[논문]누에 복합 추출물의 면역 활성 증진 효과

이아름; 김수현; 김수지; 김경조; 이영철; 노성수

doi:10.6116/kjh.2017.32.4.1.

누에 복합 추출물의 면역 활성 증진 효과
Evaluation of Immunopotentiation Activities of Combined Extract of Silkworm and Food material 원문보기

大韓本草學會誌 = The Korea journal of herbology, v.32 no.4, 2017년, pp.1 - 8

이아름 (대구한의대학교 한의과대학 본초약리학교실) , 김수현 (대구한의대학교 한의과대학 본초약리학교실) , 김수지 (대구한의대학교 한의과대학 본초약리학교실) , 김경조 (대구한의대학교 한의과대학 본초약리학교실) , 이영철 (상지대학교 한의과대학 본초학교실) , 노성수 (대구한의대학교 한의과대학 본초약리학교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : Silkworm is known as immunomodulatory substances and contain various bioactive compounds such as serine, tyrosine and alanine. The aim of this study was to investigated the immunopotentiating activity of combine extract that silkworm and food materials (Eucommia ulmoides, Angelica gigas, Acanthopanax, Allium hookeri, Cinnamomum cassia, Liriope platyphylla, Curcuma longa, Achyranthes japonica, Alpinia oxyphylla, Adenophora triphylla). Methods : Among 10 kinds of food materials, to select food materials with the effect of enhancing the immune function mouse splenocyte proliferation ability was measured by 3-[4,5-dimethylthiazol-2-y]-2,5-diphenyl terazolium bromide (MTT) assay. Then, combine extract of silkworm and food materials were evaluated that mouse splenocyte proliferation ability by EZ-cytox cell viability assay. Morever, cytokines production such as IL-2, IL-4, IL10, IL12, $IFN-{\gamma}$ on mouse T lymphocyte stimulated with concanavalin A (ConA) was measured. Results : Eucommia ulmoides, Acanthopanax, Allium hookeri, Cinnamomum cassia, Liriope platyphylla has high proliferation ability of mouse splenocyte compared with Curcuma longa, Achyranthes japonica, Alpinia oxyphylla, Adenophora triphylla. The silkworm and food material combined extract has a relatively high proliferation ability of mouse splenocyte proliferation when the silkworm and food materials are used as a single material. In particularly, combined extract of silkworm and Cinnamomum cassia was stimulate cytokine production on T lymphocyte such as IL12, $IFN-{\gamma}$. Combined extract of silkworm and Liriope platyphylla was stimulate cytokine production on T lymphocyte such as IL2, IL4, IL10. Conclusion : In conclusion, the combined extract of the silkworm and Cinnamomum cassia or Liriope platyphylla may enhance immune function by regulating mouse splenocyte proliferation and stimulating cytokine production.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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제안 방법

