[논문]Lipopolysaccharide로 활성화된 RAW264.7세포에서 염증반응사이토카인 발현에 대한 Epigallocatechin gallate의 억제효능연구

서은지; 고준; 김지은; 고은경; 송성화; 성지은; 박찬규; 이현아; 김동섭; 손홍주; 이충열; 이희섭; 황대연

doi:10.5352/jls.2015.25.9.961

Lipopolysaccharide로 활성화된 RAW264.7세포에서 염증반응사이토카인 발현에 대한 Epigallocatechin gallate의 억제효능연구
Suppressive Effects of Epigallocatechin Gallate Pretreatment on the Expression of Inflammatory Cytokines in RAW264.7 Cells Activated by Lipopolysaccharide 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.25 no.9 = no.185, 2015년, pp.961 - 969

초록
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Epigallocatechin gallate (EGCG)는 녹차(Camellia sinensis, green tea)에 포함되어 있는 대표적인 카테킨(Catechin)으로, 당뇨(diabetes), 신경퇴행성 질환(neurodegenerative disorders), 암(cancer), 심혈관계 질환(cardiovascular disease), 비만(obesity) 등의 다양한 임상질환에 우수한 치료효과를 나타내는 것으로 알려왔다. 본 연구에서는 EGCG가 LPS (Lipopolysaccaride)로 자극된 RAW264.7 세포의 염증억제과정에서 Nitric oxide (NO)관련인자와 사이토카인 발현에 미치는 영향을 분석하기 위해, NO농도, inducible NO synthase (iNOS) 발현량, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10 사이토카인의 발현량을 분석하였다. 먼저, EGCG (100-400 μM)를 처리한 Raw264.7 세포에서 특이적인 독성이 나타나지 않음을 확인하였으며, 이후 Raw264.7 세포에 4가지 다른 농도(0.1, 0.5, 1.0, 5.0 μg/ml)의 LPS를 처리한 후 MTT분석, NO농도분석, IL-6농도분석을 실시하여, 염증을 유발할 수 있는 최적 LPS 농도를 1 μg/ml로 설정하였다. NO농도를 분석한 결과, LPS를 처리한 그룹이 No그룹에 비하여 급속히 증가하여 63 μmol/l까지 증가하였으나 400 μM EGCG를 처리한 그룹에서만 68.2% 정도 감소하였으며, 동시에 iNOS 발현 양상은 200, 400 μM EGCG/LPS 처리 그룹에서 각각 12.3%, 17.4% 감소하였다. 또한, 감소비율에는 차이가 있었으나, anti-inflammatory 사이토카인(IL-1β, TNF-α)과 pro-inflammatory 사이토카인(IL-10)의 발현은 EGCG/LPS 처리에 따라 유의적으로 감소하였다. 그러나, IL-6단백질과 mRNA 농도는 Vehicle/LPS 처리 그룹과 EGCG/LPS 처리 그룹에서 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 따라서, 본 연구의 결과는 EGCG가 LPS의 자극에 의해 활성화된 Raw264.7 세포를 효과적으로 억제하는 효능을 나타냄을 제시하고 있으며, 이러한 과정에 사이토카인들이 서로 다르게 특이적 반응을 중계함을 제시하고 있다.

