본 연구에서는 조직확장 응용을 위한 생체적합성생분해성하이드로젤을 제조하고, 그 기본특성을 분석하였다. 친수성 고분자인 poly(ethylene glycol)의 양 말단에 다양한 몰비의 D,L-lactide와 glycolide를 개환 중합시켜 PLGA-PEG-PLGA 삼중공중합체를 합성한 뒤 비닐기를 도입하여 하이드로젤 제조 시 swelling/degradation controllers(SDC)로 사용하였다. 합성한 SDC와 PEG diacrylate를 사용하여 라디칼 중합으로 제조한 하이드로젤은 건조된 상태에서도 유연하고 탄성을 보였으며 분해테스트에서는 SDC의 조성과 SDC/PEG의 몰비에 따라 다양한 팽윤지연시간과 분해기간을 갖는 것으로 나타났다. 그 밖에 기계적 물성과 팽윤압력을 측정하였고, 이식시험을 통해 이식용 하이드로젤을 사용목적에 맞게 이식하거나 삽입하였을 때의 생체 조직의 국소적인 병리적 양상을 육안관찰과 현미경적 관찰을 통하여 평가하였다.
본 연구에서는 조직확장 응용을 위한 생체적합성 생분해성 하이드로젤을 제조하고, 그 기본특성을 분석하였다. 친수성 고분자인 poly(ethylene glycol)의 양 말단에 다양한 몰비의 D,L-lactide와 glycolide를 개환 중합시켜 PLGA-PEG-PLGA 삼중공중합체를 합성한 뒤 비닐기를 도입하여 하이드로젤 제조 시 swelling/degradation controllers(SDC)로 사용하였다. 합성한 SDC와 PEG diacrylate를 사용하여 라디칼 중합으로 제조한 하이드로젤은 건조된 상태에서도 유연하고 탄성을 보였으며 분해테스트에서는 SDC의 조성과 SDC/PEG의 몰비에 따라 다양한 팽윤지연시간과 분해기간을 갖는 것으로 나타났다. 그 밖에 기계적 물성과 팽윤압력을 측정하였고, 이식시험을 통해 이식용 하이드로젤을 사용목적에 맞게 이식하거나 삽입하였을 때의 생체 조직의 국소적인 병리적 양상을 육안관찰과 현미경적 관찰을 통하여 평가하였다.
In this study, we prepared and evaluated a series of biocompatible and biodegradable block copolymer hydrogels with a delayed swelling property for tissue expander application. The hydrogels were synthesized via a radical crosslinking reaction of poly(ethylene glycol) (PEG) diacrylate and poly(D,L-l...
In this study, we prepared and evaluated a series of biocompatible and biodegradable block copolymer hydrogels with a delayed swelling property for tissue expander application. The hydrogels were synthesized via a radical crosslinking reaction of poly(ethylene glycol) (PEG) diacrylate and poly(D,L-lactide-co-glycolide)-poly(ethylene glycol)-poly(D,L-lactide-co-glycolide)(PLGA-PEG-PLGA) triblock copolymer diacrylate as a swelling/degradation controller (SDC). For the synthesis of various SDCs that can lead to different degradation and swelling properties, various PLGA-PEG-PLGA triblock copolymers with different LA/GA ratios and different PLGA block lengths were synthesized and modified to have terminal acrylate groups. The resultant hydrogels were flexible and elastic even in the dry state. The in vitro degradation tests showed that the delayed swelling properties of the hydrogels could be modulated by varying the chemical composition of the biodegradable crosslinker (SDC) and the block ratio of SDC/PEG. The histopathologic observation after implantation of hydrogels in mice was performed and evaluated by macrography and microscopy. Any significant inflammation or necrosis was not observed in the implanted tissues. Due to their biocompatibility, elasticity, sufficient swelling pressure, delayed swelling and controllable degradability, the hydrogels could be useful for tissue expansion and other biomedical applications.
