RAW264.7 대식세포에서 Heme Oxygenase-1의 유도에 의한 개망초 (Erigeron annuus L.) 꽃 Methanol 추출물의 항염증 효과 Anti-Inflammatory Effect of Erigeron annuus L. Flower Extract through Heme Oxygenase-1 Induction in RAW264.7 Macrophages원문보기
본 연구에서는 LPS에 의해 활성화된 RAW264.7 대식세포에서의 NO 생성 및 iNOS와 HO-1 단백질 발현의 변화를 측정하여 개망초(Erigeron annuus L.) 꽃(EAF) methanol 추출물의 항염증 효과를 확인하였다. RAW264.7 대식세포에 LPS를 처리한 결과 NO의 함량이 11.48 ${\mu}m$ 수준으로 증가하였다. 그러나 EAF methanol 추출물(25, 50, 100, 200 ${\mu}g$/mL)을 처리하였을 때 NO의 함량이 12.82, 9.61, 6.83, 2.52 ${\mu}m$로 농도 의존적으로 감소하였다. 또한 EAF methanol 추출물은 NO의 생성에 관여하는 iNOS 단백질의 발현을 농도 의존적으로 저해하였으며 HO-1 단백질의 발현을 유도하였다. EAF methanol 추출물에 의한 HO-1 발현이 NO 생성에 미치는 영향에 대해 확인하기 위해 HO-1의 inhibitor인 ZnPP를 사용하였다. 실험결과 ZnPP를 처리하여 HO-1의 발현을 저해하였을 때 추출물에 의해 감소된 NO의 함량이 다시 증가되었다. 본 연구 결과, EAF methanol 추출물은 염증을 유발하는 중요 인자인 NO를 저해하였고, iNOS의 발현을 억제시켰으며 산화적 손상으로부터 세포 보호 방어 기작에 관여하는 HO-1의 발현 등 항염증에 우수한 효과를 보였으며 항염증 연구의 기초 자료로 활용될 것으로 예상된다.
본 연구에서는 LPS에 의해 활성화된 RAW264.7 대식세포에서의 NO 생성 및 iNOS와 HO-1 단백질 발현의 변화를 측정하여 개망초(Erigeron annuus L.) 꽃(EAF) methanol 추출물의 항염증 효과를 확인하였다. RAW264.7 대식세포에 LPS를 처리한 결과 NO의 함량이 11.48 ${\mu}m$ 수준으로 증가하였다. 그러나 EAF methanol 추출물(25, 50, 100, 200 ${\mu}g$/mL)을 처리하였을 때 NO의 함량이 12.82, 9.61, 6.83, 2.52 ${\mu}m$로 농도 의존적으로 감소하였다. 또한 EAF methanol 추출물은 NO의 생성에 관여하는 iNOS 단백질의 발현을 농도 의존적으로 저해하였으며 HO-1 단백질의 발현을 유도하였다. EAF methanol 추출물에 의한 HO-1 발현이 NO 생성에 미치는 영향에 대해 확인하기 위해 HO-1의 inhibitor인 ZnPP를 사용하였다. 실험결과 ZnPP를 처리하여 HO-1의 발현을 저해하였을 때 추출물에 의해 감소된 NO의 함량이 다시 증가되었다. 본 연구 결과, EAF methanol 추출물은 염증을 유발하는 중요 인자인 NO를 저해하였고, iNOS의 발현을 억제시켰으며 산화적 손상으로부터 세포 보호 방어 기작에 관여하는 HO-1의 발현 등 항염증에 우수한 효과를 보였으며 항염증 연구의 기초 자료로 활용될 것으로 예상된다.
This study investigated the anti-inflammatory effect of Erigeron annuus L. flower (EAF) methanol extract. We examined the involvement of heme oxygenase-1 (HO-1) in the inhibitory activities of EAF methanol extract on nitric oxide (NO) production in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW264.7 macrop...
