$MPP^+$로 유도된 SH-SY5Y신경세포 사멸에 대한 고분자성분제거 봉독약침액의 신경보호 효과 연구 Neuroprotective Effects of Bee Venom, which Removes High Molecular Elements against $MPP^+$-induced Human Neuroblastoma SH-SY5Y Cell Death원문보기
Objectives : The neuroprotective effects of bee venom (BV) have been demonstrated in many studies, but bee venom has many side effects. So we used sweet bee venom (SBV), which has high molecular elements removed to reduce the side effects. I examined the neuroprotective effect of sweet bee venom in ...
Objectives : The neuroprotective effects of bee venom (BV) have been demonstrated in many studies, but bee venom has many side effects. So we used sweet bee venom (SBV), which has high molecular elements removed to reduce the side effects. I examined the neuroprotective effect of sweet bee venom in 1-methyl-4-phenylpyridine ($MPP^+$)-induced human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Methods : To observe the possible toxicity of SBV itself, SH-SY5Y cells were treated with SBV in various concentrations for 3 h and $MPP^+$ in concentrations (1 and 5mM) for 24h. To investigate the protective effect of SBV against $MPP^+$ toxicity, SH-SY5Y cells were pretreated with vehicle or nontoxic concentrations of SBV for 3h and the cells were not washed, followed by incubation with respective concentrations of SBV and 1 mM $MPP^+$ for 24h. To investigate the protective effect of SBV against $MPP^+$ toxicity, SH-SY5Y cells were pretreated with vehicle or nontoxic concentrations of SBV for 3h and the cells were not washed, followed by incubation with respective of SBV(0.5%), 1 mM $MPP^+$, 5uM AKT inhibitor(LY984002) and 10uM ERK inhibitor(PD98059) for 24 h. The protective effect was measured by cell viability assay. To investigate the degree of apoptosis, caspase-3 enzyme activity was measured in control, $MPP^+$, SBV+$MPP^+$. Results : SBV (0.5%) pretreatment protected the SH-SY5Y cells against $MPP^+$-induced apoptotic cell death. The cell viability was higher in the SH-SY5Y cells that were pretreated with vehicle or nontoxic concentrations of SBV than those not pretreated. The caspase-3 activity was lower in the pretreated groups than these not pretreated. ERK and AKT enzymes have a role in the neuroprotective effects of the sweet bee venom. Conclusions : The results demonstrate that SBV has a protective effect on dopaminergic neurons against $MPP^+$ toxicity. This data suggest that SBV could be a potential therapeutic tool for neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease(PD).
Objectives : The neuroprotective effects of bee venom (BV) have been demonstrated in many studies, but bee venom has many side effects. So we used sweet bee venom (SBV), which has high molecular elements removed to reduce the side effects. I examined the neuroprotective effect of sweet bee venom in 1-methyl-4-phenylpyridine ($MPP^+$)-induced human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Methods : To observe the possible toxicity of SBV itself, SH-SY5Y cells were treated with SBV in various concentrations for 3 h and $MPP^+$ in concentrations (1 and 5mM) for 24h. To investigate the protective effect of SBV against $MPP^+$ toxicity, SH-SY5Y cells were pretreated with vehicle or nontoxic concentrations of SBV for 3h and the cells were not washed, followed by incubation with respective concentrations of SBV and 1 mM $MPP^+$ for 24h. To investigate the protective effect of SBV against $MPP^+$ toxicity, SH-SY5Y cells were pretreated with vehicle or nontoxic concentrations of SBV for 3h and the cells were not washed, followed by incubation with respective of SBV(0.5%), 1 mM $MPP^+$, 5uM AKT inhibitor(LY984002) and 10uM ERK inhibitor(PD98059) for 24 h. The protective effect was measured by cell viability assay. To investigate the degree of apoptosis, caspase-3 enzyme activity was measured in control, $MPP^+$, SBV+$MPP^+$. Results : SBV (0.5%) pretreatment protected the SH-SY5Y cells against $MPP^+$-induced apoptotic cell death. The cell viability was higher in the SH-SY5Y cells that were pretreated with vehicle or nontoxic concentrations of SBV than those not pretreated. The caspase-3 activity was lower in the pretreated groups than these not pretreated. ERK and AKT enzymes have a role in the neuroprotective effects of the sweet bee venom. Conclusions : The results demonstrate that SBV has a protective effect on dopaminergic neurons against $MPP^+$ toxicity. This data suggest that SBV could be a potential therapeutic tool for neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease(PD).
