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카놀라유와 대두극도경화유로부터 효소적으로 합성된 저트랜스 스프레드 고체지의 특성
Development and Physical Properties of Low-Trans Spread Fat from Canola and Fully Hydrogenated Soybean Oil by Lipase-Catalyzed Synthesis 원문보기

한국식품영양과학회지 = Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition, v.39 no.9, 2010년, pp.1328 - 1334  

김영주 (충남대학교 식품공학과) ,  류현경 (충남대학교 식품공학과) ,  신정아 (충남대학교 식품공학과) ,  이기택 (충남대학교 식품공학과)

초록
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카놀라유와 대두극도경화유를 기질로 이용하여 저트랜스 스프레드 제조 시에 사용할 수 있는 LTSF을 효소적 interesterification 반응을 이용하여 합성하였고, 제조된 LTSF의 온도별 SFC 함량, 반응 후 TAG 조성의 변화 및 결정형을 살펴보았다. DSC를 이용한 SFC 분석결과, LTSF와 시중에서 유통되는 스프레드로부터 획득한 고체지간에 약 $20{\sim}35^{\circ}C$의 범위에서 유사한 고체지 함량을 보임에 따라 합성된 LTSF는 적합한 물성을 가지는 스프레드 제조 시에 사용할 수 있을 것으로 사료된다. LTSF의 지방산 조성은 C18:0 (29.2 wt%), C18:1(41.8 wt%), C18:2(13.3 wt%)가 전체 지방산 조성의 80% 이상 구성되어 있으며, 총 트랜스 지방산(${\Sigma}TFA$)의 함량은 시중 유통 스프레드 고체지보다 훨씬 적은 0.2 wt%로 미량 검출되었다. Sn-2 position에 분포된 지방산 조성은 C18:0(31.5 wt%), C18:1(41.4 wt%), C18:2(12.1 wt%)로 구성되었고, sn-1,3 position에 위치한 지방산 조성도 C18:0(28.1 wt%), C18:1(42.1 wt%), C18:2(13.9 wt%)로 구성되었다. Reversed-phase HPLC 분석결과, 카놀라유는 LOO와 OOO로 구성되어 있었으며, 대두극도경화유는 PSS와 SSS의 주된 TAG 조성을 나타내었다. 두 기질을 사용하여 대량 합성된 LTSF의 반응 전후 TAG 조성을 비교해 보면, LOO와 OOO, SSS는 반응 후 그 수치가 줄어든 반면, SOL과 SOO는 각각 2.3에서 19.4 area%로, 0.5에서 26.4 area%로 증가하였으며, 새로운 TAG로서 POS/PSP와 SOS가 각각 12.6 area%와 16.5 area% 정도 생성되었다. LTSF의 결정형태를 알아보기 위하여 polarized light microscopy와 x-ray diffraction 분석을 수행한 결과, 결정크기는 작고 조밀하여 부드러운 조직감을 나타낼 것으로 생각되며 일반적으로 마가린이 $\beta$'형일 때 바람직하다고 보고 된 바와 같이, 합성한 LTSF은 $\beta$형도 공존하지만 $\beta$'형이 우세하게 나타내어 스프레드의 물성에 적합할 것으로 사료된다.

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Low-trans spread fat (LTSF) was produced by lipase-catalyzed synthesis of canola (CO) and fully hydrogenated soybean oil (FHSBO) at 65:35 (w/w). Blend of CO and FHSBO with 65:35 ratio was interesterified using Lipozyme TLIM (immobilized Thermomyces lanuginosus, 20% of total substrate) in a 1 L-batch...