This study investigated the anti-inflammatory effect of Erigeron annuus L. flower (EAF) methanol extract. We examined the involvement of heme oxygenase-1 (HO-1) in the inhibitory activities of EAF methanol extract on nitric oxide (NO) production in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW264.7 macrophages. Cell viability and NO assays were performed. In addition, inducible nitric oxide synthase (iNOS) and HO-1 expressions were detected by Western blotting and blocking HO-1 activity on NO production. EAF methanol extract (25, 50, 100, 200 ${\mu}g$/mL) significantly inhibited LPS-stimulated NO production (p<0.05; 12.82, 9.61, 6.83, 2.52 ${\mu}m$) in a concentration-dependent manner. EAF methanol extract also reduced the expression of iNOS protein. The EAF methanol extract induced the expression of HO-1 in a dose-dependent manner. Blockage of HO-1 activity by zinc protoporphyrin suppressed EAF methanol extract-induced reductions in the production of NO. The present results suggest that EAF methanol extract has a potent anti-inflammatory effect in RAW264.7 macrophages through the induction of HO-1.
This study investigated the anti-inflammatory effect of Erigeron annuus L. flower (EAF) methanol extract. We examined the involvement of heme oxygenase-1 (HO-1) in the inhibitory activities of EAF methanol extract on nitric oxide (NO) production in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW264.7 macrophages. Cell viability and NO assays were performed. In addition, inducible nitric oxide synthase (iNOS) and HO-1 expressions were detected by Western blotting and blocking HO-1 activity on NO production. EAF methanol extract (25, 50, 100, 200 ${\mu}g$/mL) significantly inhibited LPS-stimulated NO production (p<0.05; 12.82, 9.61, 6.83, 2.52 ${\mu}m$) in a concentration-dependent manner. EAF methanol extract also reduced the expression of iNOS protein. The EAF methanol extract induced the expression of HO-1 in a dose-dependent manner. Blockage of HO-1 activity by zinc protoporphyrin suppressed EAF methanol extract-induced reductions in the production of NO. The present results suggest that EAF methanol extract has a potent anti-inflammatory effect in RAW264.7 macrophages through the induction of HO-1.
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문제 정의
예로부터 소화불량, 장염으로 인한 복통 및 설사 치료, 혈당 강하작용 등의 약효가 있어 민간요법으로 널리 이용되는 것으로 알려져 있다(12). 본 연구에서는 개망초 꽃(EAF) methanol 추출물의 항염증 효과를 알아보기 위하여 lipopolysaccharide(LPS)로 염증을 유도하여 활성화된 RAW264.7 대식세포에서 염증 반응의 중요 매개물질 억제 효과, 즉 NO의 생성에 미치는 영항과 iNOS 단백질 발현에 미치는 영향에 대해 알아보고 EAF methanol 추출물이 HO1의 발현에 미치는 영향을 연구하여 EAF methanol 추출물의 항염증 효과에 미치는 HO-1의 역할을 규명하고자 하였다.
제안 방법
3). EAF methanol 추출물에 의한 HO-1 발현이 NO 생성에 미치는 영향에 대해 확인하기 위해 HO-1의 inhibitor인 ZnPP를 사용하였다. 실험결과 ZnPP를 처리하여 HO-1의 발현을 저해하였을 때 추출물에 의해 감소된 NO의 함량이 다시 증가되었다(Fig.
1). MTT assay를 이용하여 RAW264.7 대식세포에서 EAF methanol 추출물의 세포독성을 확인하였다. EAF methanol 추출물을 농도별로(25, 50, 100, 200 μg/mL) 처리한 결과, 모든 농도에서 90% 이상의 생존율을 보여 EAF methanol 추출물은 RAW264.
NO 생성 억제에 대한 실험결과를 토대로 iNOS 생성에 미치는 EAF methanol 추출물의 영향을 확인하기 위하여 LPS에 의해 활성화된 RAW264.7 대식세포에 EAF methanol 추출물을 농도별로(25, 50, 100, 200 μg/mL) 처리하여 Western blotting을 통해 iNOS 단백질의 발현을 확인하였다(Fig. 2).