Abstract ▼ AI-Helper

Epigallocatechin gallate (EGCG), the main catechin in green tea, has been shown to have some beneficial effects against various human diseases, including diabetes, neurodegenerative disorders, cancer, cardiovascular disease and obesity. To investigate the mechanism of the suppressive effects of EGCG on inflammatory response in macrophages, alterations on the levels of nitric oxide (NO) regulatory factors and inflammatory cytokines were measured in lipopolysaccharide (LPS)-activated RAW264.7 cells. No significant toxicity was detected in RAW264.7 cells treated with 100–400 μM EGCG. Moreover, the optimal concentration of LPS was determined to be 1 μg/ml based on the results of cell viability assay, NO assay and IL-6 enzyme-linked immunsorbent assay (ELISA). Furthermore, NO levels decreased significantly by 68.2% in the 400 μM EGCG/LPS treated group, while the level of inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression decreased by 12-17% in the 200 and 400 μM EGCG/LPS treated group. A significant decrease in transcription of pro-inflammatory cytokines (TNF- α and IL-1β) and anti-inflammatory cytokine (IL-10) was also detected in the EGCG/LPS treated group. However, IL-6 transcript and protein was maintained at a constant level when in the LPS treated group relative to the EGCG/LPS treated group. Overall, these results suggest that the differential regulation of inflammatory cytokines is an important factor influencing the suppressive effects of EGCG against LPS-activated inflammatory response in RAW264.7 cells.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 EGCG가 LPS로 자극된 RAW264.7 세포에서 염증억제과정의 NO관련인자와 사이토카인 발현에 미치는 영향을 분석하기 위해, NO농도, iNOS 발현량, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10 사이토카인의 발현량을 분석하였다. 이러한 결과는 EGCG는 NO생성과 iNOS 발현 억제, IL-1β, TNF-α, IL-10 발현 억제를 통해 염증반응을 조절하지만 IL-6 발현에는 영향을 미치지 못함을 제시하고 있다.
7 세포에 미치는 항염증 작용 기전에 대한 분석은 부족한 상황이다. 따라서, 본 연구에서는 LPS에 의해 유도된 염증반응에서 NO농도, iNOS 발현, pro-inflammatory와 anti-inflammatory 사이토카인의 발현에 미치는 EGCG의 영향을 분석하고자 하였다. 특히, 본 연구에서는 EGCG가 LPS에 의해 유도된 IL-1β, TNF-α, IL-10의 발현 을 억제하는 효과를 나타내었지만 IL-6의 발현에는 영향을 주 지 못함을 제시하고 있다.
81 μM) 농도까지도 생존율에 특이적인 영향을 미치지 않았다[16, 30]. 본 연구에서는 RAW264.7 세포는 400 μM EGCG까지 특이적 인 독성을 나타내지 않아 이전의 결과와 동일한 경향을 나타내었다.

