선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 식품에 극소량 존재하는 Salmonella spp.를 real-time PCR로 검출 시 필요한 최소시간을 구하고자 하였다. Sal-F, Sal-R 서열이 primer로 사용되었으며 sal-P 서열이 probe로 사용되었다.
- Real-time PCR 방법이 신선 절단 양배추에 존재하는 Salmonella spp.를 검출할 수 있는 최단 검출시간을 산출하고자 하였다. 시료 25 g에 1 cell의 Salmonella spp.
- 을 검출하기 위하여, 증균 배양 배지에서의 real-time PCR 검출 한계 측정, 증균 배양 배지에서의 성장곡선 모델링, 성장 곡선을 이용한 검출소요 최단시간을 산출하였으며 이를 식품에서 검증하여 Salmonella spp.에 대한 신속 검출 가능성을 타진하고자 하였다.
제안 방법
- Real-time PCR로 검출하였을 때 소요되는 최단 시간을 산출하였다. 25 g 시료에 S. Typhimurium이 1 cell 존재한다고 가정하였을 때를 초기 균 농도로 하여 real-time PCR 검출 한계 균 농도까지 소요되는 시간을 성장곡선 모델에 대입하여 구하였다.
- 96-well의 microplate를 이용하여 ABI 7500® realtime PCR System(Applied Biosystems)에서 real-time PCR 을 수행하였다.
- Real-time PCR로 검출하였을 때 소요되는 최단 시간을 산출하였다. 25 g 시료에 S.
- Real-time PCR을 위한 반응물 조성은 Taqman gene expression master mix(Applied Biosystems, Foster City, USA) 12 μL, DNA 용액 3 μL, 1000 nM 농도의 forward와 reverse primer 2 μL씩, probe 1 μL(250 nM)로 구성 하였다.
- 50개의 시료에 대하여 식품 공전법과 real-time PCR 방법으로 분석하였다. Realtime PCR 방법은 식품 공전법의 첫 증균 배양 단계인 BPW를 이용한 증균 과정에서 7시간 30분 후 배양액을 채취하여 분석을 실시하였다. 그 결과, 4일이 소요된 식품 공전 방법에 의해 50개 시료 중 28개 시료가 양성으로 측정되었으며 총 10시간이 소요된 real-time PCR로는 식품 공전법보다는 4개더 많은 32개 시료가 양성으로 측정되었다.
- S. Typhimurium을 BPW에 1～10 cfu/mL 수준으로 접종하고 35℃에서 배양하면서 매 시간마다 1 mL을 취하여 TSA 에 도말 하였으며 이를 35℃에서 24시간 배양한 후 균 수를 측정하였다. 배양 시간에 따른 균 성장곡선을 그렸으며 Microsoft Office Excel 2007 program으로 분석하여 가장 적합한 회귀방정식을 구하였다.
- Typhimurium 배양액을 연속적으로 10배 희석하여 101～106 cfu/mL 의 농도로 조정하였다. 각 희석액에서 1 mL을 취하여 DNA 를 분리하고 real-time PCR을 수행하여 검출 한계값을 구하였다. 동시에 희석액을 TSA에 분주하여 성장시킨 후 균 수를 측정하여 검출 한계값을 보정하였다.
- 소매점(분당)에서 절단 양배추를 구입하여 우선적으로 식품 공전법에 의한 Salmonella spp. 검출실험을 실시하였다. 음성으로 판정된 양배추 25 g에 S.
- 각 희석액에서 1 mL을 취하여 DNA 를 분리하고 real-time PCR을 수행하여 검출 한계값을 구하였다. 동시에 희석액을 TSA에 분주하여 성장시킨 후 균 수를 측정하여 검출 한계값을 보정하였다.
- Realtime PCR은 35℃로 유지된 peptone water에 시료를 첨가하여 35℃에서 8시간 배양시킨 후 실시하였다. 또한 시판되고 있는 신선편이 야채류 30종을 수거하여 식품 공전법과 10시간 real-time PCR 방법에 따라 검출실험을 실시하였다.
- BPW에 인위적으로 Salmonella spp.를 접종하였으며 성장곡선을 구하였다. 성장곡선은 y＝0.
- 따라서 real-time PCR 기술이 신속 검출법이 되기 위해서는 BPW로 증균되는 과정인 18시간 이내에서 검출이 가능해야 한다. 배양되는 과정 중 검출이 가능한 시점을 찾기 위해서 우선적으로 realtime PCR의 검출 한계값을 측정하였다. 10진 희석된 연속적인 균 농도에 대하여 real-time PCR을 이용한 검출실험 결과 검출 한계값은 3.