주제어

AI 본문요약
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제안 방법

  • Carrier gas로서 1 mL/min 유속의 N2를 사용하였고, injector와 detector 온도는 각각 250℃와 260℃로 설정하였으며, split ratio가 50:1로 설정된 GC에 준비된 지방산 메틸에스테르(fatty acid methyl ester, FAME) 1 μL를 주입하여 지방산 분석을 실시하였다.
  • LTSF 및 시중 유통 스프레드로부터 획득된 고체지의 polymorphic form을 비교 관찰하기 위하여 상온에서 multipurpose x-ray diffraction spectroscopy(D/Max-2200Ultima/PC, Rigaku International Corporation, Tokyo, Japan)를 이용하였다. Target은 Cu-Ka로 voltage 40 kV, current 40 mA로 작동하였으며, 회절 각도는(2θ) 12~32°로 하여 측정하였다.
  • LTSF와 반응기질(CO, FHSBO)의 TAG 조성 분석을 위하여 reversed-phase high performance liquid chromatograph(RP-HPLC) 분석을 실시하였다. 기기는 Younglin SP930D dual pump(Anyang, Korea)와 Nova-Pak®C18 60Å 4 μm(3.
  • , Waters, Milford, Ireland) column을 사용하였다. 검출기로 Sedex 75 evaporative light scattering detector(ELSD, Decere, Alfortvill, France)를 50℃, 1.7 bar로 설정하였고, 이동상은 기울기 용리로써 용매 A(acetonitrile)와 용매 B(isopropanol : hexane=2:1, v/v)를 유속 1 mL/min으로 흘려주었다. 시료는 10 mg을 chloroform 5 mL에 충분히 녹인 후 PTFE syringe filter(0.
  • 여기에 다시 BF3 용액 2 mL을 첨가하여 vortex 한 후 100℃ water bath에서 2분 동안 끓인 후 1~2분 동안 냉각하였다. 냉각한 시험관에 isooctane 2 mL과 포화 NaCl 용액 1 mL을 첨가하여 충분히 vortex 한 후, 두 층으로 분리한다음 상층만 취하였고, 이를 sodium sulfate column에 걸러 수분을 제거한 후 GC 분석을 하였다. GC(Hewlett-Packard 6890 series, Avondale, PA, USA) 분석을 위한 칼럼은 SPTM-2560(100 m×0.
  • 특히, 효소적 촉매를 이용한 에스테르 교환반응은 환경친화적이며, 온화한 반응조건에서 수행되어 부반응이 일어나지 않으며, 회수가 용이하여 재사용이 가능한 이점들이 있다(8). 따라서 본 실험에서는 저트랜스 반고체지(low-trans spread fat, LTSF)의 합성을 위하여 대두극도경화유(fully hydrogenated soybean oil, FHSBO)와 카놀라유(canola oil, CO)를 기질로 사용하여 효소적 에스테르교환반응을 수행하였다. 대두극도경화유는 85% 내외의 stearic acid(C18:0)를 함유하고 있는 대표적인 고체지로서, C18:0은 비록 포화지방산이기는 하지만 palmitic acid(C16:0)혹은 myristic acid(C14:0)에 비하여 총 콜레스테롤 수치를 낮추는 영양학적 효과가 있다고 보고되고 있다(12).
  • Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 모든 기기분석에는 HPLC grade 용매를 사용하였다.
  • 특히, SFC35℃는 입안에서의 녹는 정도와 관련이 있기 때문에 풍미에 중요하다(16). 반고체지는 입안에서의 녹는 감각적 특성이 중요하며 대부분 상온에서 보관하여 사용하기 때문에 20~35℃의 범위를 비교하였다. 이 온도범위에서 시중에서 유통되고 있는 스프레드로부터 획득된 고체지와 LTSF의 SFC는 각각 19.
  • 반응기질인 카놀라유와 대두극도경화유 및 합성된 LTSF의 반응 전후의 TAG 조성을 분석하였다(Fig. 2, Table 2).반응물의 TAG를 구성하는 지방산들의 길이 및 불포화도에 따라 partition number(PN)로 분리하여 분석한 결과, PN 44~54 범위에 다양한 TAG 조성들이 분포되어 있음을 알 수 있었다.
  • 본 연구에서는 이와 같이 C18:1의 함량이 높은 카놀라유와 대두극도경화유를 기질로 사용하여 TAG분자의 sn-1,3의 위치에 특이적으로 작용한다고 알려진 Lipozyme TLIM(immobilized lipase from Thermomyces lanuginosus)을 이용한 interesterification 반응을 통하여 저트랜스 스프레드 제조 시에 사용할 수 있는 스프레드 고체지(LTSF)를 합성 하였고, 제조된 LTSF의 온도별 고체지(solid fat content, SFC) 함량, 반응 후 TAG 조성의 변화 및 결정형(polymorphism)을 살펴보았다.
  • 유지의 온도별 고체지 함량(SFC)의 변화를 알아보기 위하여 DSC(model DSC 2010, TA Instruments, New Castle, DE, USA)로 분석하였다. 시료가 열을 방출하거나 흡수함으로써 얻어지는 열량변화를 분석하였고, 이때 시료(5~10 mg)는 aluminum pan에 취하여 분석하였으며, calibration을 위한 baseline과 reference로서 빈 pan을 이용하였다. 흡열(melting) 및 발열(crystallization) thermogram을 얻기 위하여 80℃에서 10분 동안 유지한 다음 10℃/min의 비율로 -60℃까지 냉각하여 10분 동안 유지한 후 다시 80℃까지 5℃/min의 비율로 승온하였다.
  • 시료를 thin-layer chromatography(TLC, 20×20 cm, Merck, Darmstadt, Germany)를 통하여 전개된 TAG band를 획득하여 methylation을 실시하였으며, 그 방법은 다음과 같다.
