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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 우선 신나무 수피의 galloyl glucitol 화합물(1-5)의 항산화 활성을 평가하기 위하여 DPPH 법을 이용한 free radical scavenging activity assay를 실시하였고 천연소재로써의 주요한 조건인 함유량을 알기 위하여 HPLC를 이용한 함량평가를 실시하였다.
제안 방법
- 신나무 수피의 항산화 활성 성분을 밝히기 위하여 80% acetone 추출물 및 분획물의 항산화 효능을 검색하였다. Free radical scavenging assay에 의한 항산화 활성의 측정에서 강력한 활성을 나타낸 분획을 각종 컬럼 크로마토그래피에 적용하여 5종의 화합물을 분리하였고 이화학적 성상 및 기기 분석적 방법으로 그 구조를 규명하였다. 분리된 화합물은 gallotannin인 6-galloyl-1,5-anhydroglucitol (ginnalin B) (1), 3,6-digalloyl-1,5-anhydroglucitol (acertannin) (2), methyl gallate (3), 2,6-digalloyl-1,5-anhydroglucitol (acertannin) (4), gallic acid (5)로 확인 동정하였다.
- High pressure liquid chromatography(HPLC)는 Waters 600 system (USA)을 이용하였으며, 세부적으로는 Pump : Waters 600 pump, Controller : Waters 600 controller, Detector : Waters 112 UV/VIS (280 nm), Column : Kromasil C18 HPLC column (Varian C18-HL, 5 µm, 250×4.6 mm), Data system : Autochro-Win 3.0 plus (Young-lin Co., Korea)을 각각 이용하였다.
- 9 ml을 가한다. 각 시료는 5가지 농도로 조제하였다. Vortex mixer 로 10초간 진탕한 후 37℃에서 30분 동안 incubation 시킨다.
- 각 표준용액을 200 µl 씩 취하여 5가지 표품들이 균일하게 섞인 표준용액으로 하여 5개 화합물이 동시에 잘 분리되는 HPLC chromatogram을 얻었고, 여기서 얻은 농도에 따른 peak area을 바탕으로 검량선을 작성하였다.
- 강력한 천연 항산화제로 평가되는 gallotannin인 6-galloyl1,5-anhydroglucitol (ginnalin B) (1), 3,6-digalloyl-1,5- anhydroglucitol (acertannin) (2), methyl gallate (3), 2,6- digalloyl-1,5-anhydroglucitol (acertannin) (4), gallic acid (5)의 신나무 수피중의 함량을 검토할 목적으로 HPLC를 이용하여 연구하였으며 화합물 1~5의 함량이 매우 높은 것을 알 수 있었다 (Table IV).
- 기기 및 시약 − 1H 및 13C-NMR spectra는 Gemini 2000 (300 MHz, 75 MHz)와 VNS (Varian, Palo Alto, CA, USA) (600 MHz, 125 MHz)로 측정하였고, Low resolution fast atom bombardment mass spectrum (LRFAB-MS)는 JMSAX505WA (JEOL, Tokyo, Japan)을 사용하였다.
- Free radical scavenging assay에 의한 항산화 활성의 측정에서 강력한 활성을 나타낸 분획을 각종 컬럼 크로마토그래피에 적용하여 5종의 화합물을 분리하였고 이화학적 성상 및 기기 분석적 방법으로 그 구조를 규명하였다. 분리된 화합물은 gallotannin인 6-galloyl-1,5-anhydroglucitol (ginnalin B) (1), 3,6-digalloyl-1,5-anhydroglucitol (acertannin) (2), methyl gallate (3), 2,6-digalloyl-1,5-anhydroglucitol (acertannin) (4), gallic acid (5)로 확인 동정하였다.
- 신나무 수피의 항산화 활성 성분 규명을 위하여 수피를 80% acetone으로 추출하고 Sephadex LH-20 column chromatography를 실시하여 sub-fraction 1~8으로 분획하였다. 항산화 효능 평가를 위하여 Free radical scavenging assay에서 positive control인 L-ascorbic acid와 비교하여 강력한 활성을 나타낸 sub-fraction 3~8 (Table II)을 대상으 로 Sephadex LH-20와 ODS-B gel column chromatography 및 MPLC system을 반복 실시하고, 일부 분획은 재결정 유도를 통해서 최종 5종의 gallotannin 화합물을 분리하였다.
- 신나무 수피의 항산화 활성 성분을 밝히기 위하여 80% acetone 추출물 및 분획물의 항산화 효능을 검색하였다. Free radical scavenging assay에 의한 항산화 활성의 측정에서 강력한 활성을 나타낸 분획을 각종 컬럼 크로마토그래피에 적용하여 5종의 화합물을 분리하였고 이화학적 성상 및 기기 분석적 방법으로 그 구조를 규명하였다.