In this study, we prepared and evaluated a series of biocompatible and biodegradable block copolymer hydrogels with a delayed swelling property for tissue expander application. The hydrogels were synthesized via a radical crosslinking reaction of poly(ethylene glycol) (PEG) diacrylate and poly(D,L-lactide-co-glycolide)-poly(ethylene glycol)-poly(D,L-lactide-co-glycolide)(PLGA-PEG-PLGA) triblock copolymer diacrylate as a swelling/degradation controller (SDC). For the synthesis of various SDCs that can lead to different degradation and swelling properties, various PLGA-PEG-PLGA triblock copolymers with different LA/GA ratios and different PLGA block lengths were synthesized and modified to have terminal acrylate groups. The resultant hydrogels were flexible and elastic even in the dry state. The in vitro degradation tests showed that the delayed swelling properties of the hydrogels could be modulated by varying the chemical composition of the biodegradable crosslinker (SDC) and the block ratio of SDC/PEG. The histopathologic observation after implantation of hydrogels in mice was performed and evaluated by macrography and microscopy. Any significant inflammation or necrosis was not observed in the implanted tissues. Due to their biocompatibility, elasticity, sufficient swelling pressure, delayed swelling and controllable degradability, the hydrogels could be useful for tissue expansion and other biomedical applications.
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제안 방법
1, 3, 9주에 이식물 A와 이식물 B를 각각 이식한 마우스를 각각 3 마리씩 안락사시켰다. 이식된 부분의 피하조직이 포함되게 피부를 벗긴 다음 펴서 여과지에 붙이고 2% formaldehyde가 담긴 용기에 조직샘플을 넣어 shaking시키며 고정한 다음, 9주째 모든 조직 샘플을 분석하였다.
154 M HC1 을 첨가하였다. 24시간 후 tip에 힘(Newtons)을 가하고 이 힘은 10 초에 한번씩 측정하였다. 모든 시료가 손상(crack) 이 일어나 측정되는 값이 줄어들 때까지 계속하여 힘을 측정하였고, 가해진 힘이 최대에 도달되었을 때 팽윤된 하이드로젤의 접촉 단면으로 나누어 압력을 구하였다.
) 를 이용하여 탄성과 응력 완화를 측정하였다.37 디스크모양의 하이드로젤 시료를 digital calipers을 사용하여 횡단면 넓이와 높아를 계산한 후 실험을 시행하였다 1/2 inch(12.7 mm) radius dacron tip은 0.5 mm/sec의 속도로 시료에 압력을 가하였고 하이드로젤이 20%의 변형률이 일어나도록 하여 60초 동안 유지한 후 팁을 제거하였다 탄성률은 탄성체가 탄성한계 내에서 가지는 응력과 변형의비로 정의되므로 대략 0~2%의 작은 변형이 일어났을 때 응력과 변형의 비의 변화를 측정하여 탄력성을 알아보았다. 응력완화는 순간적으로가한 변형을 일정하게 유지할 때 물체 내부의 응력이 시간경과에 따라감소하는 현상이고 흐}이드로젤의 응력완화는 다음의 식으로 정의하였다.
In vitro 분해시험. 7개의 하이드로젤 시료를 사용하여 in vitro 분해 테스트를 진행하였다. 분해테스트를 하는 동안 팽윤도를 측정함으로써 시료의 가수분해 거동을 분석하였고 결과는 Figure 3에 나타내었다 하이드로젤은 처음 팽윤시 건조된 무게의 6〜 17배의 팽윤도를 보였고 친수성 고분자인 PEG의 함랑이 높을 수록 비교적 높은 초기 팽윤비를 나타내었다 실험은 매일 새로운 증류수로 교체되었고 수일이 지난 후 하이드로젤은 생분해성 사슬의 가수분해에 기인하여 팽윤비가 다시 증가하는 2차 팽윤을 보였다 Figure 4 (a) 에 하이드로젤의 분해과정을 그림으로 나타내었고 건조상태와 분해과정의 하이드로젤을 시간에 따른 형태 변화 사진을 Figure 4(b) 에서 보여주고 있다.
고분자의 분자량 및 분자량 분포는 GPC (Agilent 1100 series, USA) 를 통하여 분석하였다. GPC는 RI 탐지기, quaternary 펌프와 두 개의 컬럼 (PLgel 5 pm MIXED-D & E columns) 을 장착하였으며, PEG< 기준 시료로 하여 1 mL/miii의 유속으로 측정하였다. 이동상 용매는 THF를 이용하였으며 컬럼과 탐지기의 온도는 모두 35±0.
20 ppm (CH of LA) (e) 에서 확인되었다. NMR 분석을 통한 PLGA의 분자량 계산은 PEG의 CH2에대한 LA의 CH 피크(또는 GA의 CH?피H) 의 proton면적 비를 비교하여 계산하였다. Figure 2(b) 에 나타난 피크를 보면 3=5.