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
따라서 본 연구에서는 SBV의 MPP+로 유도된 신경독성에 미치는 영향과 사포사멸을 방어하는 기전에 대한 연구를 수행하였다.
본 실험에서는 세포의 신경보호효과의 기전을 알아보기 위해서 AKT, ERK enzyme을 측정하였는데 그 이유에 관해 알기 위해서 cell survival pathway에 대한 이해가 있어야 한다. PI3K-AKT kinase pathway가 그 핵심인데 AKT가 그 central player가 된다.
본 연구에서는 파킨슨 병 치료제로서의 SBV의 효과에 대한 기본연구로서 MPP+로 유발된 SH-SY5Y cell에 대한 신경보호효과를 알아보기 위해 실험한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
제안 방법
분화된 SH-SY5Y cell을 96-well plate에 1 × 104 cells/well의 농도로 24시간 배양했다. MPP+ 독성에 대한 SBV의 세포 보호효과 기전을 알아보기 위하여, SH-SY5Y cell에 1mM MPP+와 AKT(LY984002), ERK (PD98059) 억제제를 처치하기 3시간 전에 SBV를 각각의 농도로(10% SBV를 0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2.5, 5%로 희석하여) 사전 처치하고, 24시간 동안 배양하였다. MTT 용액은 0.
5, 5%의 농도로 3시간동안 처치하였고 MPP+는 1, 5 mM의 농도로 24시간 동안 처치하였다. MPP+ 독성에 대한 SBV의 세포 보호효과를 알아보기 위하여, SH-SY5Y cell에 1mM MPP+를 처치하기 3시간 전에 SBV를 각각의 농도로(10% SBV를 0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2.5, 5%로 희석 하여) 사전 처치하고, 24시간 동안 배양하였다.
SBV 자체의 가능한 독성을 알아보기 위해 SHSY5Y cell에 SBV를 여러 농도로(10% SBV를 0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2.5, 5%로 희석하여) 3시간동안 처치하였다. SBV의 cell viability을 측정한 결과 0%에서 viability를 1±0.
SBV 자체의 독성을 알아보기 위해 SH-SY5Y cell에 10% SBV를 0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2.5, 5%의 농도로 3시간동안 처치하였고 MPP+는 1, 5 mM의 농도로 24시간 동안 처치하였다.
5, 5%의 농도로 3시간동안 처치하였고 MPP+는 1, 5 mM의 농도로 24시간 동안 처치하였다. MPP+ 독성에 대한 SBV의 세포 보호효과를 알아보기 위하여, SH-SY5Y cell에 1mM MPP+를 처치하기 3시간 전에 SBV를 각각의 농도로(10% SBV를 0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2.5, 5%로 희석 하여) 사전 처치하고, 24시간 동안 배양하였다.
분화된 SH-SY5Y cell을 96-well plate에 1 × 104 cells/well의 농도로 24시간 배양했다. SH-SY5Y cell에 vehicle, SBV 또는 MPP+를 각각의 농도와 시간으로 처치하였다. MTT 용액은 0.
SH-SY5Y 세포에서 Sweet bee venom(SBV)과 MPP+ 의 농도별 세포생존율(cell viability)을 측정하기위해 MTT assay를 진행하였다. SBV 자체의 독성을 알아보기 위해 SH-SY5Y cell에 10% SBV를 0, 0.