0.05% tween-20 을 함유한 PBS로 4회 세척 후 biotinylated anti-mouse IFN-γ , IL-2, IL-4 와 anti-mouse IL-12는 1% BSA를 함유한 PBS를 이용하여 0.05 ㎍/㎖ 농도로 희석한 후 well에 처리하여 37℃에서 2시간 동안 방치하였다.
0.05% tween-20을 함유한 PBS로 4회 세척 후 재조합 사람 IFN-γ , IL-2, IL-4와 재조합 생쥐 IL-12 표준액과 식품소재 (50, 100, 200 ㎍/㎖)를 처리한 검체의 배양 상등액을 각 well 에 100 ㎕씩 분주하여 37℃에서 2시간 동안 방치하였다.
5종의 식품소재를 누에와 복합 추출 하여 EZ-CyTox법을 사용하여 마우스 비장세포 증식능을 평가 하였고 누에 복합 추출물의 IL2, IL4, IL10, IL12, IFN-γ와 같은 사이토카인 생성량을 평가하여 면역 기능 증진 효과를 비교 연구하였다.
ABTS 기질액을 각 well 에 100 ㎕씩 가하여 10 분간 발색을 유도한 다음 ELISA reader를 이용하여 405 ㎚ 파장 에서 IFN-γ , IL-2, IL-4, IL-12 등을 측정하였다.
Balb/c계 수컷 생쥐를 경추 탈골로 희생시킨 뒤 비장을 적출한 다음 적당량의 무균 Hank’s balanced salt solution (HBSS; GIBCO, NY, USA) 용액이 담긴 용기에 넣고, 핀셋으로 잘게 절단하여 단일 비장세포 현탁액으로 만든 후, Filter로 여과하여 HBSS액에세 번 세척하였다.
anti-mouse IFN-γ , IL-2, IL-4, IL-10 와 anti-mouse IL-12 capture단 클론 항체 등을 96-well plate에 1 ㎍/㎖ 농도로 코팅하여 4℃에서 12시간 방치하였다.
각 시료 100 g을 한일분쇄기 (FM-700SS, 한국)로 분쇄하여 환류추출기 (heating Mantle, MS-DM609/20L)에 넣고 100℃ 에서 증류수를 1ℓ가하여 120분 추출하였다. 그 후감압증류기 (N-1200A, EYELA.
그 후감압증류기 (N-1200A, EYELA. CO. LTD, Japan)를 이용 하여 추출액을 농축하는 과정을 거치고, 동결건조기 (PF-10/ ALPHA 1-2LD, Germany)를 통하여 건조된 열수 추출물을 얻어 –20℃에서 냉동 보관하여 실험에 사용하였다.
단일 소재를 처리하였을 때 뛰어난 마우스 비장세포 증식능을 나타내었던 두충, 오가피, 부추, 육계, 맥문동을 누에와 혼합 하여 마우스 비장세포 증식능을 측정하였다. 그 결과 200 ㎍/㎖ 농도에서 두충을 단독 처리하였을 때는 148.
단일 소재를 처리하였을 때 마우스 비장세포 증식능 실험 결과를 토대로 선정된 두충, 오가피, 부추, 육계, 맥문동을 누에와 혼합하여 마우스 비장세포에 처리한 다음 증식능을 계산 하였다. 실험 결과, 누에를 200 ㎍/㎖ 농도에서 단독으로 비장세포에 처리하였을 때 (171.
동물 사육실의 조건은 conventional system으로 온도 22±2℃, 습도 50±5% 명암주기 (light : dark cycle)는 12시간 주기로 조절 하였다.
본 연구자는 문헌조사를 통하여 면역 활성 증진 효과가 뛰어나다고 알려진 10가지 소재 (두충 (Eucommia ulmoides, EU), 당귀 (Angelica gigas, AG), 오가피 (Acanthopanax, AC), 부추 (Allium hookeri, AH), 육계 (Cinnamomum cassia, CC), 맥문동 (Liriope platyphylla, LP), 강황 (Curcuma longa, CL ), 우슬 (Achyranthes japonica, AJ), 익지 (Alpinia oxyphylla, AO), 사삼 (Adenophora triphylla, AT))를 선정하여 마우스 비장세포 증식능을 평가하였고 이중 비장세포 증식능이 높은 식품 소재 5종을 선정하여 누에와 복합 추출한 다음 EZ-CyTox법을 사용하여 마우스 비장세포 증식 능을 평가하였다. 또한 누에 복합 추출물의 사이토카인 생성 량을 평가하여 면역 활성 증진 효과를 비교 연구하였다.
마우스 비장 세포 현탁액을 200 ㎕/well의 양으로 96 well plate에 넣어 배양한 후 아무런 처치를 하지 않은 군, concanavalin A (Con A (10 ㎍/㎖))로 자극한 군 그리고 식품 소재 추출물 (50, 100, 200 ㎍/㎖을 처리한 실험군으로 나누어 실험을 진행하였다. 5% CO₂ 37℃ 배양기에서 72시간 동안 배양하였다.
마우스 비장세포에서 T 림프구를 분리하여 누에, 두충, 오가피, 부추, 육계, 맥문동 추출물 및 누에 복합 추출물과 함께 배양한 후 conA 용액으로 자극하여 분비된 사이토카인의 양을 비교 분석하였다.
마우스 비장세포에서 분리한 T 림프구를 conA로 자극 한뒤 누에, 두충, 오가피, 부추, 육계, 맥문동 추출물 및 누에 복합 추출물을 처리하였을 때 사이토카인 분비량을 측정하였다.IL2는 누에를 단독 처리하였을 때 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도 에서 각각 69.
배양 종료 6시간 전에 각 well에 EZ-CyTox assay reagent 10 ㎕을 넣어 30분에서 6시간 동안 계속 배양하였다.배양 종료 후 420-480 ㎚ 파장에서 ELISA reader로 비장세포 증식능을 측정하였다.
본 연구에서는 면역 활성 증진 효과가 뛰어나다고 보고된 10종의 식품 소재 (두충 (Eucommia ulmoides), 당귀 (Angelica gigas), 오가피 (Acanthopanax), 부추 (Allium hooker), 육계 (Cinnamomum cassia), 맥문동 (Liriope platyphylla), 강황 (Curcuma longa), 우슬 (Achyranthes japonica), 익지 (Alpinia oxyphylla), 사삼 (Adenophora triphylla))의 마우스 비장세포 증식능을 평가하였고 이중 비장세포 증식능이 높은 식품 소재 5종을 선정였다. 5종의 식품소재를 누에와 복합 추출 하여 EZ-CyTox법을 사용하여 마우스 비장세포 증식능을 평가 하였고 누에 복합 추출물의 IL2, IL4, IL10, IL12, IFN-γ와 같은 사이토카인 생성량을 평가하여 면역 기능 증진 효과를 비교 연구하였다.
본 연구자는 문헌조사를 통하여 면역 활성 증진 효과가 뛰어나다고 알려진 10가지 소재 (두충 (Eucommia ulmoides, EU), 당귀 (Angelica gigas, AG), 오가피 (Acanthopanax, AC), 부추 (Allium hookeri, AH), 육계 (Cinnamomum cassia, CC), 맥문동 (Liriope platyphylla, LP), 강황 (Curcuma longa, CL ), 우슬 (Achyranthes japonica, AJ), 익지 (Alpinia oxyphylla, AO), 사삼 (Adenophora triphylla, AT))를 선정하여 마우스 비장세포 증식능을 평가하였고 이중 비장세포 증식능이 높은 식품 소재 5종을 선정하여 누에와 복합 추출한 다음 EZ-CyTox법을 사용하여 마우스 비장세포 증식 능을 평가하였다. 또한 누에 복합 추출물의 사이토카인 생성 량을 평가하여 면역 활성 증진 효과를 비교 연구하였다.
비장세포 현탁액 중 CD4+ T isolation kit (Miltenyi biotec, CA, USA)를 이용하여 분리한 T 림프구를 10% FBS와 1% penicillin/streptomycin이 첨가된 RPMI 1640 배지에서 37℃ 5% CO₂ 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. IFN-γ , IL-2, IL-4, IL-10, IL-12 등 세포활성물질은 ConA 용액에 의해 자극하며 측정은 ELISA방법으로 수행하였다.