RAW264.7 대식세포를 1.0×106 cells/well의 농도로 6- well plate에 분주하여 6시간 배양한 후에 EAF methanol 추출물을 농도별(25, 50, 100, 200 μg/mL)로 처리한 다음, LPS(1 μg/mL)를 처리하여 24시간 배양하였다.
RAW264.7 대식세포를 1.5×105 cells/well의 농도로 96-well plate에 분주하여 6시간 배양한 후에 EAF methanol 추출물을 농도별(25, 50, 100, 200 μg/mL)로 처리한 다음, LPS(1 μg/mL)를 처리하여 24시간 배양하였다.
개망초 꽃 10 g에 100% methanol 300 mL을 가한 뒤 상온에서 24시간 동안 혼합하여 개망초 꽃으로부터 유용성분을 추출하였다. 추출 후 잔사는 filter paper(TOYO, No.
따라서 EAF methanol 추출물의 처리 농도를 RAW264.7 대식세포에서 독성을 보이지 않은 25, 50 100, 200 μg/mL로 하여 다음 실험을 진행하였다.
본 연구에서는 LPS에 의해 활성화된 RAW264.7 대식세포에서의 NO 생성 및 iNOS와 HO-1 단백질 발현의 변화를 측정하여 개망초(Erigeron annuus L.) 꽃(EAF) methanol 추출물의 항염증 효과를 확인하였다. RAW264.
세포 배양액 150 μL와 Griess 시약 20 μL를 혼합하여 37℃에서 10분 동안 incubator에서 반응시킨 후, ELISA reader를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였고 sodium nitrate로 표준곡선을 작성하여 NO의 함량을 산출하였다(13).
대상 데이터
(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였으며 zinc protoporphyrin IX(ZnPP)는 Frontier scientific Inc.(Logan)에서 구입하여 사용하였다. 그 밖에 사용된 추출용매 및 시약은 analytical 및 HPLC 등급을 사용하였다.
본 실험에 사용된 개망초 꽃은 충북대학교 원예과학과에서 제공받아 사용하였다. DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)와 FBS(Fetal bovine serum)는 Hyclone(Logan, UT, USA)사에서 구입하였다.
실험에 사용된 RAW264.7 대식세포는 한국세포주은행(KCLB, Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 분양 받아 사용하였다. RAW264.
데이터처리
대조군과 각 시료로부터 얻은 실험 결과들의 유의성을 검정하기 위하여 분산분석(ANOVA)을 행한 후 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test를 실시하였으며, 그 결과는 평균±표준편차로 표시하였다.
이론/모형
EAF methanol 추출물의 세포 독성은 MTT(3-(4,5- dimethylthiazol-2-ly)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) assay를 이용하여 측정하였다(14). RAW264.
성능/효과
EAF methanol 추출물을 농도별로(25, 50, 100, 200 μg/mL) 처리한 결과, 모든 농도에서 90% 이상의 생존율을 보여 EAF methanol 추출물은 RAW264.7 대식세포에서 독성을 나타내지 않은 것을 확인하였다(Fig. 1).
EAF methanol 추출물을 처리한 결과 LPS 처리에 의해 증가한 iNOS 단백질 발현이 25, 50 μg/mL에서는 유의적인 차이를 보이지 않았으나 100, 200 μg/mL 처리하였을 때는 감소하였으며 200 μg/mL을 처리하였을 때의 iNOS 단백질 발현은 LPS를 처리하지 않은 상태와 비슷한 수준으로 감소되었다.
LPS를 처리한 RAW264.7 대식세포에서 생성된 NO의 함량이 11.48 μM 수준으로 증가하였으며 EAF methanol 추출물을 농도별로(25, 50, 100, 200 μg/mL) 처리하였을 때 12.82, 9.61, 6.83, 2.52 μM로 농도 의존적으로 감소되는 것으로 나타났다(Fig. 1).