  • 효소적 interesterification에 사용된 Lipozyme TLIM은 Thermomyces lanuginosus로부터 획득한 lipase를 granulated-silica gel에 고정화한 효소로서, Novozymes사(Bagsvaerd, Denmark)에서 구입하여 사용하였다. 시중에서 유통되는 스프레드부터 획득된 고체지(fat from commercial spread)는 fresh buttery taste spread(L사)를 녹인 후 general purpose centrifuge(420 g, 10분)를 사용하여 두 층으로 나눈 후, 상층액을 취하여 sodium sulfate column을 통과하여 수분을 제거하여 획득하였으며, LTSF와의 물성 비교 분석을 위하여 사용하였다. 지방산 분석에 사용된 10% BF3-methanol은 Supelco(Bellefonte, PA, USA)에서 구입하였고, sn-2 position의 지방산 분석에 사용된 pancreatic lipase(Type Ⅱ, crude)는 Sigma-Aldrich Chemical Co.
  • 적정이 끝난 후에 온수(70~80℃)를 첨가하여 물층이 맑아질 때까지 수세를 몇 차례 반복하여 soap을 완전히 제거하였다. 여기에 n-hexane과 ethanol을 첨가하여 hexane층과 물층이 완전히 분리되도록 충분히 정치시킨 후 hexane층(상층)을 sodium sulfate column에 통과하여 수분 및 불순물을 제거하였다. 이를 질소가스로 용매를 완전히 제거하고 다음 분석을 위하여 냉동 보관(-30℃)하였다.
  • 유지의 온도별 고체지 함량(SFC)의 변화를 알아보기 위하여 DSC(model DSC 2010, TA Instruments, New Castle, DE, USA)로 분석하였다. 시료가 열을 방출하거나 흡수함으로써 얻어지는 열량변화를 분석하였고, 이때 시료(5~10 mg)는 aluminum pan에 취하여 분석하였으며, calibration을 위한 baseline과 reference로서 빈 pan을 이용하였다.
  • 반응 후 filter paper를 이용하여 진공 상태에서 효소를 분리한 후 제거하였다. 유지의 탈산은 반응물에 0.5 N 페놀프탈레인 지시약을 3~4방울 첨가한 후 2 N KOH 에탄올 용액으로 종말점인 분홍색이 될 때까지 적정하였다. 적정이 끝난 후에 온수(70~80℃)를 첨가하여 물층이 맑아질 때까지 수세를 몇 차례 반복하여 soap을 완전히 제거하였다.
  • 전개용매는 n-hexane : diethyl ether : acetic acid의 50:50:1(v/v/v)을 사용하여 TLC(20×20 cm, Merck) 분석을 수행하였으며, 2-monoacylglycerol(MAG) band만 취한 후 앞서 기술한 methylation 전처리를 통하여 GC 분석을 실시하였다.
  • 카놀라유와 대두극도경화유를 65:35(w/w) 비율로 1-L stirred batch type reactor에서 double jacket의 항온수조를 70℃로 유지하여 24시간 반응하였다. 효소는 Lipozyme TLIM으로 전체 반응기질의 중량대비로 20 wt%를 사용하였으며 stirrer motor(MS-3060D, Mtops, Seoul, Korea)에 impeller(길이 9 cm, 폭 3 cm)를 장착하여 500 rpm으로 유지함으로써 충분히 기질 및 효소를 교반하였다.
  • 카놀라유와 대두극도경화유를 기질로 이용하여 저트랜스스프레드 제조 시에 사용할 수 있는 LTSF을 효소적 interesterification 반응을 이용하여 합성하였고, 제조된 LTSF의 온도별 SFC 함량, 반응 후 TAG 조성의 변화 및 결정형을 살펴보았다. DSC를 이용한 SFC 분석결과, LTSF와 시중에서 유통되는 스프레드로부터 획득한 고체지간에 약 20~35℃의 범위에서 유사한 고체지 함량을 보임에 따라 합성된 LTSF는 적합한 물성을 가지는 스프레드 제조 시에 사용할 수 있을 것으로 사료된다.
  • 합성된 LTSF 및 시중 유통 스프레드로부터 획득된 고체지의 crystal microstructure를 비교, 관찰하기 위하여 polarized light microscopy(Leica DMLB upright microscope, Wetzlar, Germany)를 이용하여 분석하였다. 시료는 70℃에서 완전히 녹인 후 약 10 μL 취하여 slide glass에 떨어뜨린 후 cover glass로 시료를 덮어 실온(약 20℃)에서 결정형이 형성될 때까지 3시간 동안 냉각한 후 관찰하였다.
  • 합성된 LTSF와 시중 유통 스프레드로부터 획득한 고체 지의 위치별(sn-1,3과 sn-2) 지방산조성 분석을 위하여 pancreatic lipase에 의한 가수분해 분석을 실행하였다. 시험관에 약 7 mg의 시료와 1 M Tris-HCl buffer(pH 7.
  • 합성된 LTSF와 시중에서 유통되는 스프레드부터 획득된 고체지의 지방산조성 분석을 위하여 gas chromatograph(GC) 분석을 실시하였다. 시료를 thin-layer chromatography(TLC, 20×20 cm, Merck, Darmstadt, Germany)를 통하여 전개된 TAG band를 획득하여 methylation을 실시하였으며, 그 방법은 다음과 같다.
  • 카놀라유와 대두극도경화유를 65:35(w/w) 비율로 1-L stirred batch type reactor에서 double jacket의 항온수조를 70℃로 유지하여 24시간 반응하였다. 효소는 Lipozyme TLIM으로 전체 반응기질의 중량대비로 20 wt%를 사용하였으며 stirrer motor(MS-3060D, Mtops, Seoul, Korea)에 impeller(길이 9 cm, 폭 3 cm)를 장착하여 500 rpm으로 유지함으로써 충분히 기질 및 효소를 교반하였다. 반응 후 filter paper를 이용하여 진공 상태에서 효소를 분리한 후 제거하였다.