대상 데이터

8주령 Balb/c계 수컷 생쥐를 샘타코 바이오 (Korea, Osan-si)에서 구입하여 실험에 사용하였다. 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 온도 22±2℃, 습도 50±5% 명암주기 (light : dark cycle)는 12시간 주기로 조절 하였다.
8주령 수컷 마우스를 경추 탈골하여 비장을 적출한 다음 비장세포를 배양하여 실험에 사용하였다. 비장은 T 세포, B 세포, 대식세포 등의 여러 가지 림프구가 밀집되어있는 장기 로서 생체 내 면역기능을 담당하는 면역기관이다¹⁸⁾.
본 실험에서 사용한 누에, 당귀, 두충, 오가피, 부추, 육계, 강황, 우슬, 익지, 사삼은 옴니허브 (대구, 한국)에서 구입한 것을 생약규격집에 맞추어 대구한의대학교 한의과대학 본초 학교실에서 관능 검사하여 약전규격에 합격한 것만을 정선하여 실험에 사용하였다.
동물 사육실의 조건은 conventional system으로 온도 22±2℃, 습도 50±5% 명암주기 (light : dark cycle)는 12시간 주기로 조절 하였다. 사료는 고형사료 (Samyang corporation, Seoul, Korea) (조단백질 22.1% 이상, 조지방 8.0% 이하, 조섬유 5.0% 이하, 조회분 8.0% 이하, 칼슘 0.6% 이상, 인 0.4% 이상, 항생제 무첨가)와 물을 충분히 공급하였다. Balb/c계 수컷 생쥐를 경추 탈골로 희생시킨 뒤 비장을 적출한 다음 적당량의 무균 Hank’s balanced salt solution (HBSS; GIBCO, NY, USA) 용액이 담긴 용기에 넣고, 핀셋으로 잘게 절단하여 단일 비장세포 현탁액으로 만든 후, Filter로 여과하여 HBSS액에세 번 세척하였다.

이론/모형

IFN-γ , IL-2, IL-4, IL-10, IL-12 등 세포활성물질은 ConA 용액에 의해 자극하며 측정은 ELISA방법으로 수행하였다.