5, 5%로 희석하여) 사전 처치하고, 24시간 동안 배양 하였다. caspase-3 활성은 Caspase 3 Assay Kit, Colorimetric의 매뉴얼에 따라 측정하였다. 용해된 세포를 10,000×g, 4℃에서 원심분리하여 얻은 상청액을 caspase-3 기질(Ac-Asp-Glu-Val-Asp-pNA(Ac -DEVD-pNA))의 혼합액에 넣고 37℃에서 2시간 반응시켰다.
그래서 Bee venom의 가장 큰 allergen인 PLA2를 포함한 효소를 제거한 봉독인 Sweet Bee venom을 개발하였으며 그 정제방법은 gel filtration chromatography와 propionic acid/urea polyacrylamide gel electrophoresis를 이용하여 분자량 10,000 이상의 성분을 제거하였다 14,15.
농도별로 3시간 전에 사전 처치 하고 MPP+를 처치한후 24시간 후에 cell viability를 측정 하였다. 그 결과 control군에서의 결과를 1±0.
사전연구에서 신경세포 보호에 효과가 있는 0.5% SBV를 처치하여 cell의 morphology를 비교하였다. 그 결과 MPP+만 처치한 군보다 SBV를 사전처치하고 MPP+를 처치한 군에서 세포위축, 세포형태의 불균형, 세포분리가 덜 보여 신경보호효과가 있음을 형태학적으로 확인할 수 있었다.
세포에 (독성)질환을 유발하기 위한 실험으로 1mM, 5mM MPP+를 24시간의 적정 농도와 시간을 선택하여 실험을 진행하였다. 그 결과 0mM에서 viability를 1±0.
대상 데이터
SH-SY5Y cells는 Korean cell line bank (Seoul, South Korea)에서 구입하였다. AKT (LY984002), ERK (PD98059) inhibitors는 cell signaling (Technology, Inc)에서 구입하였다.
Human neuroblastoma SH-SY5Y 세포는 10% fetal bovine serum (FBS)과 100unit/mL penicillin/streptomycin이 포함하는 minimal essential medium(MEM) 배지를 사용하여 한국세포주은행의 매뉴얼에 따라 37℃, 95% air 그리고 5% CO2 항온기에서 배양하였다. 배지는 2일에 한번 교체하였고, 4-5일에 한 번씩 계대 배양을 하였다.
고분자 성분제거 봉독약침인 SBV는 상지대학교 침구학교실(Gangwon-do, South Korea)에서 기증받아 사용하였다. Minimum essential medium과 fetal bovine serum은 Biopharmaceuticals (Deagu, Korea)에서 구입하였다. SH-SY5Y cells는 Korean cell line bank (Seoul, South Korea)에서 구입하였다.
Minimum essential medium과 fetal bovine serum은 Biopharmaceuticals (Deagu, Korea)에서 구입하였다. SH-SY5Y cells는 Korean cell line bank (Seoul, South Korea)에서 구입하였다. AKT (LY984002), ERK (PD98059) inhibitors는 cell signaling (Technology, Inc)에서 구입하였다.
본 실험에서는 apoptosis의 측정에 있어 caspase-3 enzyme을 사용하였다. 비정상적인 신경 세포의 사멸은 파킨슨 병의 중요한 기전으로 알려져 있으며, 생화학적으로 caspase 계열의 효소 활성을 필요로 한다.
데이터처리
Cell survival was measured by MTT assay. Data are expressed as relative value of control(1.0) For statistical evaluations One-way ANOVA analysis followed by Duncan test was performed.(***p<0.
Data are expressed as relative value of control(1.0) For statistical evaluations One-way ANOVA analysis followed by Duncan test was performed.(***p<0.
The relative capase-3 activity in the SBV + MPP+ group was lower than 1mM MPP+ group. For statistical evaluations, One-Way ANOVA anaylsis followed by Duncan test was performed.(***p<0.
모든 실험 결과는 3개 또는 그 이상의 그룹를 비교하여 평균±표준오차(standard error of mean; SEM)로 나타내었으며, 통계학적 분석은 One-Way ANOVA 방법을 사용하였고 Duncan 방법으로 사후검정하여 p값이 ≤0.05인 경우 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
The control group was treated with only saline. Cell survival was measured by MTT assay. Data are expressed as relative value of control(1.