대상 데이터

  • 기기는 Younglin SP930D dual pump(Anyang, Korea)와 Nova-Pak®C18 60Å 4 μm(3.9×150 mm I.d., Waters, Milford, Ireland) column을 사용하였다.
  • 본 연구에서 합성된 LTSF와 시중에 유통되고 있는 스프레드로부터 획득된 고체지와의 온도별 SFC 변화를 Fig. 1에 나타내었다. SFC10℃, SFC20℃ 및 SFC35℃는 반고체지류의 유동학적 특성과 밀접하게 관련됨으로써 중요하다.
  • Target은 Cu-Ka로 voltage 40 kV, current 40 mA로 작동하였으며, 회절 각도는(2θ) 12~32°로 하여 측정하였다. 시료는 미리 상온에서 24시간 이상 보관한 후 실험에 사용하였다.
  • (Seoul, Korea)에서 제공하였다. 효소적 interesterification에 사용된 Lipozyme TLIM은 Thermomyces lanuginosus로부터 획득한 lipase를 granulated-silica gel에 고정화한 효소로서, Novozymes사(Bagsvaerd, Denmark)에서 구입하여 사용하였다. 시중에서 유통되는 스프레드부터 획득된 고체지(fat from commercial spread)는 fresh buttery taste spread(L사)를 녹인 후 general purpose centrifuge(420 g, 10분)를 사용하여 두 층으로 나눈 후, 상층액을 취하여 sodium sulfate column을 통과하여 수분을 제거하여 획득하였으며, LTSF와의 물성 비교 분석을 위하여 사용하였다.