제안 방법

EGCG가 염증반응에 미치는 영향을 분석하기 전에, 먼저 EGCG의 최대처리농도를 결정하기 위하여, RAW264.7 세포에 EGCG를 농도별로 처리한 뒤 24시간 동안 배양한 후 세포 형태를 관찰하고 MTT분석을 실시하였다. 그 결과, EGCG는 400 μM 농도까지도 RAW264.
7 세포를 96 well plate (5×10⁴세포 /well)에 분주하여 24시간 배양하여 안정화시켰다. EGCG의 적정농도 설정을 위한 실험에서는 이들 세포에 멸균 증류수 (Vehicle)와 100, 200, 400 μM EGCG를 처리하였고, LPS의 적 정농도 설정을 위한 실험에서는 멸균 증류수와 0.1, 0.5, 1.0, 5.0 μg/ml LPS를 처리하여 24시간 배양하였다. 최종적으로 준비된 세포로부터 배지를 제거하고, MTT 용액(2,000 μg/ml) 을 50 μl 첨가한 뒤, 4시간 동안 추가 배양하였다.
7 세포를 5×10⁴세포/well 농도로 96 well plate에 분주하여 24시간 배양하였다. LPS 적 정농도 설정을 위한 실험에서 RAW264.7 세포를 5×10⁴세포 /well 농도로 96 well plate에 분주하여 24시간 배양하여 0.1, 0.5, 1.0, 5.0 μg/ml LPS로 자극하여 24시간 배양하였다. 또한, EGCG의 항염증 효과를 측정하는 실험에서 적절히 배양된 RAW264.
LPS에 의해 유발된 RAW264.7 세포의 anti-inflammatory 사이토카인과 pro-inflammatory 사이토카인의 발현에 미치는 영향을 분석하기 위해, RT-PCR을 이용하여 IL-1β, TNF-α, IL-10, IL-6의 발현을 관찰하였다. 그 결과, IL-1β과 TNF-α의 발현은 LPS 처리에 의해 급격히 374% 혹은 297% 증가하였지 만 EGCG 처리에 의해 감소하였다.
LPS에 의해 유발된 RAW264.7 세포의 염증과정에서 NO 생성과 iNOS 발현에 미치는 EGCG의 예방효과를 평가하기 위하여, RAW264.7 세포에 2시간 동안 50, 100, 200, 400 μM EGCG를 처리한 후 1 μg/ml LPS로 24시간 자극하여 NO농도 와 iNOS의 발현을 분석하였다. 먼저, RAW264.
RAW264.7 세포로부터 생성되는 NO농도는 세포배양액 중 존재하는 NO₂의 형태로 Nitric oxide assay kit (ab65328, ABcam, Cambridge, UK) 및 Griess reagent (1% sulfanila- mide + 0.2% N-Naphthylethylened-iamine 2HCl + 2.5% H₃PO₄)를 이용하여 측정하였다. LPS의 적정농도 설정을 위한 실험에서 NO 농도는 Nitric oxide assay kit를 이용하여 회사 의 권장법에 따라 측정되었다.
RAW264.7 세포에서 발현되는 IL-1β, iNOS, IL-10, TNF-α, IL-6의 유전자 발현에 대한 EGCG의 효과를 조사하기 위해 RT-PCR을 수행하였다. RAW264.
RAW264.7 세포에서 염증을 유발할 수 있는 최적 LPS 농도를 설정하기 위해, RAW264.7 세포에 4가지 다른 농도(0.1, 0.5, 1.0, 5.0 μg/ml)의 LPS를 처리한 후 MTT분석, NO농도분석, IL-6농도분석을 실시하였다. 그 결과, RAW264.
3 pg/ml. Triplicate trials per group were evaluated by NO assay and ELISA assay. The data shown represent the means ± SD of three replicates.
)용액을 150 μl씩 첨가하여 formazan을 녹였다. 각 well에 나타난 색깔의 변화를 VersaMax ELISA Microplate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 570nm에서 측정하였다. 한편, 각 추출물의 처리조건에 따른 세포주의 변화를 위상차 도립현미경(Leica Microsystems, Heerbrugg, Switzer-land)을 이용하여 400x 배율에서 관찰하였다.
4A). 더불어, RT-PCR의 결과에서 관찰된 EGCG 처리에 의해 IL-6 의 발현에 변화를 확인하기 위하여, IL-6단백질의 농도를 ELISA로 측정하였다. 그 결과, IL-6단백질의 농도도 RT-PCR 의 결과와 유사하게 유의적인 변화가 없었다(Fig.
0 μg/ml LPS로 자극하여 24시간 배양하였다. 또한, EGCG의 항염증 효과를 측정하는 실험에서 적절히 배양된 RAW264.7 세포에 100, 200, 400 μM EGCG를 2시간 동안 전처 리하고 1.0 μg/ml LPS로 자극하여 24시간 배양하였다. 그 후 항체로 코팅된 well을 washing solution으로 세척한 후 각 well에 assay buffer (200 μl)를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다.
7 세포를 자극하기 위해서 사용되는 LPS의 농도는 매우 다양하며, 대부분 50 ng/ml [14], 100 ng/ml [7], 10 μg/ ml [30]의 범위에서 사용되고 있다. 본 연구에서는 0.1, 0.5, 1, 5 μg/ml의 낮은 농도의 LPS를 사용하여 RAW264.7 세포를 자극하였으나 성공적으로 염증반응을 유발하였다. 또한, LPS 농도 증가에 따른 NO생성량과 IL-6분비량은 특이적인 변화가 관찰되지 않았지만 일부 고농도에서 증가하는 현상을 관찰할 수 있었다.