SH-SY5Y에서 AKT와 ERK와 관련하여 SBV의 신경세포보호효과를 관찰하기 위하여 MTT assay를 통해 분석하였다. 분화된 SH-SY5Y cell을 96-well plate에 1 × 104 cells/well의 농도로 24시간 배양했다.
SH-SY5Y에서 MPP+ 의 독성에 대한 SBV의 신경세포보호효과를 확인하기 위하여 MTT assay를 통해 분석하였다. 분화된 SH-SY5Y cell을 96-well plate에 1 × 104 cells/well의 농도로 24시간 배양했다.
성능/효과
그 결과 control군에서의 결과를 1±0.05%로 하고 MPP+ 만 처치한 군에서는 0.57±0.04%, MPP++SBV 0.1%군은 0.80±0.01%, MPP++SBV0.25%군은 0.94± 0.09%, MPP++SBV0.5%군은 1.07±0.03%, MPP++ SBV1%군은 1.05±0.04%, MPP++SBV2.5%군은 1.00± 0.01%, MPP++SBV 5%군은 0.53±0.02%을 나타내었다.
1. SBV이 MPP+로 유도된 신경독성에 대해 일정 농도에서 신경보호효과가 있음을 알 수 있었다.
2. AKT와 ERK의 Inhibitor 처리시 SBV의 신경보호효과가 적어지는 것으로 보아 SBV의 효과에 AKT와 ERK pathway가 관련되어 있음을 알 수 있었다.
02%를 보였다. AKT와 ERK의 Inhibitor 처리시 SBV+MPP+의 처치한 군과의 비교했을 때 신경 보호효과가 적어지는 것으로 보아 SBV의 효과에 AKT와 ERK pathway가 관련되어 있음을 알 수 있었다.
Apoptosis 기전에 관여한다고 알려져 있는 enzyme 인 caspase-3의 활성화정도를 비교한 결과 control 군에서는 1±0.01%, MPP+군은 1.54±0.02%, SBV 전처리한 군은 1.14±0.01%을 나타내었다.
MPP+ 독성에 대한 SBV의 세포 보호효과를 알아보기 위하여, SH-SY5Y cell에 1mM MPP+와 5uM AKT 억제제(LY984002), 10uM ERK 억제제(PD98059)20를 처치하기 3시간 전에 SBV를 각각의 농도로(10% SBV를 0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2.5, 5%로 희석하여) 사전 처치하고, 24시간 동안 배양한 결과 control군에서 1±0.016149%, SBV0.5%군에서 1.02±0.03%, MPP+군에서 0.57±0.04%, SBV0.5%+ MPP+군에서 0.92±0.02%, SBV0.5%+LY+MPP+군에서 0.72±0.04%, SBV0.5%+PD+MPP+군에서 0.74 ±0.02%를 보였다.
MPP+는 control에 비해 caspase-3의 활성이 증가한 것을 확인 할 수 있었고 0.5% SBV + MPP+를 처치한 군에서는 MPP+군과 비교하여 caspase-3의 활성이 감소한 것으로 보아 cell을 보호하는 것으로 보인다.
SBV의 cell viability을 측정한 결과 0%에서 viability를 1±0.03%로 하였을 때 0.1%에서는 1.00±0.03%, 0.25%에서는 1.00±0.02%, 0.5%에서는 1.02±0.05%, 1%에서는 0.96±0.05%, 2.5%에서는 0.81 ±0.03%, 5%에서는 0.51±0.04%를 보여 높은 농도인 2.5%, 5%에서 세포 독성을 보이는 것을 확인하였다.
