10pM를 첨가하여 수행하였으며, PCR 반응조건은 Table 1과 같다. PCR이 끝난 후 증폭된 유전자 부위의 확인을 위해 ethidium bromide가 함유된 1.5% agarose 에서 확인하였다.
- TSA에 배양된 균주의 Genomic DNA 추출은 bacterial genomic DNA kit(Qiagen, Germany)을 이용하여 주출하였으며, PCR을 위한 template DNA로 사용하였다. PCR 은 PCR premix kieBioneer, Korea)을 이용하여 25 pg template DNA와 유전자 특이 primer를 각각 10pM를 첨가하여 수행하였으며, PCR 반응조건은 Table 1과 같다.
- [10]. 본 연구에서는 경북지역 내 브루셀라병 혈청검사 결과 양성우로 판정된 한우를 살처분하는 과정에 채취된 유방상림프절로부터브루셀라균을 분리하고, 분리된 균에 대한 생화학적 검사를 통하여 균형과 혈청형을 동정하였으며, 항생제 감수성 시험을 실시하였다.
- abortus biotype 1임이 확인되었다(Table 2). 분리된 야외주의 동정하기 위하여 분리된 야외주의분자유전 학적 기법을 수행하고자 확립된 BCSP, 및 BCSP31, 16S rRNA primer sets를 이용하여 표준균주인 B. abortus 544와 야외 분리균 15주를 공시하여 PCR을 실시하였다. 그 결과 공시된 primers 모두 BCSP는 711 bp, 16S rRNA는 905 bp, 그리고 BCSP31은 223 bp에서 증폭된 브루셀라균 특이 유전자 fragments가 각각 관찰 되 어 브루셀라 균임을 확인할 수 있었으며 (Figs.
- 분리된 야외주의 브루셀라균 동정과 subtype을 규명하기 위하여 PCR을 수행하였다. 브루셀라균 동정을 위해 브루셀라 균의 특이적인 유전자부위인 BCSP, BCSP31, 16S rRNA를 작제하였고, 브루셀라 균 subtype 을 규명하기위해 IS711 element(AMOS)에 기초하여 primer를 설계한 다음 제조회사(Bioneer, Korea)에 의뢰하여 제조하였다 [9, 10, 29] (Table 1).
- 위하여 PCR을 수행하였다. 브루셀라균 동정을 위해 브루셀라 균의 특이적인 유전자부위인 BCSP, BCSP31, 16S rRNA를 작제하였고, 브루셀라 균 subtype 을 규명하기위해 IS711 element(AMOS)에 기초하여 primer를 설계한 다음 제조회사(Bioneer, Korea)에 의뢰하여 제조하였다 [9, 10, 29] (Table 1).
- 브루셀라균 이외의 균의 성장을 억제하기 위한 선택배지는 앞서 보고한 논문을 참고하여 제조하였다 [7]. 브루셀라균의 일반적 배양에 사용되는 tryptic soy agar (TSA; USA)배지를 증류수에 넣고 가열하여 녹인 다음 에서 15분간 멸균한 후 50℃로 온도를 낮추고, 56℃에서 30분 동안 비동화 한 5% horse serum (Sigma, USA)을 무균적으로 첨가하여 사용하였고, 선택배지로서 polymyxin B 5 mg, bacitracin 25 mg, cycloheximide 100 mg, nalidixic acid 5 mg, nystatin 100 mg, 그리고 vancomycin 20 mg을 syringe filter(0.
- 브루셀라균의 일반적 배양에 사용되는 tryptic soy agar (TSA; USA)배지를 증류수에 넣고 가열하여 녹인 다음 에서 15분간 멸균한 후 50℃로 온도를 낮추고, 56℃에서 30분 동안 비동화 한 5% horse serum (Sigma, USA)을 무균적으로 첨가하여 사용하였고, 선택배지로서 polymyxin B 5 mg, bacitracin 25 mg, cycloheximide 100 mg, nalidixic acid 5 mg, nystatin 100 mg, 그리고 vancomycin 20 mg을 syringe filter(0.45 p.m; Coming, USA)로 여과하여 serum dextrose agar(SDA)에 첨가하여 사용하였다.
- 브루셀라병 방역실시요령 [3]에 따라 TAT에 의해 양성우로 판정된 한우 사육농가 5호의 23두를 살처분하는과정 중 유방상림프절을 채취한 후 냉장상태에서 실험실로 운반하여 림프절 주위의 지방조직을 손질하고 95% 에탄올에 담근 후 꺼내어 화염 멸균 한 후 균질화 하여 SDA 선택배지 에 도말 하였으며, 37℃, 10% CO2 조건하에서 3-5일간 배양하였다. 브루셀라균으로 의심되는투명하고 smooth한 원형집락(직경 약 2-4 mm)을 SDA 선택배지에 순수 배양한 후 시험에 사용하였다.
