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- b)collision energy.
제안 방법
- 8-11) 천연물 함량에 대한 사전 탐색연구를 바탕으로 수행된 본 연구에서는 인동에 함유된 천연물 중에서 생리활성과 함량이 우수한 물질로 phenolic compounds 중에서 coniferin(1), iridoids로서 loganic acid(2), demethylsecologanol(3), sweroside(4), 그리고 loganin(5) 등 5종의 화합물을(Fig. 1) 표준물질로 선정하여 인동에 함유된 각 물질의 함량을 HPLC-DAD-ion trap-MS를 이용하여 동시 정량·정성 분석하는 최적의 분석법을 개발하였으며, 이를 활용하여 24종의 국내·외 지역에서 산출된 인동 활성 물질의 함량을 분석 비교하였다.
- 인동에 함유된 표준물질의 동정에 있어 HPLC-DAD를 통해서는 머무름 시간의 일치를 통한 chromatogram상의 시각적인 정보만을 얻을 수 있다. 그래서 HPLC-DAD-ion trap-MS를 통해 인동 시료에 함유된 표준물질의 머무름 시간과 m/z값 및 fragment의 패턴을 확인함으로써 시료내의 표준물질을 동정하였다(Fig 3, 4). Table VIII에 각 peak에 대한 분석결과를 나타내었다.
- 국내에서 현재 유통되고 있는 인동은 대부분 중국산과 국내산이며, 산지별 생리활성물질의 함량이 차이가 있음에도 불구하고 이를 비교분석할 만한 신뢰성 있는 자료가 부족하다. 그러므로 본 실험에서 확립한 최적의 분석법을 토대로 산지별 24종의 생리활성 물질을 분석하였다(Table IX). 분석결과 24종의 인동에 함유된 생리활성 물질의 함량은 대체적으로 불규칙적이었으며, 대체적으로 coniferin(1), loganic acid(2)와 demethylsecologanol(3)은 낮은 함량을 가졌고 sweroside(4)와 loganin(5)은 높은 함량을 가졌다.
- 본 실험은 HPLC-DAD-ion trap-MS를 이용하여 인동에 함유된 2종류, 5종의 생리활성물질의 동시분석법을 개발하였으며, 최적의 조건에 대한 평가로서 직선성, 범위, 검출한계, 정량한계, 정밀성과 정확성 등 여러 validation parameter들을 제시하였다. 또한 각 표준물질들의 정확한 동정을 위하여 HPLC-DAD-ion trap-MS를 이용하여 이를 확인하였고 이와 같이 확립한 최적의 분석법을 통하여 국내에 유통되고 있는 인동 24종의 활성성분 함량을 비교분석하였다.
- 본 실험은 HPLC-DAD-ion trap-MS를 이용하여 인동에 함유된 2종류, 5종의 생리활성물질의 동시분석법을 개발하였으며, 최적의 조건에 대한 평가로서 직선성, 범위, 검출한계, 정량한계, 정밀성과 정확성 등 여러 validation parameter들을 제시하였다. 또한 각 표준물질들의 정확한 동정을 위하여 HPLC-DAD-ion trap-MS를 이용하여 이를 확인하였고 이와 같이 확립한 최적의 분석법을 통하여 국내에 유통되고 있는 인동 24종의 활성성분 함량을 비교분석하였다.
- 분석 파장인 254 nm에서 각 표준물질의 흡광도에 따라 1~20 µg/ml의 농도 범위를 정하였다.
- 용매로서 메탄올(J. T. Baker, USA), 3차 증류수(J. T. Baker, USA)와 증류된 에탄올(Duksan, Korea)을 사용하였으며 이동상에 포름산(Wako, Japan)을 첨가하였다.
- 질량분석기는 HPLC(Agilent 1200 series)를 inlet으로 사용하였으며, m/z비 2000까지의 범위를 수용할 수 있는 Finnigan electrospray source가 결합된 Finnigan MAT LCQ Ion-trap mass spectrometer(San Jose, CA, USA)를 사용하여 분석하였고 software는 Xcalibur(Finnigan MAT)를 사용하였다. 질량분석의 조건은 각 표준물질의 최적의 감도를 고려해 물질별로 나누어 설정하였다(Table II).
- 질량분석기는 HPLC(Agilent 1200 series)를 inlet으로 사용하였으며, m/z비 2000까지의 범위를 수용할 수 있는 Finnigan electrospray source가 결합된 Finnigan MAT LCQ Ion-trap mass spectrometer(San Jose, CA, USA)를 사용하여 분석하였고 software는 Xcalibur(Finnigan MAT)를 사용하였다. 질량분석의 조건은 각 표준물질의 최적의 감도를 고려해 물질별로 나누어 설정하였다(Table II).
- 최적의 추출 방법을 확립하기 위해 70%, 100% 에탄올, 70%, 100% 메탄올을 사용하여 추출 · 분석함으로써 용매별 추출 효율을(Table III), 10, 20, 30, 60, 90분 각각 추출 · 분석함으로써 추출 시간별 추출 효율을(Table IV), sonication, reflux, vortex법으로 각 시료를 추출 · 분석함으로써 추출 방법별 추출 효율을 비교하였다(Table V).
- 표준시료는 검량선을 작성하기 위해 각각 메탄올로 희석하여 화합물을 1, 2, 4, 8, 15, 20 µg/ml으로 각 농도별 혼합 시료를 준비하였다.