그 결과 0mM에서 viability를 1±0.03%로 하고 1mM에서 0.62± 0.04%, 5mM에서 0.57±0.03%가 나와 1mM의 농도가 실험을 하기에 적정한 농도임을 알 수 있었다
5% SBV를 처치하여 cell의 morphology를 비교하였다. 그 결과 MPP+만 처치한 군보다 SBV를 사전처치하고 MPP+를 처치한 군에서 세포위축, 세포형태의 불균형, 세포분리가 덜 보여 신경보호효과가 있음을 형태학적으로 확인할 수 있었다.
본 실험에서는 SBV의 전처치 이후 MPP+를 처리한 실험에서 MPP+만 처리한 군과의 비료를 통해 유의성 있는 세포활성도를 얻어 일정 농도 범위 내에서 신경보호효과가 있었음을 알 수 있었으며 그 기전에서도 아무것도 처리하지 않은 대조군, sweet bee venom 0.5%군, MPP+군, SBV + MPP+군, AKT inhibitor 처치군(SBV+LY+MPP+군), ERK inhibitor 처치군(SBV+PD+MPP+군)을 비교하여 SBV의 신경보호효과가 ERK, AKT와 일정 부분 관계가 있음을 밝혀내었다.
후속연구
그리고 이 실험의 한계와 앞으로의 연구방향은 SBV의 신경보호효과에 AKT와 ERK가 관련된다는 것을 in vitro 실험으로 관찰하였으므로, 향후 in vivo에서 효과가 있는지 연구가 시행되어야 하며 SBV의 임상적 가치를 확인하기 위하여 잘 디자인된 임상연구를 통해 임상적 효과를 확인할 필요가 있다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
파킨슨병은 무엇이 부족해져서 생기는 질환인가?
파킨슨병(parkinson's disease)은 뇌의 흑색질이 파괴되면서 신경전달물질 중의 하나인 도파민이부족해져서 운동완서, 진전, 강직 등의 증상이 생기는 신경계 퇴행성 질환이다. 파킨슨병은 1817년 James Parkinson이 흔들림성 마비 (shaking palsy)를 처음으로 기술하였고 1912년 Kinnier wilson에의하여 추체외로계 질환임을 알게 되었다1.
파킨슨병에 관한 연구들은 어떤 모델에서 주로 수행되는가?
파킨슨병에 관한 연구들은 신경독성을 이용하여만든 모델에서 주로 수행되고 있는데 catecholamine 성 신경만을 선택적으로 파괴하는 것으로 알려진 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydrophridine(MPTP)이 널리 사용되며, MPTP는 체내로 흡수되어 뇌혈관장벽을 통과하고 성상세포에서 monoamin oxidase B(MAO-B)에 의해 1-methyl-4phenylpyrinium(MPP+ )로 대사되어 기저핵의 흑질에 미토콘드리아의 전자전달계I (mitochondrial complex I)을 억제하여 세포독성을 통해 도파민신경세포를 손상시킨다7,8.
파킨슨병에 대해 어떠한 병리학적 요소가 중요한 역할을 하는가?
파킨슨병의 진단은 위의 세가지 증상 중에서 두가지가 있고 적절한 용량의 레보도파(levodopa)에 대하여좋은 반응을 보이는 경우 할 수 있으며 병리학적 으로 흑색질의 신경세포의 파괴가 도파민부족으로 인하여 발병한다고 보고 있고 흑질과 일부 특정 뇌간 핵에서 루이체가 존재하는 것이 핵심이다2-4. 이 때 여러가지 병리학적 요소가 중요한 역할을 하게 되는데 mitochondrial dysfunction, exitotoxicity, impaired protein degradation, inflammatory processes, oxidative stress 그리고 apoptosis가 그것이다5,6.
참고문헌 (37)
이광우. 임상신경학. 제3판. 서울: 법문사; 2002, p. 622-9.
Gelb DJ, Oliver E, Gilman S. Diagnostic criteria for Parkinson disease. Arch Neurol. 1999;56(1) :33-9.
Boris Ferger, Andreas Leng, Anna Mura, Bastian Heng Joram Feldon. Genetic ablation of tumor necrosis factor-alpha(TNF- $\alpha$ ) and pharmacolofical ingibition of TNF-synthesis attenuates MPTP toxicity in mouse striatum Journal of Neurochemistry. 2004;89:822-33.