세포를 회수하여 RNA-Bee (Tel- Test, Friendswood, TX) 시약을 이용하여 제조사의 권장법을 이용하여 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA (3-5 μg)와 oligo-(dT) primer, DEPC 처리된 dH₂O를 이용하여 70℃에서 10분 조건 후 5x buffer (Roche, Mannheim, Germany), 10 mM dNTP (Roche), 0.1 M DTT (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), Superscript (Invitrogen)를 이용하여 25℃에서 10분, 42℃에서 50분, 90℃에서 5분 조건에서 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA에 대한 PCR을 수행하기 위해 cDNA 2.
7 세포를 5×10⁵ 세포/well 농 도로 6 well plate에 분주하여 24시간 배양하여 100, 200, 400 μM EGCG를 2시간 동안 전처리하고 1 μg/ml LPS로 자극하여 24시간 배양하였다. 세포를 회수하여 RNA-Bee (Tel- Test, Friendswood, TX) 시약을 이용하여 제조사의 권장법을 이용하여 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA (3-5 μg)와 oligo-(dT) primer, DEPC 처리된 dH₂O를 이용하여 70℃에서 10분 조건 후 5x buffer (Roche, Mannheim, Germany), 10 mM dNTP (Roche), 0.
2C). 이러한 결과를 바탕으로, 본 연구에서는 RAW264.7 세포를 활성화시키기 위한 최적의 LPS 농도를 1.0 μg/ml로 설정하여 EGCG의 억제효능 평가에 적용 하였다.
7 세포 생존율에 유의적인 감소 를 유도하지 않았다. 이러한 결과를 통해 EGCG가 대식세포의 염증반응에 미치는 영향을 평가하기 위한 EGCG의 농도를 100, 200, 400 μM로 결정하였다.
이상의 결과를 종합하면, 이전의 연구결과에서는 200 μM 이하의 낮은 농도의 EGCG를 처리하고 고농도의 LPS를 자극 한 후 1-2종류의 사이토카인과 iNOS를 분석한 연구를 수행하 였지만, 본 연구의 결과는 400 μM까지의 고농도 EGCG를 처 리한 후 다양한 pro-inflammatory와 anti-inflammatory 사이 토카인을 분석함으로서 차별화된 연구를 수행하였다. 특히, 본 연구의 결과는 EGCG가 LPS의 자극에 의해 활성화된 RAW264.
PCR을 위해 사용된 primer의 염기서열은 다음과 같다: iNOS, sense, 5'-CACTT GGAGT TCACC CAGT-3', anti-sense, 5’-ACCAC TCGTA CTTGG GATGC-3’, 30 cycles; TNF-α, sense, 5′-CCTGT AGCCC ACGTC GTAGC-3′, anti-sense, 5‘-TTGAC CTCAG CGCTG ACTTG-3’, 28 cycles; IL-1β, sense, 5’-GCACA TCAAC AAGAG CTTCA GGCAG-3’, anti-sense, 5’-GCTGC TTGTG AGGTG CTGAT GTAC-3’, 30 cycles; IL-10, sense, 5'-CCAAG CCTTA TCGGA AATGA-3', an- ti-sense, 5’-TTTTC ACAGG GGAGA AATCG-3’, 28 cycles; IL-6, sense, 5’-TTGGG ACTGA TGTTG TTGACA-3’, anti-sense, 5’-TCATC GCTGT TGATA CAATC AGA-3’, 28 cycles. 최종PCR산물은 1% agarose gel에 전기영동하고 EtBr (Roth, Karlsruhe, Germany)로 염색하여 GelDoc (Atto, Kyoto, Japan)에서 band를 관찰하였다.
각 well에 나타난 색깔의 변화를 VersaMax ELISA Microplate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 570nm에서 측정하였다. 한편, 각 추출물의 처리조건에 따른 세포주의 변화를 위상차 도립현미경(Leica Microsystems, Heerbrugg, Switzer-land)을 이용하여 400x 배율에서 관찰하였다.
1 M DTT (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), Superscript (Invitrogen)를 이용하여 25℃에서 10분, 42℃에서 50분, 90℃에서 5분 조건에서 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA에 대한 PCR을 수행하기 위해 cDNA 2.5 μg에 각 10 μM primers (sense, anti-sense) 및 10× buffer (Roche), 2 mM dNTP (Roche), 5 U Taq polymerase (Roche)를 혼합한 후 94℃ 에서 30초, 60℃-62℃에서 30초 및 72℃에서 45초 조건에서 28-30 cycles을 수행하였다. PCR을 위해 사용된 primer의 염기서열은 다음과 같다: iNOS, sense, 5'-CACTT GGAGT TCACC CAGT-3', anti-sense, 5’-ACCAC TCGTA CTTGG GATGC-3’, 30 cycles; TNF-α, sense, 5′-CCTGT AGCCC ACGTC GTAGC-3′, anti-sense, 5‘-TTGAC CTCAG CGCTG ACTTG-3’, 28 cycles; IL-1β, sense, 5’-GCACA TCAAC AAGAG CTTCA GGCAG-3’, anti-sense, 5’-GCTGC TTGTG AGGTG CTGAT GTAC-3’, 30 cycles; IL-10, sense, 5'-CCAAG CCTTA TCGGA AATGA-3', an- ti-sense, 5’-TTTTC ACAGG GGAGA AATCG-3’, 28 cycles; IL-6, sense, 5’-TTGGG ACTGA TGTTG TTGACA-3’, anti-sense, 5’-TCATC GCTGT TGATA CAATC AGA-3’, 28 cycles.