- 신나무의 수피로부터 분리, 정제한 표품인 6-galloyl-1,5- anhydroglucitol (ginnalin B) (1), 3,6-digalloyl-1,5-anhydroglucitol (acertannin) (2), methyl gallate (3), 2,6-digalloyl1,5-anhydroglucitol (acertannin) (4), gallic acid (5)을 각각 1 mg을 정확히 취해 80% MeOH를 가하여 전체량이 1 ml가 되도록 하여 stock solution (1000 ppm)을 조제하였다. 이 stock solution을 희석하여 125, 250, 500, 1000 ppm 농도의 표준용액을 조제하였다.
- 양성 대조약물로는 L-ascorbic acid를 5가지 농도로 조제하여 측정하였다.
- 87 g) Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피를 이용하였다. 용매는 H2O-MeOH을 0%-100%까지 농도를 높였으며 TLC를 실시하여 8개의 분획 (Fr.1, Fr.2, Fr.3, Fr.4, Fr.5, Fr.6, Fr.7, Fr.8)으로 나누었다. Fr.
- 신나무의 수피로부터 분리, 정제한 표품인 6-galloyl-1,5- anhydroglucitol (ginnalin B) (1), 3,6-digalloyl-1,5-anhydroglucitol (acertannin) (2), methyl gallate (3), 2,6-digalloyl1,5-anhydroglucitol (acertannin) (4), gallic acid (5)을 각각 1 mg을 정확히 취해 80% MeOH를 가하여 전체량이 1 ml가 되도록 하여 stock solution (1000 ppm)을 조제하였다. 이 stock solution을 희석하여 125, 250, 500, 1000 ppm 농도의 표준용액을 조제하였다. 각 표준용액을 200 µl 씩 취하여 5가지 표품들이 균일하게 섞인 표준용액으로 하여 5개 화합물이 동시에 잘 분리되는 HPLC chromatogram을 얻었고, 여기서 얻은 농도에 따른 peak area을 바탕으로 검량선을 작성하였다.
- 분리된 5개 화합물에 대해서도 추출물 및 분획물에 적용한 방법과 동일한 방법인 free radical scavenging assay를 실시하여 항산화 활성을 측정한 결과 모든 화합물이 positive control인 L-ascorbic acid와 비교하여 강력한 활성을 나타냈으며, 특히 화합물 2와 4는 L-ascorbic acid에 비하여 약 2~4 배 이상의 높은 활성을 나타내었다 (Table II). 이렇게 강력한 항산화 활성을 나타낸 화합물의 함량을 HPLC 를 이용하여 정량 분석은 다음과 같이 실시하였다.
- 이에 본 연구에서는 신나무(Acer ginnala Maxim.)수피로부터 항산화 효과를 기반으로 한 activity guided isolation을 실시하여 5종의 gallotannin을 분리하였고 이들 화합물들의 항산화 활성을 평가하고 HPLC를 이용하여 함량을 분석하였다.
- 추출 및 분리 − 나무 수피 5.5 kg을 절단한 후 80% acetone으로 실온에서 3회 추출하여 여과하였다.
- 함량분석 − 신나무 수피를 건조하여 가루로 분쇄하고 2g을 취하여 80% MeOH 50 ml로 2~3시간씩 3회 가온 추출하여 이를 합한 후 여과하여 농축하고 그 농축액을 정확히 50 ml (80% MeOH)에 녹여 미지검액으로 하였다.
- 신나무 수피의 항산화 활성 성분 규명을 위하여 수피를 80% acetone으로 추출하고 Sephadex LH-20 column chromatography를 실시하여 sub-fraction 1~8으로 분획하였다. 항산화 효능 평가를 위하여 Free radical scavenging assay에서 positive control인 L-ascorbic acid와 비교하여 강력한 활성을 나타낸 sub-fraction 3~8 (Table II)을 대상으 로 Sephadex LH-20와 ODS-B gel column chromatography 및 MPLC system을 반복 실시하고, 일부 분획은 재결정 유도를 통해서 최종 5종의 gallotannin 화합물을 분리하였다.
- 화합물 1~5는 TLC plate상에서 10%-H2SO4 및 FeCl3 용액에 의한 발색과 1H, 13C-NMR, MS spectrum data를 기존 문헌과 비교하여 각각 일치함을 확인하여 각각 6-galloyl1,5-anhydroglucitol (ginnalin B) (1), 3,6-digalloyl-1,5- anhydroglucitol (acertannin) (2), methyl gallate (3), 2,6- digalloyl-1,5-anhydroglucitol (acertannin) (4), gallic acid (5)로 최종 동정하였다. 4-11)
대상 데이터
- 74 g)을 얻었다. Fr.8 (13.45 g 중 12.45 g)에 대해서 YMC ODS gel (MeOH, 50%), DaiSogel ODS-B with MPLC (H2O-MeOH, 20%-100%)를 통하여 2,6-digalloyl-1,5-anhydroglucitol (acertannin) (11.24 g)과 3,6-digalloyl-1,5-anhydroglucitol (ace-rtannin) (0.15 g)을 각각 얻었다.