Yacoubian TA, Standaert DG. Targets for neuroprotection in Parkinson's disease. Biochim Biophys Acta. 2008;1792(7):676-87.
Ramachandran B, Houben K, Rozenberg YY, Haigh JR, Varpetian A, Howard BD. Differential expression of transporters for norepinephrine and glutamate in wild type, variant, and WNT1 -expressing PC12 cells. J Biol Chem. 1993;268(32) :23891-7.
Lee P, Hur J, Lee J, Kim J, Jeong J, Kang I, Kim SY, Kim H. 15,16-dihydrotanshinone I suppresses the activation of BV-2 Cell, a murine microglia cell line, by lipopolysaccharide. Neurochem Int. 2006;48(1):60-6.
Yoo Jin Hwang, Geon Mok Lee, Woo Jun Hwang, Eun Mi Seo, Jong Deok Jang, Gui Bi Yang, Seung Hoon Lee, Byung Chul Lee. Clinical research of Bee-venom Acupuncture effects on Rheumatoid arthritis. The Journal of Korean Acupuncture & Moxibustion Society. 2001;18(5) :33-41.
Jae Do Jin, Young Il Shin, Byung Ryul Lee, Kyu Jung Hwang, Hyun Lee, Sang Gyun Han, Eun Jeong Bae, Hyun Yeul Cho, Min Kyu Shin, Gi Young Yang. A clinical study carried out common acupuncture therapy and Bee-Venom Acupuncture on HNP of L-spine. The Journal of Korean Acupuncture & Moxibustion Society. 2002;19(1) :54-64.
Kazuhiro Nakaso, Satoru Ito, Kenji Nakashima. Caffeine activates the PI3K/Akt pathway and prevents apoptotic cell death in a Parkinson's disease model of SH-SY5Y cells. Neuroscience Letters. 2008;432(2):146-50.
Rock RB, Peterson PK. Microglia as a pharmacological target in infectious and inflammatory diseases of the brain. J Neuroimmune Pharmacol. 2006;1(2):117-26.
Wilms H, Zecca L, Rosenstiel P, Sievers J, Deuschl G, Lucius R. Imflammation in Parkinson's diseases and other neurodegenerative diseases: cause and therapeutic implications. Curr Pharm Des. 2007;13(18):1925-8.
Van Kampen J, Robertson H, Hagg T, Drobitch R. Neuroprotective actions of the ginseng extract G115 in two rodent models of Parkinson's disease. Exp Neurol. 2003;184(1):521-9.
Cao F, Sun S, Tong ET. Experimental study on inhibition of neuronal toxical effect of levodopa by ginkgo biloba extract on Parkinson disease in rats. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. 2003;23(2):151-3.
Ramassamy C. Emerging role of polyphenolic compounds in the treatment of neurodegenerative diseases: a review of their intracellular targets. Eur J Pharmacol. 2006;545(1):51-64.
Chang SH, Phelps PC, Berezesberger IK, Ebersberger ML Jr, Trump BF. Studies on the mechanisms and kinetics of apoptosisinduced by microinjection of cytochrome c in rat kidney tubule eputhelial cells(NRK-52E). Am J Pathol. 2000;156:637-49.
Mattson MP, Furukawa K. Anti-apoptotic actions of cycloheximide: blockade of programmed cell death or induction of programmed cell life? Apoptosis. 1997;2:257-64.
Dudek H, Datta SR, Franke TF, Birnbaum MJ, Yao R, Cooper GM, Segal RA, Kaplan DR, Greengerg ME. Regulation of neuronal survival by the serine-threonine protein kinase Akt. Science. 1997;275:661-5.
Stanciu M, DeFranco DB. Prolonged nuclear retention of activated ERK promotes cell death generated by oxidative toxicity or proteasome inhibition in a neuronal cell line. J Biol Chem. 2002;277:4010-7.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.