- 배양된 균은 2,600×g에서 20분간 원심분리 하여 균체를 회수하였으며 0.9% 생리식염수로 2차례 수세하였으며 최종적으로 생리식염수 100 μL에 풀어 식품에 대한 접종 실험 등에 사용하였다.
- 시료 25 g에 225 mL의 BPW를 첨가하여 균질화 하여 35℃에서 18시간 비 선택적 증균 배양을 실시하였으며 이후 선택적 증균 배양 배지인 RV로 옮겨서 42℃에서 24시간 배양하였다. 배양액을 XLD agar에 접종하여 추정 균주를 분리하였으며 이후 triple sugar iron(TSI, Oxoid) slant에 접종한 후 urease test 등 생화학적 실험을 통하여 확인하였다(18).
- 성장곡선에서 균 수 증가에 필요한 시간을 측정해 본 결과 7시간 20분으로 산출되었으며 따라서 PCR 수행시간을 포함하여 10시간이면 검출이 가능함을 알 수 있었다. 식품에서의 실증 실험을 위하여 시중에서 판매되고 있는 신선편이 양배추를 구하여 25 g에 1∼10 cfu의 수준으로 S. Typhimurium을 인위접종한 후 real-time PCR 방법과 식품 공전방법으로 검출 하였을 때 두 방법 모두 동일하게 30개중 29개 시료에 대하여 음성을 나타내었다.
- Typhimurium이 1～10 cfu 농도로 존재할 수 있도록 인위적으로 접종하여 총 50개의 시료를 제조하였다. 양배추에 표면 10군데에 점적하여 최대로 골고루 분산될 수 있도록 접종하였다. 제조된 시료에 대하여 식품 공전법과 real-time PCR으로 분석하였다.
- 양배추에 표면 10군데에 점적하여 최대로 골고루 분산될 수 있도록 접종하였다. 제조된 시료에 대하여 식품 공전법과 real-time PCR으로 분석하였다. Realtime PCR은 35℃로 유지된 peptone water에 시료를 첨가하여 35℃에서 8시간 배양시킨 후 실시하였다.
대상 데이터
- Probe로는 5'-FAM-TGG CGG TGG GTT TTG TTG TCT TCT-TAMRA-3' 서열을 사용하였다(19).
- Probe로는 5'-FAM-TGG CGG TGG GTT TTG TTG TCT TCT-TAMRA-3' 서열을 사용하였다(19). Reporter dye는 FAM(6-carboxyfluorescein)을 사용하였으며 quencher dye로는 TARMA(6-carboxytetramethylrhodamine)를 사용하였다. Real-time PCR을 위한 반응물 조성은 Taqman gene expression master mix(Applied Biosystems, Foster City, USA) 12 μL, DNA 용액 3 μL, 1000 nM 농도의 forward와 reverse primer 2 μL씩, probe 1 μL(250 nM)로 구성 하였다.
- 냉동고에 보관되어 있는 Salmonella Typhimurium(ATCC 14028)을 녹여 BPW(Oxoid, Hampshire, England)를 이용하여 35℃에 18시간 배양한 후 tryptic soy agar(TSA, Oxoid) 에 도말 배양하여 형성된 단일 콜로니를 분리하여 실험에 사용하였다. 배양된 균은 2,600×g에서 20분간 원심분리 하여 균체를 회수하였으며 0.
- 검출실험을 실시하였다. 음성으로 판정된 양배추 25 g에 S. Typhimurium이 1～10 cfu 농도로 존재할 수 있도록 인위적으로 접종하여 총 50개의 시료를 제조하였다. 양배추에 표면 10군데에 점적하여 최대로 골고루 분산될 수 있도록 접종하였다.
- 9% 생리식염수로 2차례 수세하였으며 최종적으로 생리식염수 100 μL에 풀어 식품에 대한 접종 실험 등에 사용하였다. 증균 배양 배지로 BPW, Rappaport-Vassiliadis broth(RV, Oxoid)를 사용하였으며 분리 배지로는 xylose lysine deoxycholate agar(XLD, Oxoid)를 사용하였다.
데이터처리
- 소매점(분당)에서 절단 양배추를 구입하여 우선적으로 식품 공전법에 의한 Salmonella spp. 검출실험을 실시하였다. 음성으로 판정된 양배추 25 g에 S.