침전된 고분자를 여과 및 분류하여 실온의 진공오븐에서 24 시간 건조하여 합성물을 얻었다. PEG에 대한 LA와 GA의 반응비율을 다르게 첨가하여 다양한 블록길이의 PLGA-PEG-PLGA을 합성하였다.
합성된 공중합체는 말단의 하이드록시 그룹을 아크릴레이트 그룹으로 치환시켰으며 합성 과정은 Figure 1에 나타내었다. PLGA-PEG-PLGA를 합성할 때 PLGAM PEG 사이의 몰비를 다양하게 하여 삼중블록 공중합체의 블록크기를 조절하였다. 또한 PLGA의 조성은 LA와 GA의 몰비를 변화시켜 조절하였고 합성된 두 종류의 삼중블록 공중합체에서의 LA/GA비는 1/1과 4/1 로 얻어졌으며, 수득률은 각각 77%, 88%이었다.
GA-PEG-PLGA/PEG 블록 공중합체 히이드로젤의 제조 PLGA- PEG-PLGA diacrylate와 PEG diacrylate의 일정량을 5 mL의 DMSO에 녹였다. 고분자 총 농도를 10 wt%로 맞추고 AIBN(17.5 mg, 0.11 mmol) 을 첨가한 후 고분자 용액을 microcentrifuge tube 에 나누어 담고 60 ℃의 오븐 안에서 12시간 동안의 라디칼 중합에의해 삼차원 망상구조를 가진 하이드로젤을 제조하였다. 제조된 하이드로젤을 에탄올에 담가 미반응물을 제거한 후 진공오븐에서 24시간동안 건조하였다.
합성된 PLGA-PEG-PLGA와 PLGA-PEG-PLGA- DA의 화학적 조성은 1H NMR (JNM—AL400 spectrometer, Jeol Ltd, Akishima, Japan) 과 FTIRCNicolet, UAS) 로 확인하였다. 고분자의 분자량 및 분자량 분포는 GPC (Agilent 1100 series, USA) 를 통하여 분석하였다. GPC는 RI 탐지기, quaternary 펌프와 두 개의 컬럼 (PLgel 5 pm MIXED-D & E columns) 을 장착하였으며, PEG< 기준 시료로 하여 1 mL/miii의 유속으로 측정하였다.
관찰된 조직반응의 정도 및 특성을 육안적으로 대조부위와 비교하여 기록하였다. 고정한 샘플을 마이크로톰을 이용하여 3~6 jim 두께의 절편을 만들었으며 he matoxylin and eosine (H&E) staining으로 염색 후, 현미경으로 피하조직상태를 관찰하였다.40
측정하고, 이식부위의 사진을 찍었다. 관찰된 조직반응의 정도 및 특성을 육안적으로 대조부위와 비교하여 기록하였다. 고정한 샘플을 마이크로톰을 이용하여 3~6 jim 두께의 절편을 만들었으며 he matoxylin and eosine (H&E) staining으로 염색 후, 현미경으로 피하조직상태를 관찰하였다.
24시간 후 tip에 힘(Newtons)을 가하고 이 힘은 10 초에 한번씩 측정하였다. 모든 시료가 손상(crack) 이 일어나 측정되는 값이 줄어들 때까지 계속하여 힘을 측정하였고, 가해진 힘이 최대에 도달되었을 때 팽윤된 하이드로젤의 접촉 단면으로 나누어 압력을 구하였다. 모든 측정은 세 번씩 이루어졌고 평균값으로 최대 팽윤압력을 최종적으로 결정하였다.
모든 시료가 손상(crack) 이 일어나 측정되는 값이 줄어들 때까지 계속하여 힘을 측정하였고, 가해진 힘이 최대에 도달되었을 때 팽윤된 하이드로젤의 접촉 단면으로 나누어 압력을 구하였다. 모든 측정은 세 번씩 이루어졌고 평균값으로 최대 팽윤압력을 최종적으로 결정하였다.
PLGA-PEG-PLGA 삼중공중합체 5 g을 질소 기류하에서 two- neck 둥근바닥 플라스크에 넣고 benzene 30 mL로 녹였다. 미리 계산된 양의 triethylamine (0.69 g, 6.87mmol) 과 acryloyl chloride (0.62 g, 6.87 mmolX 용액에 넣고 80 ℃에서 3시간 반응시킨 후여과지로 triethylamine hydrochloride를 여과하였다. 여과된 반응용액은 차가운 khexane에 침전시키고 침전용액을 감압 여과하여걸러진 반응물을 실온에서 24시간 진공 건조시켜 합성물을 얻었다.