대상 데이터
- 각 소재별 활성물질의 함량을 비교분석하기위해 사용된 국내산, 중국산의 24종 중 16종의 인동시료는 서울 경동시장, 대구 약전거리, 대전 한약거리에서 각각 원산지별로 구입하였으며, 나머지 8종은 식약청에서 제공받았다. 각 시료는 자연 건조시킨 후 분말형태로 마쇄하여, 분석시료로 사용하였다.
- 6 mm×150 mm)를 사용하였다. 이동상은 A 용매로 100% 3차 증류수와 B 용매 100% 메탄올로 각각 0.1% 포름산을 첨가하여 사용하였으며 용매계는 용매기울기 용리로서 Table I에 나타내었다.
- 인동 원시료는 자연건조 시켰다가 분말 형태로 마쇄한 후 사용하였다. 최적의 추출 방법을 확립하기 위해 70%, 100% 에탄올, 70%, 100% 메탄올을 사용하여 추출 · 분석함으로써 용매별 추출 효율을(Table III), 10, 20, 30, 60, 90분 각각 추출 · 분석함으로써 추출 시간별 추출 효율을(Table IV), sonication, reflux, vortex법으로 각 시료를 추출 · 분석함으로써 추출 방법별 추출 효율을 비교하였다(Table V).
이론/모형
- 추출 방법으로는 reflux법이 우수하였으나 sonication법과 vortex법과 비교한 편차는 크지 않았다. 그리하여 본 실험은 운용이 상대적으로 간편한 sonication법으로 수행하였다. 마쇄한 시료 200 mg에 70% 에탄올 10 ml을 넣은 후 30분간 sonication하여 추출한 뒤 이를 0.
- 시료 분석을 위한 HPLC는 Agilent 1200 series로서 autosampler, column oven, binary pump, DAD detector(Agilent Technologies, Waldbronn, Germany), degasser(Agilent Technologies, Tokyo, Japan)를 사용하였으며, software는 Agilent사의 Chemstation software(Agilent Technologies, Avondale, CA, USA)를 사용하였다. HPLC 조건으로 칼럼 오븐의 온도는 35 oC, 분석파장은 254 nm, 유속은 HPLC와 ion trap-MS 기계를 사용하여 유속은 0.
성능/효과
- 3 ml/min으로, 칼럼 오븐의 온도는 35 oC로 분석하였을 때 분석 시간 35분 이내에 모든 표준물질의 peak들이 분리되었다. 또한 각 compound들이 적절한 흡광도를 갖는 분석 파장을 탐색한 결과 254 nm에서 모든 표준물질의 peak들이 분석하기에 적절한 감도를 갖는 것을 알 수 있었다. Fig.
- 그러므로 본 실험에서 확립한 최적의 분석법을 토대로 산지별 24종의 생리활성 물질을 분석하였다(Table IX). 분석결과 24종의 인동에 함유된 생리활성 물질의 함량은 대체적으로 불규칙적이었으며, 대체적으로 coniferin(1), loganic acid(2)와 demethylsecologanol(3)은 낮은 함량을 가졌고 sweroside(4)와 loganin(5)은 높은 함량을 가졌다.
- 분석결과 각 표준물질은 상관계수 0.998에서 1.000의 값의 높은 직선성을 나타내었으며, 검출한계와 정량한계는 시그널 대 노이즈비 3 : 1과 10 : 1와, 검출 값의 표준편차와 검량선의 기울기에 근거하여 각각 0.250~1.098(µg/ ml), 0.757~3.327(µg/ml)의 높은 감도를 나타내었다.
- 서로 다른 5 종류의 생리활성물질을 동시에 분리하기 위해 여러 용매조건들을 시도한 결과 Shiseido사의 Capcell Pak ODS UG120(5 µm, 4.6 mm×150 mm)를 사용 시 이동상은 A 용매 100% 3차 증류수, B 용매 100% 메탄올로 각각 0.1% 포름산을 첨가하여 사용하였고, 유속은 HPLC와 ion trap-MS를 동시에 사용하여 분석할 수 있는 효율적인 유속인 0.3 ml/min으로, 칼럼 오븐의 온도는 35 oC로 분석하였을 때 분석 시간 35분 이내에 모든 표준물질의 peak들이 분리되었다.
- 인동 시료에 단계별 기지농도의 표준물질을 넣은 후 일간, 일내 반복 실험하여 표준물질의 회수율과 실험의 정밀성을 측정하였을 때 회수율은 최소 99.39%에서 최대 105.89%로서 높은 정확성을 나타냈으며 상대표준편차 (RSD)는 최소 0.14%에서 최대 3.28%로서 우수한 정밀성을 나타내었다(Table VII).
- 표준시료로 사용한 coniferin(1), loganic acid(2), demethylsecologanol(3), sweroside(4) 그리고 loganin(5)는 본 연구팀에 의해 인동으로부터 추출, 분리, 정제하여 UV, IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR 등을 통해 구조 동정되었으며 HPLC-DAD를 이용한 순도 실험 결과 95% 이상의 순수 물질임을 확인하였고 내부표준물질로 3,4,5-trihydroxy benzoic acid(Sigma-Aldrich, USA)를 사용하였다.
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