- Typhimurium을 BPW에 1～10 cfu/mL 수준으로 접종하고 35℃에서 배양하면서 매 시간마다 1 mL을 취하여 TSA 에 도말 하였으며 이를 35℃에서 24시간 배양한 후 균 수를 측정하였다. 배양 시간에 따른 균 성장곡선을 그렸으며 Microsoft Office Excel 2007 program으로 분석하여 가장 적합한 회귀방정식을 구하였다.
- 양배추에 극소량 존재하는 Salmonella spp.에 대하여 10시간 real-time PCR 방법으로 검출실험을 실시하여 신속 검출법으로서의 효율성을 검증하였다. 50개의 시료에 대하여 식품 공전법과 real-time PCR 방법으로 분석하였다.
이론/모형
- 에 대하여 10시간 real-time PCR 방법으로 검출실험을 실시하여 신속 검출법으로서의 효율성을 검증하였다. 50개의 시료에 대하여 식품 공전법과 real-time PCR 방법으로 분석하였다. Realtime PCR 방법은 식품 공전법의 첫 증균 배양 단계인 BPW를 이용한 증균 과정에서 7시간 30분 후 배양액을 채취하여 분석을 실시하였다.
- Real-time PCR에 사용된 bacterial DNA은 boiling method에 따라 분리하였다(17). 즉, 원심분리관에 증균 배양액1 mL을 취하여 12,000 rpm에서 3분간 원심분리 한 후 pellet 에 멸균 증류수 20 μL를 넣어 재 현탁하고 100℃로 조정된 heating bl℃k에 10분간 처리하여 열 변성 시킨 후 15분간 얼음에 방치하였다.
성능/효과
- 10진 희석된 연속적인 균 농도에 대하여 real-time PCR을 이용한 검출실험 결과 검출 한계값은 3.77×102 cfu/mL로 측정되어 102 수준의 검출 한계값을 가지는 것으로 측정되었다(Fig. 1).
- 본 실험에 사용된 증균 배양배지는 BPW로서 비 선택적 배양이 일어나 선택성이 떨어질 수 있다고 할 수 있지만 염기서열에 따라 반응하는 real-time PCR이 가지는 고유의 선택성이 있으므로 비 선택적 배양에서 기인하는 선택성 저하를 보상할 수 있다고 할 수 있다. 25 g 시료에 대하여 1～10 cfu 수준으로 접종한 시료에 대한 실험결과 식품 공전법에 비하여 4개가 위양성으로 검출된 것이 선택성이 저하되었기 때문으로 생각되었지만 양성이 위음성으로 검출될 만큼 선택성이 저하되지는 않은 것으로 판단되었다.
- 30종의 시판 시료에 대한 real-time PCR 분석결과 29개가 음성시료로 측정되었으며 1개의 시료가 잠정적인 양성(presumptive positive)로 측정된 결과에서 알 수 있듯이 10시간 real-time PCR법은 실제 식품검사에서 높은 비율로 존재하는 음성시료를 신속하게 제거할 수 있는 1차적인 선발실험 (presumptive screening method)로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 생각되었다.
- 시료 25 g에 1 cell의 Salmonella spp.가 존재한다고 가정하였을 때의 초기 농도(0.04 cfu/mL)에서 9배량의 BPW를 첨가한 후에 미생물 농도인 0.004 cfu/mL에서 realtime PCR 검출 한계값인 377 cfu/mL까지의 미생물 성장이 일어나야 검출이 가능할 것으로 생각되었다. 이를 log로 전환하면 -2.
- 검출 실험을 실시하였다. 그 결과 새싹 샐러드 제품인 1개의 시료가 real-time PCR에 의한 잠정적인 양성시료(presumptive positive)로 측정되었다(Fig. 3). 식품 공전에 의한 분석결과 동일한 시료에서만 양성으로 측정되었으며 나머지 29개 시료는 음성으로 판정되었다.
- Realtime PCR 방법은 식품 공전법의 첫 증균 배양 단계인 BPW를 이용한 증균 과정에서 7시간 30분 후 배양액을 채취하여 분석을 실시하였다. 그 결과, 4일이 소요된 식품 공전 방법에 의해 50개 시료 중 28개 시료가 양성으로 측정되었으며 총 10시간이 소요된 real-time PCR로는 식품 공전법보다는 4개더 많은 32개 시료가 양성으로 측정되었다. 식품 공전법으로 양성으로 측정된 시료는 모두 real-time PCR에서도 양성으로 측정되었으며 이외에 4개의 시료가 위양성(false-posi tive)을 나타내었다(Table 2).
