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문제 정의
- 세리신은 이와 같은 생체 내 지질대사 관련 지표를 조절하는 기능성 식품 원료와 의약품, 화장품과 같은 미용 소재 산업의 천연 재료로 활용할 수 있는 천연 성분으로 유용할 것이라고 한다[3,9]. 이에, 본 연구는 누에로부터 효소 처리하여 추출한 세리신이 이상지질혈증 유발 식이를 섭취한 흰쥐에 있어서 혈청 지질대사 이상 및 혈당 조절 기능 이상과 간기능 장애 등에서 오는 생활 습관병 예방 및 치료 개선 효과를 비교 검토하기 위하여 실험을 수행하였다.
제안 방법
- 대조군(BW군)은 기본식이에 물만 급여시켰으며, 이상지질혈증 유발을 위해 콜레스테롤 0.75% 및 sodium cholate 0.25%를 함유한 식이를 급여하여 실험사육시킨 실험군에 물 섭취군(HCW군)과 HCS군은 콜레스테롤 급여군에 실크 세리신 10%를 첨가 조제하였으며, 실험 전 기간 동안 물은 자유로이 섭취시켰다(Table 1). 실험 사육 5주간의 최종일에는 7시간 단식시킨 후 에테르 마취 하에 심장채혈법으로 채혈하였으며, 혈액은 약 1시간 정도 빙수 중에 방치한 후 3,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 혈청을 취하여 실험에 사용하였다.
- 사육실의 온도는 20±1℃, 습도는 50±10%로 유지시켰고, 명암은 12시간(07:00～19:00) 주기로 조명하였다.
- 세리신의 추출은 Lee 등[21]의 방법을 약간 수정하여 조제하였다. 정선된 절각견에 30배 중량의 물을 첨가하고 110℃에서 5시간 가열한 후 여과하여 잔사를 제거하고 여과액을 얻었다.
- 25%를 함유한 식이를 급여하여 실험사육시킨 실험군에 물 섭취군(HCW군)과 HCS군은 콜레스테롤 급여군에 실크 세리신 10%를 첨가 조제하였으며, 실험 전 기간 동안 물은 자유로이 섭취시켰다(Table 1). 실험 사육 5주간의 최종일에는 7시간 단식시킨 후 에테르 마취 하에 심장채혈법으로 채혈하였으며, 혈액은 약 1시간 정도 빙수 중에 방치한 후 3,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 혈청을 취하여 실험에 사용하였다. 실험사육 시작과 최종일에 체중을 측정하였으며, 사료 섭취량은 매일 사료 잔량을 측정하여 식이 효율을 산출하였다.
- 실험 사육 5주간의 최종일에는 7시간 단식시킨 후 에테르 마취 하에 심장채혈법으로 채혈하였으며, 혈액은 약 1시간 정도 빙수 중에 방치한 후 3,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 혈청을 취하여 실험에 사용하였다. 실험사육 시작과 최종일에 체중을 측정하였으며, 사료 섭취량은 매일 사료 잔량을 측정하여 식이 효율을 산출하였다.
- 혈청 중의 중성지질 농도는 중성지질 측정용 kit 시약(Triglyzyme-V, Eiken, Tokyo, Japan)으로 측정하였으며, 인지질 농도는 인지질 측정용 kit 시약(PLzyme, Eiken, Tokyo, Japan)으로 측정하였다. 유리 콜레스테롤 농도는 유리 콜레스테롤 측정용 kit 시약(Free-cholestezyme-V555, Eiken, Tokyo, Japan)으로 측정하였으며, 콜레스테롤 에스테르 농도는 총 콜레스테롤 농도에서 유리 콜레스테롤 농도를 뺀 평균 값으로 표시하였다. 한편, 혈당 농도는 혈당 측정용 kit 시약 (GLzyme, Eiken, Tokyo, Japan)으로 측정하였다.
- 즉, 단백질 함량으로 30 mg 정도의 세리신 분말을 cap tube에 취하고 β-mercaptoethanol 0.04%를 함유한 6 NHCl을 단백질량의 1,000배 이상 가하고 질소 가스를 8분간 충전하여 탈기시킨 다음, 110℃ sand bath 상에서 24시간 가수분해한 후, 농축 건고하여 잔사를 0.2 N sodium citrate buffer (pH 2.2)로써 50 ml로 정용하여, 아미노산 자동분석기(Hitachi model 835, Japan)로 분석하였다.