본 실험에서는 국제표준화기구 기준(ISO 10993-6)에 제시된 변수들 중, 피하이식 후 평가 가능한 몇 가지 변수를 평가하였다. 이식물 접촉 부위의 캡슐화 정도와 염증의 정도는 4단계(minimal, slight, moderate, marked) 로 평가하였고 대식세포의 뭉침 (conglomerate)의 유무도 관찰하였다.
하이드로젤은 친수성 고분자인 PEG와생분해성 고분자인 PLGA-PEG-PLGA를 기본 블록으로 사용하였고 vinyl 그룹을 도입한 후 라디칼 중합에 의해 제조하였4: PLGA-PEG- PLGA 삼중공중합체는 DLTactide와 glycolide 의 반응 몰비를 변화시켜 다양한 분자량을 합성하였으며 말단을 아크릴레이트 그룹으로치환시켜 하이드로젤 제조 시 swelling/degradation controllers (SDC) 로 사용하였다. 생분해성 고분자로 이루어진 SDC는 가수분해에 의해 분해가 일어나고 SDC의 종류에 따라 분해가 일어나는 시간을 조절할 수 있다 제조한 하이드로젤은 생분해성, 팽윤특성, 기계적 물성, 삼투압 등의 여러 특성을 평가하고 이식시험을 통해 국제표준화기구기준에 따라 이식용 하이드로젤을 사용목적에 맞게 이식하거나 삽입하였을 때 생체 조직의 국소적인 병리적 양상을 육안관찰과 현미경적 관찰을 통하여 전반적으로 평가하였다.
이식물은 이식 전에 UV를 15분간 조사하고 PBS는 고압증기멸균 처리하여 멸균상태를 유지하였으며, 절개 시 감염을 막기 위해 무균상태에서 시행하고 이식부위의 외상을 최소화 하도록 하였다. 시술후에 봉합사를 사용하여 절개 부위를 봉합하고 절개부위를 소독하였다 분해/흡수될 수 있으므로 이식부위를 비침투성 피부 marker를 이용하여 표시하였다.39
실험동물을 무작위로 2군으로 구분하고 각각 이식물 A와 이식물 B 를 이식하였으며, 이식기간에 따라 1, 3, 9주차 군으로 나누어 실험을 진행하였다. 면도기로 각 마우스의 등 부위의 털을 깎고 완전한 무균조건에서 이식물와 대조군 등의 피하부분에 이식하였다.
이식 후 마우스에 대한 이식물의 영향을 알아보기 위해 몸무게와 체온을 측정하고, 이식부위의 사진을 찍었다. 관찰된 조직반응의 정도 및 특성을 육안적으로 대조부위와 비교하여 기록하였다.
안락사시켰다. 이식된 부분의 피하조직이 포함되게 피부를 벗긴 다음 펴서 여과지에 붙이고 2% formaldehyde가 담긴 용기에 조직샘플을 넣어 shaking시키며 고정한 다음, 9주째 모든 조직 샘플을 분석하였다.
지남에 따라 더욱 돌출되었다. 이식물 B군 중 3주 동안의 이식기간을 갖는 2마리의 마우스가 이식 후 10일과 14일이 지나고 돌연사하였다. 9주 동안의 이식기간을 갖는 이식물 B군이 3마리 모두 건강한 것으로 보아 이식물에 의한 사망은 아닌 것으로 사료된다.
이식물 접촉 부위의 캡슐화 정도와 염증의 정도는 4단계(minimal, slight, moderate, marked) 로 평가하였고 대식세포의 뭉침 (conglomerate)의 유무도 관찰하였다.41
기계적 물성 측정. 제조된 PLGA-PEG-PLGA/PEG 하이드로젤의 기계적 물성을 알아보기 위해 texture analyzer (TAX? plus, Texture Technologies Corp.) 를 이용하여 탄성과 응력 완화를 측정하였다.37 디스크모양의 하이드로젤 시료를 digital calipers을 사용하여 횡단면 넓이와 높아를 계산한 후 실험을 시행하였다 1/2 inch(12.