Kim 등(26)과 Hwangbo 등(27)은 Chrysanthemum boreale Makino와 Tussilago farfara 추출물에 의해 유도된 HO-1이 항염증 특성을 조절한다고 보고하였다. 본 실험결과 EAF methanol 추출물에 의해 발현된 HO-1은 NO의 생성을 억제할 수 있으며 이로 인해 염증 반응에 효과가 있다는 것을 확인할 수 있었다. 염증 반응에 관여하는 iNOS 단백질의 발현과 NO의 생성은 NF-κB의 inactivation을 통해 억제되며 NF-κB의 inactivation은 mitogen-activated protein kinase(MAPK) signaling pathway에 의해 조절된다는 연구가 보고되어 있다(28).
latilobum 추출물은 iNOS 단백질 발현도 효과적으로 저해한다고 보고하였다. 본 연구 결과 EAF methanol 추출물의 NO 생성 억제와 iNOS 단백질 발현 저해는 유사한 경향을 나타내었다. 따라서 EAF methanol 추출물에 의한 iNOS 단백질의 발현 억제는 NO의 생성 억제에 영향을 미친다고 판단된다.
또한, HO-1의 발현이 iNOS의 발현과 iNOS에 의해 유도되는 NO의 생성을 억제하며 이는 NF-κB의 inactivation을 통해 조절된다는 연구가 보고된바 있다(29). 본 연구결과 EAF methanol 추출물의 항염증 효과는 iNOS의 발현을 억제하고, HO-1의 발현을 유도하여 NO의 생성을 조절하는 것으로 판단된다. 따라서 EAF methanol 추출물이 iNOS 발현과 NO 생성을 조절하는 NF-kB의 활성, MAPK signaling pathway에 관여하며 MAPK의 활성이 HO-1의 발현에 미치는 영향에 대해 연구되어야 할 것으로 생각한다.
EAF methanol 추출물에 의한 HO-1 발현이 NO 생성에 미치는 영향에 대해 확인하기 위해 HO-1의 inhibitor인 ZnPP를 사용하였다. 실험결과 ZnPP를 처리하여 HO-1의 발현을 저해하였을 때 추출물에 의해 감소된 NO의 함량이 다시 증가되었다(Fig. 4). HO-1의 heme 분해에 의해 생성된 CO와 biliverdin/bilirubin은 iNOS와 COX-2의 활성과 발현 및 NO의 생성을 억제하며 biliverdin은 pro-inflammatory cytokines인 IL-6와 IL-1β의 생성을 억제시키는 것으로 보고되었다(24,25).
EAF methanol 추출물에 의한 HO-1 발현이 NO 생성에 미치는 영향에 대해 확인하기 위해 HO-1의 inhibitor인 ZnPP를 사용하였다. 실험결과 ZnPP를 처리하여 HO-1의 발현을 저해하였을 때 추출물에 의해 감소된 NO의 함량이 다시 증가되었다(Fig. 4).
후속연구
본 연구결과 EAF methanol 추출물의 항염증 효과는 iNOS의 발현을 억제하고, HO-1의 발현을 유도하여 NO의 생성을 조절하는 것으로 판단된다. 따라서 EAF methanol 추출물이 iNOS 발현과 NO 생성을 조절하는 NF-kB의 활성, MAPK signaling pathway에 관여하며 MAPK의 활성이 HO-1의 발현에 미치는 영향에 대해 연구되어야 할 것으로 생각한다.
실험결과 ZnPP를 처리하여 HO-1의 발현을 저해하였을 때 추출물에 의해 감소된 NO의 함량이 다시 증가되었다. 본 연구 결과, EAF methanol 추출물은 염증을 유발하는 중요 인자인 NO를 저해하였고, iNOS의 발현을 억제시켰으며 산화적 손상으로부터 세포 보호 방어 기작에 관여하는 HO-1의 발현 등 항염증에 우수한 효과를 보였으며 항염증 연구의 기초 자료로 활용될 것으로 예상된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
일반적인 NO의 형성은 체내에 어떤 역할을 하는가?