- 평균 체중이 60±5 g인 4주령 된 Sprague Dawley계 수컷 흰쥐(충북 음성군 DAE HAN BIOLINK Co., LTD, Korea)를 구입하여, 5% 옥수수유(신동방(주), pure refined corn salad oil, Korea)를 함유하는 기초식이로 9일간 예비사육하여 적응시킨 후 난괴법(Randomized Complete Block Design)에 의해서 6마리씩 3군으로 metabolic cage (JD-C-71, 정도산업, 한국)에 나누어 5주간 실험 사육하였다.
- 유리 콜레스테롤 농도는 유리 콜레스테롤 측정용 kit 시약(Free-cholestezyme-V555, Eiken, Tokyo, Japan)으로 측정하였으며, 콜레스테롤 에스테르 농도는 총 콜레스테롤 농도에서 유리 콜레스테롤 농도를 뺀 평균 값으로 표시하였다. 한편, 혈당 농도는 혈당 측정용 kit 시약 (GLzyme, Eiken, Tokyo, Japan)으로 측정하였다. 즉, 혈청 0.
- 35를 곱한 값으로 표시하였다. 혈청 중의 중성지질 농도는 중성지질 측정용 kit 시약(Triglyzyme-V, Eiken, Tokyo, Japan)으로 측정하였으며, 인지질 농도는 인지질 측정용 kit 시약(PLzyme, Eiken, Tokyo, Japan)으로 측정하였다. 유리 콜레스테롤 농도는 유리 콜레스테롤 측정용 kit 시약(Free-cholestezyme-V555, Eiken, Tokyo, Japan)으로 측정하였으며, 콜레스테롤 에스테르 농도는 총 콜레스테롤 농도에서 유리 콜레스테롤 농도를 뺀 평균 값으로 표시하였다.
- 혈청 중의 총 콜레스테롤 농도는 총 콜레스테롤 측정용 kit 시약(Cholestezyme -V, Eiken, Tokyo, Japan), HDL -콜레스테롤 농도는 HDL-콜레스테롤 측정용 kit 시약(HDL C-555, Eiken, Tokyo, Japan), 혈청 LDL의 농도는 LDL 측정용 kit시약(β-lipoprotein C-Test, Wako, Osaka, Japan)으로 측정하였으며, LDL-콜레스테롤 농도는 LDL농도에 0.35를 곱한 값으로 표시하였다.
대상 데이터
- 표준시약(polyethylene glycol kit, type PEG-10; Sigma, St. Louis, USA) 및 제조한 실크 세리신 시료 0.01 g을 정칭하여 증류수(DW), 아세토니트릴(ACN) 및 트리플루오로초산 (TFA)의 혼합 용매(DW:ACN:TFA=55:45:0.1, v/v/v)에 용해시켜 실온에서 하룻밤 방치한 후, 0.45 µm membrane filter (Sigma, St. Louis, USA)로 여과한 것을 표준 및 시험용액으로 사용하였다.
데이터처리
- 분석 결과의 통계 처리는 실험군 당 평균치와 표준편차를 계산하였고 군간의 차이는 One-way analysis of variance (ANOVA, ver. 12.0) 분석 후 α=0.05 수준에서 Duncan's multiple range test에 의하여 각 실험군 간의 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 1) 활성은 혈청 ALP측정용 kit 시약(NEW-K-PHOS, Eiken, Tokyo, Japan)을 사용하여 측정하였으며, 혈청 1 ml 당 unit로 표시하였다. Aminotransferase의 활성은 Reitman과 Frankel의 방법[32]에 준해 조제된 kit 시약(혈청 transaminase 측정시약, Eiken, Tokyo, Japan)을 사용하여 혈청 중 aspartate aminotransferase (AST, EC 2.6.1.1) 및 alanine aminotransferase (ALT, EC 2.6.1.2) 활성을 측정하였으며 단위는 혈청 1 ml 당 unit로 표시하였다.