면도기로 각 마우스의 등 부위의 털을 깎고 완전한 무균조건에서 이식물와 대조군 등의 피하부분에 이식하였다. 척추를 기준으로 등의 오른쪽 부위에 이식물을 삽입하고 왼쪽 부위에는 대조군인 PBS를 주입하였다. 이식물을 삽입할 때에는 오른쪽 등의 중앙부를 세로로 절개하고 터널을 만들어 이식물을 절개부의 양쪽으로 이식하였다.
65 g)를 넣은 뒤 감압 후 질소를 들여보내는 과정을 3회 반복하고 마지막은 진공 상태로 만들어 주었다 진공상태의 two-neck flask를 140 ℃에서 교반하며 5시간 동안 반응시킨 후 합성된 고분자를 실온으로 냉각시킨 다음 methylene chloride 30 mL로 용해시키고 과량의 차가운 diethyl ether에 침전시켰다. 침전된 고분자를 여과 및 분류하여 실온의 진공오븐에서 24 시간 건조하여 합성물을 얻었다. PEG에 대한 LA와 GA의 반응비율을 다르게 첨가하여 다양한 블록길이의 PLGA-PEG-PLGA을 합성하였다.
팽윤비의 변화와 하이드로젤의 무게 손실은 일정 시간마다 측정하였다 모든 측정은 3번씩 측정하여 무게의 평균값과 오차를 계산하였다(average ± SD).
확인하였다. 하이드로젤의 기계적 물성을 알아보기 위해 탄성률과 응력완화를 측정하였고 시료 1은 높은 탄성률을 가져 다소 단단했다. 그 외의 다른 시료들은 모두 낮은 탄성률을 가졌고 비슷한 기계적 물성으로 건조된 상태에서도 자르는 것이 쉬웠다.
특성분석. 합성된 PLGA-PEG-PLGA와 PLGA-PEG-PLGA- DA의 화학적 조성은 1H NMR (JNM—AL400 spectrometer, Jeol Ltd, Akishima, Japan) 과 FTIRCNicolet, UAS) 로 확인하였다. 고분자의 분자량 및 분자량 분포는 GPC (Agilent 1100 series, USA) 를 통하여 분석하였다.
대상 데이터
라디칼 개시제로서 2, 2'-azobisisobutyronitrile (AU3N) 은 Jimsej Chemicals (Japan) 에서 구입하였으며 methanol 에서 1회 재결정하여 사용하였다. D, L-Lactide(LA)와이ycolide (GA) 는 Polysciences에서 구입하였으며 ethyl acetate에서 1.회 재결정하여 사용하였다 Methylene chloride, n-hexane, methanol, diethyl ether, ethanol은 Samchun Chemicals (Korea) 에서 구입하였고, sodium phentobarbital(Entobar®) 은 한림제약(한국)에서 구입하였으며, 다른 시약들은 별도의 정제과정 없이 시용히였다.
시약 및 재료. Poly (ethylene diacrylate) (PEG-DA, Mn=700), PEG diol(M= 1500), stannous 2-ethylhexanoate(stannous octoate), acryloyl chloride (Ac), triethylamine (TEA), toluene, benzene, dimethyl sulfoxide (DMSO)는 Sigma-Aidrich에서 구입하였다. 라디칼 개시제로서 2, 2'-azobisisobutyronitrile (AU3N) 은 Jimsej Chemicals (Japan) 에서 구입하였으며 methanol 에서 1회 재결정하여 사용하였다.
Poly (ethylene diacrylate) (PEG-DA, Mn=700), PEG diol(M= 1500), stannous 2-ethylhexanoate(stannous octoate), acryloyl chloride (Ac), triethylamine (TEA), toluene, benzene, dimethyl sulfoxide (DMSO)는 Sigma-Aidrich에서 구입하였다. 라디칼 개시제로서 2, 2'-azobisisobutyronitrile (AU3N) 은 Jimsej Chemicals (Japan) 에서 구입하였으며 methanol 에서 1회 재결정하여 사용하였다. D, L-Lactide(LA)와이ycolide (GA) 는 Polysciences에서 구입하였으며 ethyl acetate에서 1.
본 연구에서는 조직확장기 응용분아에 적용하기 위한 새로운 생분해성 하이드로젤을 제조하였다. 하이드로젤은 친수성 고분자인 PEG와생분해성 고분자인 PLGA-PEG-PLGA를 기본 블록으로 사용하였고 vinyl 그룹을 도입한 후 라디칼 중합에 의해 제조하였4: PLGA-PEG- PLGA 삼중공중합체는 DLTactide와 glycolide 의 반응 몰비를 변화시켜 다양한 분자량을 합성하였으며 말단을 아크릴레이트 그룹으로치환시켜 하이드로젤 제조 시 swelling/degradation controllers (SDC) 로 사용하였다.