- 실험 재료 − 신나무 (Acer ginnala Maxim.)는 2009년 8월 경기도 포천시에 위치한 국립수목원에서 제공받아 식물학적 감정한 후 사용하였으며, 표준품은 중앙대학교 약학대학 생약학 연구실에 보관하고 있다 (AGM2009-08).
- Column chromatography 용 충진제는 Sephadex LH-20 (10-25 µm, GE Healthcare Bio-Science AB, Uppsala, Sweden), ODS-B gel (40-60 µm, Daiso, Osaka, Japan)을 사용하였으며, Thin layer chromatography (TLC) plate는 pre-coated silica gel 60 F254 plate (Merck, Darmstadt, Germany)를 사용하였다. 항산화활성 측정용 시약인 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), L-ascorbic acid는 Sigma Aldrich(Milw., WI, USA)에서 구입하였고, 99.5% ethanol은 Merck (Darmstadt, Germany) 에서 구입하여 사용하였다. 흡광도는 ELISA reader (TECAN, Salzburg, Austria)를 사용하여 측정하였다.
데이터처리
- 각 표준용액을 200 µl 씩 취하여 5가지 표품들이 균일하게 섞인 표준용액으로 하여 5개 화합물이 동시에 잘 분리되는 HPLC chromatogram을 얻었고, 여기서 얻은 농도에 따른 peak area을 바탕으로 검량선을 작성하였다. 또한 실험의 재현성을 위해 반복실험을 통해서 표준용액과 신나무 수피 추출물 미지검액의 retention time의 평균과 표준오차를 구하였다.
성능/효과
- Free radical scavenging assay에 의한 분리된 화합물의 항산화 활성 검색 결과, 모든 화합물이 매우 우수한 활성을 보였으며, 특히 화합물 2와 4에서 높은 활성을 보였다.
- HPLC분석에 의한 미지검액의 chromatogram으로부터 신 나무 수피에서 분리된 gallotannin 1~5의 표준용액 검량선에 의하여 함량을 결정하였으며 매우 높은 함유량을 확인 할 수 있었다 (Fig. 5, Table V).
- 양성 대조약물로는 L-ascorbic acid를 5가지 농도로 조제하여 측정하였다. 각 시료의 항산화작용은 IC50치 (DPPH 래디칼 형성을 50%로 억제하는데 필요한 농도)로 나타내었다.
- 또한 표품 1~5 의 retention time과 미지검액중의 1~5의 retention time이 거의 동일함을 확인할 수 있었다 (Table IV).
- 본 실험에서는 C18 역상 column을 사용하여, 전개 분리되는 최적용매조건을 찾기 위하여 이동상으로 1% Acetic acidH2O와 1% Acetic acid-Acetonitrile을 여러가지 혼합비율로 혼합하여 그 분리능을 측정 검토한 결과, 용매조건은 1% Acetic acid-H2O : 1% Acetic acid-Acetonitrile = 100 : 0의 조성에서 시작하여 25분후 1% Acetic acid-H2O : 1% Acetic acid-Acetonitrile = 65 : 35인 gradient mode에서 분석이 잘 되었으며, 파장은 280 nm에서 최대 흡수파장을 나타내었다. 이러한 조건에서 화합물 1~5가 균일하게 섞인 표준용액 20 µl씩 취하여 5개 화합물이 동시에 잘 분리되는 HPLC chromatogram을 얻었고 (Fig.
- 분리된 5개 화합물에 대해서도 추출물 및 분획물에 적용한 방법과 동일한 방법인 free radical scavenging assay를 실시하여 항산화 활성을 측정한 결과 모든 화합물이 positive control인 L-ascorbic acid와 비교하여 강력한 활성을 나타냈으며, 특히 화합물 2와 4는 L-ascorbic acid에 비하여 약 2~4 배 이상의 높은 활성을 나타내었다 (Table II). 이렇게 강력한 항산화 활성을 나타낸 화합물의 함량을 HPLC 를 이용하여 정량 분석은 다음과 같이 실시하였다.
- 이러한 조건에서 화합물 1~5가 균일하게 섞인 표준용액 20 µl씩 취하여 5개 화합물이 동시에 잘 분리되는 HPLC chromatogram을 얻었고 (Fig. 2-4), 여기서 얻은 peak area와 농도의 관계로부터 검량선을 작성한 결과 25-200 ppm 의 농도범위에서 회귀 직선방정식은 화합물 1~5 각각 y=24.952x-195.94, y=36.751x+21.891, y=51.338x-110.3, y=47.214x-487.4, y=46.121x-214.46 이고, R-square값이 각각 0.991, 0.9999, 1, 0.9969, 0.9996 로서 1.0에 일치 혹은 근접하여 그 직선성이 인정되었다 (Fig. 5).
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