성능/효과

1. 누에를 포함한 단일 한약재 10종의 마우스 비장세포의 림프구 증식능을 측정한 결과, 두충, 오가피, 부추, 육계, 맥문동에서 큰 증가량을 나타내었다.
2. 두충, 오가피, 부추, 육계 맥문동을 누에와 복합 추출하여 마우스 비장세포의 림프구 증식능을 측정한 결과, 정도의 차이는 있으나 단일 소재로 사용하였을 때 보다 복합 추출하였을 때 림프구 증식능이 증가하는 것으로 나타났 으며 누에 두충 복합추출물, 누에 육계 복합추출물, 누에 맥문동 복합추출물은 비교적 높은 증가량을 나타내었다.
3. 사이토카인 증가량을 측정하였을 때, 단일 소재 처리군 보다 누에 복합 추출물 처리군에서 IL2, IL4, IL10, IL12, IFN-γ가 증가하였고 특히 IL2, IL4, IL10의 경우 누에 맥문동 복합 추출물이, IL12, IFN-γ에서는 누에 육계 복합 추출물이 뛰어난 효과를 나타내었다.
86 pg/㎖로 가장 높은 IL2 분비량을 나타내었다. 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도에서 누에 두충 복합 추출물 (68.91, 116.16, 116.57 pg/㎖)과 누에 육계 복합 추출물 (114.18, 115.06, 88.90 pg/㎖) 또한 뛰어난 사이토카인 분비량을 나타내었다.
IFN-γ 분비량을 측정한 결과 IL12 사이토카인 분비량 결과와 일치하게 누에 육계 복합추출물이 가장큰 증가량을 나타내었고 누에 두충 복합추출물 및 누에 맥문동 복합 추출물 또한 높은 증가량을 나타내었다.
IFN-γ는 누에 육계 복합추출물이 200 ㎍/㎖ 농도에서 46.45 pg/㎖로 가장 큰 효과를 나타내었고 누에 두충 복합추 출물 (21.54 pg/㎖) 및 누에 맥문동 복합 추출물 (19.36 pg/㎖) 또한 뛰어난 효과를 나타내었다.
IL10의 경우 누에 맥문동 복합추출물이 가장 높은 증가량을 나타내었고 누에 육계 복합추출물도 200 ㎍/㎖ 농도에서 97.46 pg/㎖의 높은 IL10 분비량을 나타내었다.
체내 염증이 발생하였을때 초기에 분비되는 반응물질로서 조직 손상이 커지는 것을 막아주는 역할을 한다²⁰⁾. IL2는 누에를 단독 처리하였을 때 200 ㎍/㎖ 농도에서 72.11 pg/㎖로 나타났고 누에 맥문동 복합 추출물은 같은 농도에서 약 1.7배 증가하여 125.86 pg/㎖ 의 가장 높은 IL2 분비량을 나타내었다.
마우스 비장세포에서 분리한 T 림프구를 conA로 자극 한뒤 누에, 두충, 오가피, 부추, 육계, 맥문동 추출물 및 누에 복합 추출물을 처리하였을 때 사이토카인 분비량을 측정하였다.IL2는 누에를 단독 처리하였을 때 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도 에서 각각 69.85, 72.20, 72.11 pg/㎖로 나타났고 이에 비하여 누에 맥문동 복합 추출물은 100, 200 ㎍/㎖ 농도에서 각각 132.56, 125.86 pg/㎖로 가장 높은 IL2 분비량을 나타내었다. 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도에서 누에 두충 복합 추출물 (68.
IL4는 T 림프구를 conA로 자극하였을 때 사이토카인 중가장 낮은 분비량 (8.64 pg/㎖)을 나타내었으며 이에 비하여 오가피를 200 ㎍/㎖농도로 단독 처리하였을 때 (48.02 pg/㎖) 가장 뛰어난 효과를 보였고 맥문동 누에 복합추출물 (38.48 pg/㎖), 육계와 누에 육계 복합추출물 (34.21 pg/㎖) 또한 증가된 IL4 분비량을 나타내었다.