- 진단을 하는 것이 꼭 필요하다. 이번 실험에서는 브루셀라병 혈 청검사를 실시하여 시 험관응집 반응법 에 200배 이상의 혈청항체 역가를 보인 소를 대상으로 채취한 유방상림프절에서 브루셀라균을 분리하고 분리 균의 생물학적, 분자유전학적 성상을 규명하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 브루셀라병 혈청검사 결과 TAT에서 200배 이상의 혈청항체 역가를 보인 5개 한우농가의 23 두 중 15두로부터 브루셀라균을 분리하여 65%의 균 분리 보였고 이는 모두 B.
- 항균제 감수성 검사는 분리균 15주와 표준균주 Bnicella abortus 544를 Clinical and Laboratory Standards InstituteCCLSl, 2007)에 따라 디스크 확산 법으로 수행하였으며, 공시한 항균제는 BD(USA) 제품인 amikacin(30 pg), amoxicillin/clavulanic acid(20/10 jig), ampicillin(10 pg), bacitracin(10 U), cefaclor(30 μg), cefepime(30 μg), cephalothin(30 jig), ciprofloxacin(5 jig), colistin(10 jig), eiythromycin(15 jig), gentamycin(10 jig), kanamycin(30 pg), nalidixic acid(30 jig), neomycin(30 jig), norfloxacin (10 μg), penicillin(10 U), polymyxin B(300 U), rifampin(5jig), streptomycin(10 jig), tetracycline(30 jig), trimethoprim/ sullamethoxazole( 1.25/23.75 jig) 및 vancomycin(30 jig) 등 22종에 대하여 검사하였다. 판정은 CLSI(2007)의 Enterobacteriaceae 균에 대한 판정 기준에 준하여 실시하였다.
대상 데이터
- 3-5일간 배양하였다. 브루셀라균으로 의심되는투명하고 smooth한 원형집락(직경 약 2-4 mm)을 SDA 선택배지에 순수 배양한 후 시험에 사용하였다. 시험에사용한 표준주는 국립수의과학 검역원으로부터 분양 받은 B.
- 브루셀라균으로 의심되는투명하고 smooth한 원형집락(직경 약 2-4 mm)을 SDA 선택배지에 순수 배양한 후 시험에 사용하였다. 시험에사용한 표준주는 국립수의과학 검역원으로부터 분양 받은 B. abortus 544를 이용하였다.
- 혈청검사는 2008년도 경상북도 서부 지역 내 15호의한우농장을 대상으로 브루셀라병 혈청검사를 수행하여브루셀라병 감염이 확인된 한우 사육농장 5호를 선정하였고, 12개월 령 이상 소 277두를 채혈하여 본 실험에공하였다. 채혈한 혈액은 채혈 즉시 항응고제가 첨가되지 않은 플라스틱 재질의 진공 시험관에 옮겨 담고 가능한 한 시험관을 수평으로 일정시간 유지시켜 응고시킨 후 냉장상태로 실험실에 운반하였다.
이론/모형
- 분리균의 염색은 Modified Huckere Gram 염색법 [18] 에 따라 분리균을 염색하여 형태와 염색 상태를 관찰하였으며, 분리균의 집락 형태는 TSA에서 4일간 배양한것을 ciystal violet 염색을 통해 집락형태를 관찰하였다 [16]. 그 외의 acriflavine 시험과 유당 및 포도당 발효시험, 용혈성 검사, 운동성 시험, oxidase 시험, catalase 시험 및 crease 시험을 수행하여 야외주를 동정하였다 [7].
- 75 jig) 및 vancomycin(30 jig) 등 22종에 대하여 검사하였다. 판정은 CLSI(2007)의 Enterobacteriaceae 균에 대한 판정 기준에 준하여 실시하였다.
- 운반된 혈액을 3, 000 RPM에서 10분간 원심하여 혈청을 분리하였고 분리된 혈청은 56℃에서 30분간 비동화하여 혈청검사에사용하였다. 혈청검사는 결핵병 및 브루셀라병 방역실시요령 [3]에 의거 수행하였으며, 로즈벵갈 응집반응법 (RBT)과 시험관 응집반응법fW)을 이용하였다.
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