이식시험. 수컷 마우스(balb/c, 20±2 g, 6주령) 18마리를 중앙실험동물(주) (한국)로부터 구입하였다 실험전까지 1주일 이상 동물실에서 안정시킨 후 실험하였으며, 충남대학교의 실험동물의 관리와 사용에 관한 지침을 준수하여 취급하였다. 이식물은 제조된 하이드로젤 A (PLGA-PEG-PLGA:PEG= 1:2) 와 B (PLGA-PEG-PLGA: PEG=1:1) 을 두께 1 mm, 지름 6 mm의 얇은 원기둥 모양으로 절단하여 준비하였다.
수컷 마우스(balb/c, 20±2 g, 6주령) 18마리를 중앙실험동물(주) (한국)로부터 구입하였다 실험전까지 1주일 이상 동물실에서 안정시킨 후 실험하였으며, 충남대학교의 실험동물의 관리와 사용에 관한 지침을 준수하여 취급하였다. 이식물은 제조된 하이드로젤 A (PLGA-PEG-PLGA:PEG= 1:2) 와 B (PLGA-PEG-PLGA: PEG=1:1) 을 두께 1 mm, 지름 6 mm의 얇은 원기둥 모양으로 절단하여 준비하였다.
하이드로젤을 제조하였다. 하이드로젤은 친수성 고분자인 PEG와생분해성 고분자인 PLGA-PEG-PLGA를 기본 블록으로 사용하였고 vinyl 그룹을 도입한 후 라디칼 중합에 의해 제조하였4: PLGA-PEG- PLGA 삼중공중합체는 DLTactide와 glycolide 의 반응 몰비를 변화시켜 다양한 분자량을 합성하였으며 말단을 아크릴레이트 그룹으로치환시켜 하이드로젤 제조 시 swelling/degradation controllers (SDC) 로 사용하였다. 생분해성 고분자로 이루어진 SDC는 가수분해에 의해 분해가 일어나고 SDC의 종류에 따라 분해가 일어나는 시간을 조절할 수 있다 제조한 하이드로젤은 생분해성, 팽윤특성, 기계적 물성, 삼투압 등의 여러 특성을 평가하고 이식시험을 통해 국제표준화기구기준에 따라 이식용 하이드로젤을 사용목적에 맞게 이식하거나 삽입하였을 때 생체 조직의 국소적인 병리적 양상을 육안관찰과 현미경적 관찰을 통하여 전반적으로 평가하였다.
성능/효과
이식물 B군 중 3주 동안의 이식기간을 갖는 2마리의 마우스가 이식 후 10일과 14일이 지나고 돌연사하였다. 9주 동안의 이식기간을 갖는 이식물 B군이 3마리 모두 건강한 것으로 보아 이식물에 의한 사망은 아닌 것으로 사료된다.
또한 PLGA의 조성은 LA와 GA의 몰비를 변화시켜 조절하였고 합성된 두 종류의 삼중블록 공중합체에서의 LA/GA비는 1/1과 4/1 로 얻어졌으며, 수득률은 각각 77%, 88%이었다. NMR로 분석한결과 수평균분자량은 각각 2170, 1990이었으며, 그 값은 GPC 측정분자량 값이%=2140 and 1940) 과 거의 유사함을 확인하였다. 그리고, 두 개의 합성된 고분자의 분자량 분포는 GPC 분석을 통해 좁은 분산도 (PDK1.
Swelling/degradation controller (SDC) 로써 PLGA-PEG-PLGA-DA와 PEG-DA를 기본 블록으로 사용하여 라디칼 중합에 의해 다양한 하이드로젤을 제조하였다 구성성분에 따라 하이드로젤은 다양한 물리화학적 특성을 갖게 제조할 수 있다 제조된 하이드로젤은 건조된 상태에서도 모양과 크기를 변화시킬 수 있었고 유연함과 탄성을 가짐을 확인하였다. 하이드로젤의 기계적 물성을 알아보기 위해 탄성률과 응력완화를 측정하였고 시료 1은 높은 탄성률을 가져 다소 단단했다.