결과적으로 누에 및 10종의 단일 식품 소재 추출물을 단독 으로 사용하였을 때 보다 누에와 식품소재를 함께 추출하였을때 높은 비장세포 증식능을 나타내었으며, 특히 누에 맥문동 복합 추출물과 누에 육계 복합 추출물은 뛰어난 사이토카인 분비량을 나타내어 면역 활성 증진효과가 있다고 판단된다.
단일 소재를 처리하였을 때 뛰어난 마우스 비장세포 증식능을 나타내었던 두충, 오가피, 부추, 육계, 맥문동을 누에와 혼합 하여 마우스 비장세포 증식능을 측정하였다. 그 결과 200 ㎍/㎖ 농도에서 두충을 단독 처리하였을 때는 148.61 %의 마우스 비장세포 증식능을 보인 반면 누에 두충 복합 추출물은 212.93 % 의 마우스 비장세포 증식능을 보여 누에와 복합 추출하였을 때더 높은 증식능을 나타낸 것을 확인하였다. 오가피의 경우 단독 처리하였을 때 (134.
비장은 T 세포, B 세포, 대식세포 등의 여러 가지 림프구가 밀집되어있는 장기 로서 생체 내 면역기능을 담당하는 면역기관이다¹⁸⁾. 누에를 포함한 단일 소재 11종을 마우스 비장세포에 처리한 다음 72 시간동안 배양하여 비장세포 증식능을 측정한 결과, 두충 (128.20%), 오가피 (136.61%), 부추 (120.43%), 육계 (104.04%), 맥문동 (119.70%)이 뛰어난 증식능을 나타내었다.
누에를 포함한 단일 소재 11종의 마우스 비장세포 증식능을 측정한 결과, 100 ㎍/㎖ 농도에서 누에는 102.00%의 증식능을 보였고, 두충 (128.20%), 오가피 (136.61%), 부추 (120.43%), 육계 (104.04%), 맥문동 (119.70%)은 뛰어난 증식능을 나타 내었다. 반면, 당귀 (43.
20%) 높은 마우스 비장세포 증식능을 나타내었다. 맥문동 (153.26%) 또한 누에와 혼합하였을 때 (199.43%) 마우스 비장세포 증식능이 높아져 결과적으로 누에와 복합 추출하였을 때 정도의 차이는 있으나 대체적으로 마우스 비장세포 증식능이 증가하는 것으로 나타났고 누에와 두충, 육계, 맥문동을 복합 추출하였을 때 가장 크게 비장세포 증식능이 증가하는 것으로 나타났다.
70%)은 뛰어난 증식능을 나타 내었다. 반면, 당귀 (43.92%), 우슬 (54.97%), 익지 (76.26%)는 비교적 감소한 모습을 나타내었고 강황 (103.84%), 사삼 (108.21%)은 증가된 마우스 비장세포 증식능을 나타내었으나 두충, 오가피, 부추, 육계, 맥문동과 비교하여 그 효과가 미미하였다.
.본 실험에서 IL12의 분비량은 100 ㎍/㎖ 농도에서 누에 육계 복합추출물 (33.67 pg/㎖)과 50 ㎍/㎖ 농도에서 누에 맥문동복합추출물 (26.49 pg/㎖)이 가장 크게 증가하였다.
. 본 실험에서는 사이토카인중 가장 낮은 분비량 (8.64 pg/㎖)을 나타내었으며 이에 비하여 오가피를 200 ㎍/㎖농도로 단독 처리하였을 때 (48.02 pg/㎖) 대조군에 비해 약 5.5배 증가하여 가장 뛰어난 효과를 보였고 맥문동 누에 복합추출물 (38.48 pg/㎖), 육계와 누에 육계 복합추출물 (34.21 pg/㎖)는 동일하게 증가된 IL4 분비량을 나타내었다.
단일 소재를 처리하였을 때 마우스 비장세포 증식능 실험 결과를 토대로 선정된 두충, 오가피, 부추, 육계, 맥문동을 누에와 혼합하여 마우스 비장세포에 처리한 다음 증식능을 계산 하였다. 실험 결과, 누에를 200 ㎍/㎖ 농도에서 단독으로 비장세포에 처리하였을 때 (171.87 %) 보다 누에와 두충 (212.93 %), 육계 (182.44 %)를 복합 추출하였을 때 비장세포 증식능이 증가하는 것으로 나타났다.