- 2)로써 50 ml로 정용하여, 아미노산 자동분석기(Hitachi model 835, Japan)로 분석하였다. Tryptophan은 Hugli와 Moore의 방법[5]에 의하여 알칼리 가수분해법으로 분해시켜 550 nm에서 비색 정량하였다.
- 총아미노산 분석용 시료는 산가수분해법으로 분해하였다. 즉, 단백질 함량으로 30 mg 정도의 세리신 분말을 cap tube에 취하고 β-mercaptoethanol 0.
- 표준시약을 HPLC에 주입하여 검량선을 작성한 다음, 검체에 대하여 TSK Gel G2500PWXL column (Φ 7.8×300 mm, TOSOH CO.)을 사용하여 size exclusion chromatography (SEC) 방법에 따라 검체의 분자량 분포를 GPC program Water 510 (Waters Co., Ltd, Boston, Massachusetts, USA)을 이용하여 분석하였다.
성능/효과
- 2와 같다. AST 활성은 HCW군(81.4unit/ml)이 대조군(64.5 unit/ml)에 비하여 유의적으로 증가되었으나, 세리신 섭취(HCS군, 77.0 unit/ml)로 인해 억제되는 것으로 나타났다. 혈청 ALT 활성은 대조군(21.
- 또한 식이성 타우린, 맥문동 추출물과 홍삼 사포닌을 첨가하여 섭취시켰을 때 생리활성물질 및 실험 식이의 조성에 의하여 혈당이 저하되었다고 보고되어 있다[7,12,25,27]. 따라서 본 실험 결과 나타난 혈당 저하 효과는 누에 유래 실크 세리신의 섭취에 의한 영향이 반영된 것으로 사료된다.
- 따라서 본 실험 결과, 이상지질혈증 흰쥐에 대한 실크 세리신의 급여로 인한 혈청 총 콜레스테롤 농도의 저하, HDL-콜레스테롤 농도의 상승 및 동맥경화지수의 저하 등으로 미루어 보아 지질대사 개선작용의 효과가 있을 것으로 사료된다.
- AST 및 ALT 활성은 간 실질세포의 장애로 인하여 증가되는 것으로 알려져 있다[29]. 본 실험 결과, 실크 세리신 섭취에 의하여 aminotransferase 활성이 억제되는 것으로 관찰되었다.
- 기능성 식품 신소재 등으로 활용하기 위하여 단백질 분해 효소로 가열 처리하여 본 실험에 사용된 세리신의 아미노산 조성과 분자량 분포는 Table 2와 3에 나타내었다. 분석한 결과, 주요 아미노산은 serine 30.06%, aspartic acid 18.40% 및 glycine이 9.94%로 대부분을 차지하였다. 이는 실크 세리신에는 세린, 아스파라긴산 및 글리신을 다량 함유하고 다른 아미노산의 분포는 소량 존재한다는 보고[9]와 같은 결과를 나타내었다.
- 세리신의 분자량 분포를 측정하기 위하여 분자량 표준품과 시료 용액의 크로마토그램에서 분자량과 용출 시간의 상관관계를 분석한 결과, 분자량 10,000 이상이 4.0%, 분자량 4,500～10,000까지 20.0%, 분자량 1,000～4,500까지 40.3% 및 분자량 1,000이하는 35.6%의 분포를 나타내었으며, 평균 분자량은 2,685로 나타났다. 누에고치를 120℃에서 처리 시간을 달리하고 여과하여 동결 건조시킨 후 얻은 세리신 잠견의 분자량은 처리 시간이 길수록 저분자화되어 평균 분자량은 3,744～ 9,417범위로 분자량이 5,000이하의 것들이 많아 성인병 예방 등의 기능성 자원으로 활용 가능한 보고[11,15] 등과 유사한 결과를 얻었다.
- HCW군 및 HCS군의 체중 증가는 이상 지질혈증 유발과 식이 섭취량에 따른 현상으로 생각되며, 유의적인 변화는 관찰할 수 없었다. 식이 섭취량 및 식이 효율은 BW군에 비하여 HCW군과 HCS군이 약간 높았으나, 본 실험에서는 각 군간에 유의적인 변화는 보이지 않았다. 누에 분말의 첨가량을 증가시킬수록 흰쥐의 체중 증가량이 감소되는 경향은 누에 분말이 고단백질로서 체내의 소화 흡수, 대사에 사용되는 에너지 소모량이 높기 때문이라는 보고도 있다[16].