대식세포는 숙주의 항상성 유지와 같은 여러 종류의 숙주 반응에 관여하는 것으로 알려져 있으며, nitric oxide(NO)와 cytokine을 분비하여 염증 반응 시 생체 방어에 중요한 역할을 하는 세포로 알려져 있다(4). 일반적인 NO의 형성은 신경계 및 면역계에서 중요한 전달 물질로 작용하여 박테리아를 사멸시키거나 종양을 제거하는 중요한 역할을 하지만, 과도한 NO의 형성은 염증을 유발시키게 되며 조직의 손상, 유전자 변이, 신경 퇴행성 질병 등의 발생에 관여한다(5,6). Nitric oxide synthase(NOS)는 NO 생성에 관여하는 효소로 세포의 종류에 따라 신경성 NOS(nNOS), 내피성 NOS(eNOS), 유도성 NOS(iNOS)로 구분되며 그중 iNOS는 NO의 과발현에 영항을 미치며 다양한 세포에서 유도되어 병리생태학적 관점에서 중요한 역할을 한다(7).
염증이란?
염증은 외부 자극에 대한 생체조직의 국소적 방어반응 중 하나이다. 염증이 발생하면 여러 가지 염증매개인자들이 생성되며 이로 인하여 발열, 홍반, 부종, 기능 장애 등의 증상이 나타난다(1-3).
민간요법에서 사용되는 개망초는 어떤 효능이 있는가?
)는 국화과에 속하는 두해살이풀로서 한국에서 흔히 볼 수 있다. 예로부터 소화불량, 장염으로 인한 복통 및 설사 치료, 혈당 강하작용 등의 약효가 있어 민간요법으로 널리 이용되는 것으로 알려져 있다(12). 본 연구에서는 개망초 꽃(EAF) methanol 추출물의 항염증 효과를 알아보기 위하여 lipopolysaccharide(LPS)로 염증을 유도하여 활성화된 RAW264.
참고문헌 (29)
Sarkar D, Fisher PB. 2006. Molecular mechanisms of aging-associated inflammation. Cancer Lett 236: 13-23.
Fierro IM, Serhan CN. 2001. Mechanisms in anti-inflammation and resolution: the role of lipoxins and aspirin-triggered lipoxins. Braz J Med Biol Res 34: 555-566.
Yun HJ, Hoe SK. 2008. Anti-inflammatory effect of Injinhotang in RAW 264.7 cells. Korean J Herbol 23: 169-178.
Higuchi M, Higashi N, Taki H, Osawa T. 1990. Cytolytic mechanism of activated macrophages. Tumor necrosis factor and L-arginine-dependent mechanism act as synergistically as the major cytolytic mechanism of activated macrophages. J Immunol 144: 1425-1431.
Jaffrey SR, Snyder SH. 1995. Nitric oxide: a neural messenger. Annu Rev Cell Dev Biol 11: 417-440.
Choi YJ, Jo WS, Kim HJ, Nam BH, Kang EY, Oh SJ, Lee GA, Jeong MH. 2010. Anti-inflammatory effect of Chlorella ellipsoidea extracted from seawater by organic solvents. Korean J Fish Aquat Sci 43: 39-45.
Yoo NH, Jang DS, Yoo JL, Lee YM, Cho JH, Kim JS. 2008. Erigeron flavanone, a flavanone derivative from the flowers of Erigeron annuus with protein glycation and aldose reductase inhibitory activity. J Nat Prod 71: 713-715.
Bae IK, Min HY, Han AR, Seo EK, Lee SK. 2005. Suppression of lipopolysaccharide-induced expression of inducible nitric oxide synthase by brazilin in RAW 264.7 macrophage cells. Eur J Pharmacol 513: 237-242.
Kim JH, Kim DH, Beak SH, Lee HJ, Kim MR, Kwon HJ, Lee CH. 2006. Rengyolone inhibits inducible nitric oxide synthase expression and nitric oxide production by downregulation of NF- ${\kappa}B$ and p38 MAP kinase activity in LPSstimulated RAW 264.7 cells. Biochem Pharmacol 71: 1198-1205.