이론/모형

  • 유지의 crystal morphology를 분석하기 위하여 polarized light microscopy를 이용하였다. Fig.
  • Carrier gas로서 1 mL/min 유속의 N2를 사용하였고, injector와 detector 온도는 각각 250℃와 260℃로 설정하였으며, split ratio가 50:1로 설정된 GC에 준비된 지방산 메틸에스테르(fatty acid methyl ester, FAME) 1 μL를 주입하여 지방산 분석을 실시하였다. 한편, GC-FID 상에서의 분석은 각 지방산의 메틸에스테르이므로 해당지방산으로 전환을 위한 각 지방산 전환계수 및 반응계수(response factor, Ri)는 식품의약품안전청에서 제시한 표와 계산식(14)을 이용하였다.
  • 전개용매는 n-hexane : diethyl ether : acetic acid의 50:50:1(v/v/v)을 사용하여 TLC(20×20 cm, Merck) 분석을 수행하였으며, 2-monoacylglycerol(MAG) band만 취한 후 앞서 기술한 methylation 전처리를 통하여 GC 분석을 실시하였다. 한편, sn-1,3의 지방산 조성은 Fomuso와 Akoh(15)의 계산식을 사용하였으며, 계산식은 다음과 같다.
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질의응답

핵심어 질문 논문에서 추출한 답변
식물성 반고체지는 어떤 장점이 있는가? 일반적으로 마가린은약 80%의 지방을 함유하고 있지만 최근에는 80% 미만의 지방 함량을 가지는 저지방 팻 스프레드류가 특히 미국시장에서 많이 상용화되고 있다(3). 일반적으로 식물성 반고체지는 부분 경화 가공을 하여 식물성 액상유에 비해 산화에 대한 안정성을 증가시키고 유통기한을 연장시킬 수 있다는 장점이 있다(4). 그러나 수소경화 과정 중에 생성되는 트랜스지방산의 위해성 논란으로 유지가공업계에서는 트랜스 지방산의 발생을 저감화하기 위한 목적으로 부분 수소경화 과정을 대체할 수 있는 방법을 모색하고 있다(5).
트랜스 지방산의 섭취가 많아질수록 인체에 어떤 영향을 미친다고 보고되고 있는가? 그러나 수소경화 과정 중에 생성되는 트랜스지방산의 위해성 논란으로 유지가공업계에서는 트랜스 지방산의 발생을 저감화하기 위한 목적으로 부분 수소경화 과정을 대체할 수 있는 방법을 모색하고 있다(5). 최근 연구에 따르면, 트랜스 지방산의 섭취가 많아질수록 혈중 LDL-콜레스테롤 수치를 증가하면서 HDL-콜레스테롤 수치는 감소시키는 등의 혈장 지단백질 조성에 부정적 영향을 끼치면서, 관상동맥 질환의 발생과 밀접한 관계가 있음이 보고되고 있다(6). 이에 따라 WHO(세계보건기구)에서는 가공식품 중 트랜스지방의 섭취량을 하루에 2000 kcal를 섭취한다고 했을 때, 트랜스지방 2.
화학적 또는 효소적 촉매를 이용한 에스테르 교환반응이 대두되고 있는 이유는 무엇인가? 화학적 또는 효소적 촉매를 이용한 에스테르 교환반응을 수행하면, 유지를 구성하고 있는 triacylglycerol(TAG) 분자 안에서 글리세롤에 결합되어 있는 지방산들의 조성 및 결합 위치를 무작위 또는 선택적으로 변화시키거나 또는 새로운 지방산들의 결합을 수행하여 새로운 물성을 지니는 유지를 합성할 수 있다(8-11). 특히, 효소적 촉매를 이용한 에스테르 교환반응은 환경친화적이며, 온화한 반응조건에서 수행되어 부반응이 일어나지 않으며, 회수가 용이하여 재사용이 가능한 이점들이 있다(8). 따라서 본 실험에서는 저트랜스 반고체지(low-trans spread fat, LTSF)의 합성을 위하여 대두극도경화유(fully hydrogenated soybean oil, FHSBO)와 카놀라유(canola oil, CO)를 기질로 사용하여 효소적 에스테르교환반응을 수행하였다.
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참고문헌 (20)

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  3. Jung MY. 2001. Soybean oil refining and processing for industrial usage (margarine and spread). Korea Soybean Digest 18: 47-56. 