후속연구

이상의 결과들로 누에 및 식품소재를 단일소재로 사용하였을때 보다 누에 복합 추출물은 비교적 높은 면역 활성 증진 효과를 가지고 있고 특히 누에 맥문동 추출물 및 육계 누에 복합 추출 물은 사이토카인을 증가시켜 면역력 감소를 예방하는 기능성 식품 소재로 활용될 가능성이 있을 것으로 기대된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	누에에 포함된 대표적인 약리성분은 무엇인가?	약리적으로는 소장의 당분해효소 a-glucosidase 억제 작용에 기인한다는 보고가 있고3) , 피부미용4) , 간기능개선5) , 면역력 증강6) , 피로회복7) 에 좋은 것으로 알려져 있다. 또한 누에는 단백질을 67% 이상 함유한 고단백 식품으로 serine, tyrosine, aspartic acid, alanin, mracin 등이 대표적인 약리 성분이다8) .
	혈당강하용 건강기능식품에 사용되는 누에는 어떠한 것인가?	누에 (Bombyx mori L.)는 혈당강하용 건강기능식품 소재로 널리 쓰이고 있으며1) 대체적으로 5령 3일 (부화 후 19일) 누에를 열수 또는 수증기로 익히고 난 후 분말로 제조하여 사용 한다2) . 약리적으로는 소장의 당분해효소 a-glucosidase 억제 작용에 기인한다는 보고가 있고3) , 피부미용4) , 간기능개선5) , 면역력 증강6) , 피로회복7) 에 좋은 것으로 알려져 있다.
	약리적으로 누에는 어떠한 효능을 가지고 있는가?	)는 혈당강하용 건강기능식품 소재로 널리 쓰이고 있으며1) 대체적으로 5령 3일 (부화 후 19일) 누에를 열수 또는 수증기로 익히고 난 후 분말로 제조하여 사용 한다2) . 약리적으로는 소장의 당분해효소 a-glucosidase 억제 작용에 기인한다는 보고가 있고3) , 피부미용4) , 간기능개선5) , 면역력 증강6) , 피로회복7) 에 좋은 것으로 알려져 있다. 또한 누에는 단백질을 67% 이상 함유한 고단백 식품으로 serine, tyrosine, aspartic acid, alanin, mracin 등이 대표적인 약리 성분이다8) .

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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