- 2에 나타낸 바와 같이 성장곡선에 대입하면 7시간 20분이 필요함을 알 수 있었다. 따라서 시료 25 g에 1 cell이 존재할 경우 배양시간 7시간 20분 이상, DNA 추출시간 30분과 realtime PCR 수행시간 2시간을 모두 합하여 모두 10시간 이내 검출이 가능함을 산술적으로 알 수 있었다.
- 그러므로 증균 배양이 완료되기 전 검출이 가능해야 실질적인 신속 검출이라고 할 수 있다. 따라서 증균 배양 배지상태에서 real-time PCR 검출 한계 이상으로 증식된 시점을 정확히 파악할 수 있다면 18시간의 증균 배양 과정 없이 검출시간을 획기적으로 단축시킬 수 있을 것으로 생각된다.
- 의 성장을 억제하지 않았음을 의미하지만 선택성(specificity)은 감소하였음을 알 수 있었다. 반면에 시판되고 있는 시료에 대한 분석 결과 음성으로 판정된 시료에 대하여 위양성을 나타내지 않았으며 양성으로 확정된 시료에 대해서만 양성을 나타내어 어느 정도 선택성이 있음을 알 수 있었다.
- 반면에 비 선택적인 배양은 균의 성장을 억제하지 않는 배지 조성을 가지지만 선택 성(specificity)이 떨어진다고 할 수 있다. 본 실험에 사용된 증균 배양배지는 BPW로서 비 선택적 배양이 일어나 선택성이 떨어질 수 있다고 할 수 있지만 염기서열에 따라 반응하는 real-time PCR이 가지는 고유의 선택성이 있으므로 비 선택적 배양에서 기인하는 선택성 저하를 보상할 수 있다고 할 수 있다. 25 g 시료에 대하여 1～10 cfu 수준으로 접종한 시료에 대한 실험결과 식품 공전법에 비하여 4개가 위양성으로 검출된 것이 선택성이 저하되었기 때문으로 생각되었지만 양성이 위음성으로 검출될 만큼 선택성이 저하되지는 않은 것으로 판단되었다.
- 004 cfu/mL 이며 이 농도에서 검출 한계까지의 균 수 증가가 발생해야 real-time PCR로 검출이 가능할 것으로 판단되었다. 성장곡선에서 균 수 증가에 필요한 시간을 측정해 본 결과 7시간 20분으로 산출되었으며 따라서 PCR 수행시간을 포함하여 10시간이면 검출이 가능함을 알 수 있었다. 식품에서의 실증 실험을 위하여 시중에서 판매되고 있는 신선편이 양배추를 구하여 25 g에 1∼10 cfu의 수준으로 S.
- BPW에서의 성장곡선은 인위적으로 접종한 후 시간에 따라 배양액을 취하여 균 수를 측정하여 작성하였다. 작성된 그래프에 대하여 Microsoft Office Excel 2007 프로그램을 이용하여 2차 다항식으로 추세선을 구한 결과 성장곡선은 y＝0.0127x2＋0.5927x－0.4317(R2=0.99)로 산출되었다(Fig. 2).
후속연구
- Real-time PCR을 이용한 신속 검출기술은 더욱 더 낮은 검출 한계를 가질 수 있는 primer, probe 선발을 통해서 개선될 수 있으며 또한 검출 목적균을 신속하게 성장시킬 수 있는 배지 개발 또는 균 농축기술 개발을 통하여 더욱 더 신속한 검출이 가능할 것으로 생각되었다.
- 25 g 시료에 1 cell의 Salmonella spp.가 존재한다고 가정할 경우, 시료처리 과정에서 10배로 희석되므로 초기 균 농도는 0.004 cfu/mL 이며 이 농도에서 검출 한계까지의 균 수 증가가 발생해야 real-time PCR로 검출이 가능할 것으로 판단되었다. 성장곡선에서 균 수 증가에 필요한 시간을 측정해 본 결과 7시간 20분으로 산출되었으며 따라서 PCR 수행시간을 포함하여 10시간이면 검출이 가능함을 알 수 있었다.
- 신선 편이식품은 현재의 생산방법으로는 식중독균이 완전히 제거될 수 없기 때문에 생산단계, 가공단계 및 유통단계에서 효과적인 식품안전을 보장할 수 있는 기술이 반드시 필요한 것으로 알려져 있다(4). 따라서 식품에서 문제가 되는 목표 미생물을 보다 신속하게 검출할 수 있는 기술이 개발된다면 신선편이 제품을 생산하는 공장에서의 제품 품질관리에 효율적으로 사용될 수 있다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.