  4. Kim YM, Heo OS, Lee KT. 2007. Analysis of trans fatty acid and crude fat contents of bakery foods in Chungcheong province. J East Asian Soc Dietary Life 17: 540- 546. 

  5. Lumor SE, Jones KC, Ashby R, Strahan G, Kim BH, Lee GC, Shaw JF, Kays SE, Chang SW, Foglia TA, Akoh CC. 2007. Synthesis and characterization of canola oil-stearic acid-based trans-free structured lipids for possible margarine application. J Agric Food Chem 55: 10692-10702. 

  6. Hwang PY, Kim YM, Lee KT. 2007. Comparison of the bakery products made commercial fat or low trans fat. J East Asian Soc Dietary Life 17: 64-71. 

  7. Gil BI, Rho JH. 2007. Hazardous effect of dietary trans fats on human health and regulations. Korean J Soc Food Cookery Sci 23: 1015-1024. 

  8. Shin JA, Akoh CC, Lee KT. 2009. Production and physicochemical properties of functional-butterfat through enzymatic interesterification in a continuous reactor. J Agric Food Chem 57: 888-900. 

  9. Kim JY, Lee KT. 2009. Enzymatic synthesis of low trans fats using rice bran oil, palm stearin and high oleic sunflower seed oil. J Korean Soc Food Sci Nutr 38: 470-478. 

  10. Kim JY, Lee KT. 2009. Characterization of scaled-up low-trans shortening from rice bran oil and high oleic sunflower seed oil with batch type reactor. J Korean Soc Food Sci Nutr 38: 338-345. 

  11. Kim NS, Lee KT. 2004. Enzymatic synthesis of structured lipids containing conjugated linoleic acid from extracted corn and peanut oil. J Korean Soc Food Sci Nutr 33: 1000-1005. 

  12. Mensink RP. 2005. Effects of stearic acid on plasma lipid and lipoproteins in humans. Lipids 40: 1201-1205. 

  13. Jang YS. 2002. Prospect and situation of quality improvement in oilseed rape. Korean J Crop Sci 47: 175-185. 

  14. KFDA. 2006. Department of food standardization, labeling of trans fats. Korea Food & Drug Administration, Seoul, Korea. p 2-10. 

  15. Fomuso LB, Akoh CC. 2003. Lipase-catalyzed acidolysis of olive oil and caprylic acid in a bench-scale packed bed bioreactor. Food Res Int 35: 15-21. 

  16. Osorio NM, Fonseca MMR, Ferreira-Dias S. 2006. Operational stability of Thermomyces anuginose lipase during interesterification of fat in continuous packed-bed reactors. Eur J Lipid Sci Technol 108: 545-553. 

  17. Ribeiro APB, Grimaldi R, Gioielli LA, Goncalves LAG. 2009. Zero trans fats from soybean oil and fully hydrogenated soybean oil: physico-chemical properties and food applications. Food Res Int 42: 401-410. 

  18. Widlak N, Hartel R, Narine S. 2001. Crystallization and solidification properties of lipids. In Polymorphism and Texture of Fats. deMan JM, deMan L, eds. AOCS Press, Champaign, IL, USA. p 225-235. 

  19. Lee JH, Akoh CC, Lee KT. 2008. Physical properties of trans-free bakery shortening produced by lipase-catalyzed interesterification. J Am Oil Chem Soc 85: 1-11. 

  20. D’Souza V, deMan JM, deMan L. 1990. Short spacings and polymorphic forms of natural and commercial solid fats: a review. J Am Oil Chem Soc 67: 835-843. 

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