- 75%를 함유한 식이를 급여하여 이상지질혈증을 유발시킨 HCW군과 이상지질혈증을 유발하여 실크 세리신 10%를 첨가한 HCS군에 있어서 5주간 실험 사육한 흰쥐의 체중 증가량및 식이 섭취량, 식이 효율은 Table 4와 같다. 체중 증가량은 BW군의 138.5 g에 비해 이상지질혈증 유발군인 HCW군이 152.1 g으로 높았으며 세리신 10%를 첨가한 군(HCS군)이 150.6 g으로 나타났다. HCW군 및 HCS군의 체중 증가는 이상 지질혈증 유발과 식이 섭취량에 따른 현상으로 생각되며, 유의적인 변화는 관찰할 수 없었다.
- 혈청 중의 지질성분 농도 등은 Table 5와 같다. 총 콜레스테롤 농도는 기본식이만 급여한 BW군의 84.6 mg/dl에 비하여 전 실험군에서 높게 나타났지만, 콜레스테롤로 유발된 이상지질혈증 실험군(HCW군)의 133.8 mg/dl에 비해 실크 세리신을 섭취한 HCS군이 101.0 mg/dl로 유의적으로 감소하였다. 또한, HDL-콜레스테롤 농도는 HCW군(20.
- 6 mg/dl로 증가를 하였다. 총 콜레스테롤에 대한 HDL-콜레스테롤 농도 비는 HCW군(15.2%)보다 세리신 섭취군인 HCS군(21.4%)에서 높은 비율을 나타내었고, 동맥경화지수는 HCW군의 5.6에 비하여 HCS군(3.7)이 낮게 나타났으나, 대조군인 BW군(2.5)의 수준에는 미치지 못하였다. 고콜레스테롤 식이에 의한 지질대사 장애에 따라 총 콜레스테롤 농도는 증가하고, HDL-콜레스테롤 농도는 저하되는 것으로 알려져 있다[14,29].
- 혈청 ALP의 활성 변화는 Fig. 1과 같이, 대조군인 BW군 (18.8 unit/ml)에 비해 여타 실험군에서 유의성 있게 높게 나타났으나, 이상지질혈증 실험군인 HCW군(29.4 unit/ml)에 비하여 세리신을 섭취시킨 HCS군(25.0 unit/ml)에서 유의적인 억제를 보였다. 이상지질혈증과 합병증 및 간 조직이나 담관의 폐쇄 등에 의해서 ALP의 활성이 증가되는 것으로 알려져 있으며[13], 누에 추출물을 섭취함으로써 ALP 활성이 약 41% 감소되었다고 한다[8].
- 0 unit/ml)로 인해 억제되는 것으로 나타났다. 혈청 ALT 활성은 대조군(21.4 unit/ml)에 비하여 HCW군(29.5 unit/ml)과 HCS군(26.9 unit/ml)에서 증가되었으나, 세리신 급여로 HCS군의 효소 활성이 억제되는 것으로 나타났다. AST 및 ALT 활성은 간 실질세포의 장애로 인하여 증가되는 것으로 알려져 있다[29].
- 혈청 중 중성지질과 인지질 농도는 이상지질혈증 흰쥐 실험군(HCW군, HCS군)에 있어서 대조군에 비해 유의적으로 높게 나타났으나, 이상지질혈증 유발 실험군인 HCW군에 비하여 세리신 급여군인 HCS군의 농도가 감소되는 경향을 보였다. 이와 같은 결과는 누에 추출물 및 누에고치 산 가수분해물을 섭취시킨 흰쥐의 중성지질 등의 함량 변화와 유사한 것으로 나타났다[6,36].
- 혈청 중의 유리 콜레스테롤과 콜레스테롤 에스테르는 이상지질혈증 실험군(HCW군)에 비하여 세리신 급여군인 HCS군에서 낮은 경향을 보였고, 콜레스테롤 에스테르 비 또한, 세리신 섭취군인 HCS군에서 낮은 비율의 범위를 나타내었다. 콜레스테롤 에스테르 비는 고콜레스테롤혈증 및 그 합병증일때 상승된다고 한다[13].
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