Jeoung YJ, Choi SY, An CS, Jeon YH, Park DK, Lim BO. 2009. Comparative effect on anti-inflammatory activity of the Phellinus lintesus and Phellinus linteus grown in germinated brown rice extracts in murine macrophage RAW264.7 cells. Korean J Med Crop Sci 17: 97-101.
Weisz A, Cicatiello I, Esumi H. 1996. Regulation of the mouse inducible-type nitric oxide synthase gene promoter by interferonnn-gamma, bacterial lipopolysaccharide and NG-monomethyl-L-arginene. Biochem J 316: 209-215.
Lee MH, Lee JM, Jun SH, Lee SH, Kim NW, Lee JH, Ko NY, Mun SH, Kim BK, Lim BO, Choi DK, Choi WS. 2007. The anti-inflammatory effects of Pyrolae herva extract through the inhibition of the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and NO production. J Ethnopharmacol 112: 49-54.
Jang MH, Shin MC, Kim YJ, Kim CJ, Kim Y, Kim EH. 2004. Atractylodes japonica suppresses lipopolysaccharide-stimulated expressions of inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 in RAW 264.7 macrophages. Biol Pharm Bull 27: 324-327.
Zhao F, Wang L, Liu K. 2009. In vitro anti-inflammatory effects of arctigenin, a lignan from Arctium lappa L. through inhibition on iNOS pathway. J Ethnopharmacol 122: 457-462.
Hung YC, Guh JH, Cheng ZJ, Chang YL, Hwang TL, Liao CH, Tzeng CC, Teng CM. 2001. Inhibition of the expression of inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 in macrophages by 7HQ derivatives: involvement of IkappaBalpha stabilization. Eur J Pharmacol 418: 133-139.
Park SC, Son DY. 2011. Inhibitory effects of Euphorbia supina Rafin on the production of pro-inflammatory mediator by LPS-stimulated RAW264.7 macrophages. J Korean Soc Food Sci Nutr 40: 486-492.
Han J, Kim Y, Sung J, Um Y, Lee Y, Lee J. 2009. Suppressive effects of Chrysanthemum zaxadskii var. latilobum flower extracts on nitric oxide production and inducible nitric oxide synthase expression. J Korean Soc Food Sci Nutr 38: 1685-1690.
Nakao A, Otterbein LE, Overhaus M, Sarady JK, Tsung A, Kimixuka K, Nalesnik MA, Kaizu T, Uchiyama T, Liu F, Murase N, Bauer AJ, Bach FH. 2004. Biliverdin protects the functional integrity of a transplanted syngeneic small bowel. Gastroenterology 127: 595-606.
Kim Y, Sung J, Sung M, Choi Y, Jeong HS, Lee J. 2010. Involvement of heme oxygenase-1 in the anti-inflammatory activity of Chrysanthemum boreale Makino extracts on the expression of inducible nitric oxide synthase in RAW264.7 macrophages. J Ethnopharmacol 131: 550-554.
Hwangbo C, Lee HS, Park J, Choe J, Lee JH. 2009. The anti-inflammatory effect of tussilagone, from Tussilago farfara, is mediated by the induction of heme oxygenase-1 in murine macrophages. Int Immunopharmacol 9: 1578-1584.
Yoon WJ, Moon JY, Song G, Lee YK, Han MS, Lee JS, Ihm BS, Lee WJ, Lee NH, Hyun CG. 2010. Artemisia fukudo essential oil attenuate LPS-induced inflammation by suppressing NF- ${\kappa}B$ and MAPK activation in TAW 264.7 macrophages. Food Chem Toxicol 48: 1222-1229.
Srisook K, Palachot M, Mongkol N, Srisook E. 2011. Antiinflammatory effect of ethyl acetate extract from Cissus quadrangularis Linn may be involved with induction of heme oxygenae-1 and suppression of NF- ${\kappa}B$ activation. J Ethnopharmacol 133: 1008-1014.
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