NMR로 분석한결과 수평균분자량은 각각 2170, 1990이었으며, 그 값은 GPC 측정분자량 값이%=2140 and 1940) 과 거의 유사함을 확인하였다. 그리고, 두 개의 합성된 고분자의 분자량 분포는 GPC 분석을 통해 좁은 분산도 (PDK1.1) 를 가짐을 확인하였다.
분해테스트를 하는 동안 팽윤도를 측정함으로써 시료의 가수분해 거동을 분석하였고 결과는 Figure 3에 나타내었다 하이드로젤은 처음 팽윤시 건조된 무게의 6〜 17배의 팽윤도를 보였고 친수성 고분자인 PEG의 함랑이 높을 수록 비교적 높은 초기 팽윤비를 나타내었다 실험은 매일 새로운 증류수로 교체되었고 수일이 지난 후 하이드로젤은 생분해성 사슬의 가수분해에 기인하여 팽윤비가 다시 증가하는 2차 팽윤을 보였다 Figure 4 (a) 에 하이드로젤의 분해과정을 그림으로 나타내었고 건조상태와 분해과정의 하이드로젤을 시간에 따른 형태 변화 사진을 Figure 4(b) 에서 보여주고 있다. 그림에서와 같이 하이드로젤 내에서 생분해성 PLGA블록의 분해가 진행됨에 따라 하이드로젤의 가교도는 감소하여 결과적으로 팽윤부피의 증가를 유도하였다 7개의 하이드로젤은 2차 팽윤이 일어나기 전 다양한 지연시간을 보였고 이는 하이드로젤들의 분해속도가 삼중블록 공중합체의 화학적 조성과 하이드로젤의 PLGA-PEG-PLGA/PEG 블록조성비에 의존한다는 것을 알 수 있었다. 팽윤 전 지연시간은 조직확장기의 삽입에 의해 손상된 피부가 접합이 되기 위한 충분한 시간을 제공할 것이다 또한 조절 가능한 분해 속도는 이것을 신체의 다양한 부분에 적용 가능하게 할 것이다
PLGA-PEG-PLGA를 합성할 때 PLGAM PEG 사이의 몰비를 다양하게 하여 삼중블록 공중합체의 블록크기를 조절하였다. 또한 PLGA의 조성은 LA와 GA의 몰비를 변화시켜 조절하였고 합성된 두 종류의 삼중블록 공중합체에서의 LA/GA비는 1/1과 4/1 로 얻어졌으며, 수득률은 각각 77%, 88%이었다. NMR로 분석한결과 수평균분자량은 각각 2170, 1990이었으며, 그 값은 GPC 측정분자량 값이%=2140 and 1940) 과 거의 유사함을 확인하였다.
또한, 의료기기에 사용되는 하이드로젤의 시험물질로서 분해기간이 다른 이식물 A(PLGA-PEG-PLGA:PEG=1:2) 와 이식물 B(PLGA- PEG-PLGA:PEG=1:1) 를 선정하여 국제표준화기구 기준에 근거하여 단기 이식평가를 한 결과 육안적 평가와 현미경적 평가에서 이식물 A를 이식한 마우스에서는 캡슐화와 염증도 거의 나타나지 않았다. 이는 이식물 A가 in vitro 상에서 2〜3주의 짧은 기간에 분해되는 이식용 하이드로젤로 동물에 이식하였을 때 in vitro 보다 움직임이 많고 생체액의 영향으로 더욱 빨리 분해가 이루어진 것으로 사료된다.
그 외의 다른 시료들은 모두 낮은 탄성률을 가졌고 비슷한 기계적 물성으로 건조된 상태에서도 자르는 것이 쉬웠다. 또한, 제조된 시료들은모두 90% 이상의 응력완화를 나타내었고 이것은 응력 하에서 변형이 잘 일어나지 않는다는 것을 뜻한다. 팽윤압력시험에서는 샘플 모두 100 mmHg 이상으로 조직을 팽창시키기 위해 충분한 팽윤압력을 가지고 있다는 것을 알수 있었다 In vitro 분해 시험 결과 PLGA-PEG-PLGA/PEG 하이드로젤의 성분에 따라 2차 팽윤이 일어나기 전 다양한 지연시간을 보였고 완전히 분해되기 까지는 1~5주의 시간이 걸렸다.
현미경적 평가. 이식물 A를 이식한 군에서는 이식물 접촉 부위의 캡슐화가 관찰되지 않았지만, 이식물 B를 이식한 군에서는 1주 동안 이식한 마우스는 경미 (minimal) 한 정도 3주 동안 이식한 마우스는 중증(moderate) 정도 9주 동안 이식한 마우스에서는 심각(marked) 한 정도의 캡슐화가 관찰되었으며 (Figure 5), 이는 육안적 평가와도 일치하는 결과였다. 이식물 B를 이식한 후 조직학적 평가는 Figure 5 와 같으며, (a) 와 (b)는 생리식염수를 이식한 부위로서 대조군을 나타내고 있으며, 그림(c)와 (d)는 이식물 B 투여 1주 후 하이드로젤이 이식된 부분에 염증세포들에 의해 캡슐이 형성되었음을 보여준다.
점탄성 물질에서 응력완하는 물질의 영구적 변형에 따른 고분자 사슬의 재배열 때문에 일어난다. 제조된 시료들은 모두 90% 이상의 응력 완화를 나타내었는데 이것은 고분자 사슬의 가교구조에 기인하여 응력 하에서의 변형이 쉽게 일어나지 않음을 알 수 있었다.
팽윤압력시험에서는 샘플 모두 100 mmHg 이상으로 조직을 팽창시키기 위해 충분한 팽윤압력을 가지고 있다는 것을 알수 있었다 In vitro 분해 시험 결과 PLGA-PEG-PLGA/PEG 하이드로젤의 성분에 따라 2차 팽윤이 일어나기 전 다양한 지연시간을 보였고 완전히 분해되기 까지는 1~5주의 시간이 걸렸다. 지연시간은 하이드로젤들의 분해속도가 생분해성 고분자의 종류 삼중블록 공중합체의 화학적 조성과 하이드로젤의 블록조성비에 의존한다는 것을 알수 있었다
또한, 제조된 시료들은모두 90% 이상의 응력완화를 나타내었고 이것은 응력 하에서 변형이 잘 일어나지 않는다는 것을 뜻한다. 팽윤압력시험에서는 샘플 모두 100 mmHg 이상으로 조직을 팽창시키기 위해 충분한 팽윤압력을 가지고 있다는 것을 알수 있었다 In vitro 분해 시험 결과 PLGA-PEG-PLGA/PEG 하이드로젤의 성분에 따라 2차 팽윤이 일어나기 전 다양한 지연시간을 보였고 완전히 분해되기 까지는 1~5주의 시간이 걸렸다. 지연시간은 하이드로젤들의 분해속도가 생분해성 고분자의 종류 삼중블록 공중합체의 화학적 조성과 하이드로젤의 블록조성비에 의존한다는 것을 알수 있었다
4 ppm에서 작은 세 개의 피크로 아크릴레이트의 비닐기 (CH2=CH) 를 확인하였으며 이로 PLGA-PEG-PLGA 삼중블록 공중합체 말단의 하이드록시 그룹이 아크릴레이트 그룹으로 치환되었음을 확인하였다. 한 개의 PEG 단위당 acryl 그룹의 수는 acryl 그룹의 C=C와 PEG의 CHa 해당하는 피크의 proton 면적비를 비교하여 계산하였으며 1.7 이상임을 확인할 수 있었다.
후속연구
이와 같이 분해시간이 조절가능하고 팽윤 전 지연시간을 보이는 특성과 더불어 생체적합성, 탄성 충분한 팽윤압력을 지니는 하이드로젤은 조직확장기와 다른 의약학적 분아에 유용하게 사용될 것으로 기대된다.
그림에서와 같이 하이드로젤 내에서 생분해성 PLGA블록의 분해가 진행됨에 따라 하이드로젤의 가교도는 감소하여 결과적으로 팽윤부피의 증가를 유도하였다 7개의 하이드로젤은 2차 팽윤이 일어나기 전 다양한 지연시간을 보였고 이는 하이드로젤들의 분해속도가 삼중블록 공중합체의 화학적 조성과 하이드로젤의 PLGA-PEG-PLGA/PEG 블록조성비에 의존한다는 것을 알 수 있었다. 팽윤 전 지연시간은 조직확장기의 삽입에 의해 손상된 피부가 접합이 되기 위한 충분한 시간을 제공할 것이다 또한 조절 가능한 분해 속도는 이것을 신체의 다양한 부분에 적용 가능하게 할 것이다
참고문헌 (44)
W. E. Hennink and C. F. van Nostrum, Adv. Drug Deliv. Rev., 54, 13 (2002).
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