대상 데이터

EGCG의 세포독성 및 염증반응에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 사용된 RAW264.7 세포주는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 분양 받아 사용하였다. RAW264.
7 세포주는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 분양 받아 사용하였다. RAW264.7 세포주는 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco, Carlsbad, CA, USA), L-glutamine, penicillin 및 streptomycin (Invitrogen, Carls- bad, CA, USA)을 함유한 Minimum Essential Medium Eagle (MEM, Gibco)에 37℃, 5% CO₂조건의 배양기에서 비활성화 상태로 배양하였다.

데이터처리

대조그룹과 실험그룹 사이의 통계적 유의성은 일원배치분 산분석(SPSS for windows, Release 10.10, Standard Version, Chicago, IL, USA)을 사용하여 분석하였다. 모든 값은 평균 ±SD로 표기하였으며, p<0.

이론/모형

5% H₃PO₄)를 이용하여 측정하였다. LPS의 적정농도 설정을 위한 실험에서 NO 농도는 Nitric oxide assay kit를 이용하여 회사 의 권장법에 따라 측정되었다. 먼저, RAW264.
표준농도 검량선(Standard concentration curve)은 nitrate standard를 단계적으로 희석하여 사용하였다. 또한, EGCG의 항염증 효과를 측정하는 실험에서 NO농도는 Griess reagent를 이용하여 측정되었다. RAW264.
세포배양액 내 IL-6 농도분석은 Mouse IL-6 ELISA MAX (BioLegend, San Diego, CA)를 사용하여 제조사에서 제시한 방법에 따라 실시하였다. RAW264.

성능/효과

7 세포에 EGCG를 농도별로 처리한 뒤 24시간 동안 배양한 후 세포 형태를 관찰하고 MTT분석을 실시하였다. 그 결과, EGCG는 400 μM 농도까지도 RAW264.7 세포 생존율에 유의적인 감소 를 유도하지 않았다. 이러한 결과를 통해 EGCG가 대식세포의 염증반응에 미치는 영향을 평가하기 위한 EGCG의 농도를 100, 200, 400 μM로 결정하였다.
7 세포의 anti-inflammatory 사이토카인과 pro-inflammatory 사이토카인의 발현에 미치는 영향을 분석하기 위해, RT-PCR을 이용하여 IL-1β, TNF-α, IL-10, IL-6의 발현을 관찰하였다. 그 결과, IL-1β과 TNF-α의 발현은 LPS 처리에 의해 급격히 374% 혹은 297% 증가하였지 만 EGCG 처리에 의해 감소하였다. 그러나 감소비율에는 차이가 있었으며, TNF-α의 발현은 EGCG 농도의 증가에 따라 14.
더불어, RT-PCR의 결과에서 관찰된 EGCG 처리에 의해 IL-6 의 발현에 변화를 확인하기 위하여, IL-6단백질의 농도를 ELISA로 측정하였다. 그 결과, IL-6단백질의 농도도 RT-PCR 의 결과와 유사하게 유의적인 변화가 없었다(Fig. 4B). 이러한 결과는 EGCG 처리가 anti-inflammaroty 사이토카인과 pro- inflammatory 사이토카인의 발현에 미치는 영향에 차이가 있음을 제시하고 있으며, 특히, IL-6의 발현에는 유의적인 영향 이 없음을 제시하고 있다.
0 μg/ml)의 LPS를 처리한 후 MTT분석, NO농도분석, IL-6농도분석을 실시하였다. 그 결과, RAW264.7 세포의 생존 율은 LPS를 처리한 모든 농도에서 Vehicle그룹과 유의적인 차이가 없었다(Fig. 2A). 또한, NO농도는 LPS 처리그룹이 No 그룹이나 Vehicle그룹에 비하여 50% 이상, 농도의존적으로 증 가하였다.
그 결과, IL-1β과 TNF-α의 발현은 LPS 처리에 의해 급격히 374% 혹은 297% 증가하였지 만 EGCG 처리에 의해 감소하였다. 그러나 감소비율에는 차이가 있었으며, TNF-α의 발현은 EGCG 농도의 증가에 따라 14.2-20.7%까지 감소하였고, IL-1β의 발현은 400 μM EGCG를 처리한 그룹에서만 유의적으로 감소하였다(Fig. 4A). 또한, anti-inflammatory 사이토카인인 IL-10과 IL-6의 발현은 pro-inflammatory 사이토카인과 다른 양상을 나타내었다.
본 연구에서는 LPS 자극에 대한 EGCG의 저해효과에 관여하는 사이토카인을 확인하기 위해 4가지 종류의 사이토 카인의 발현변화를 관찰하였으며, 대부분은 농도의존적으로 감소하는 경향을 나타내었지만 IL-6는 유의적인 변화가 없었다. 따라서, 이러한 결과는 다른 사이토카인과 다르게 IL-6는 LPS 자극에 의한 EGCG 억제효능에 관여하지 못함을 제시하는 최초의 결과이다.
7 세포를 자극하였으나 성공적으로 염증반응을 유발하였다. 또한, LPS 농도 증가에 따른 NO생성량과 IL-6분비량은 특이적인 변화가 관찰되지 않았지만 일부 고농도에서 증가하는 현상을 관찰할 수 있었다. 더불어 이러한 결과는 이전에 보고된 연구결과와 일치함을 제시하고 있다.
2A). 또한, NO농도는 LPS 처리그룹이 No 그룹이나 Vehicle그룹에 비하여 50% 이상, 농도의존적으로 증 가하였다. 특히, 고농도(1.
NO생성은 400-500 μM EGCG 처리로 80-90% 저해되었고[2], 1 μM EGCG 처리로 42% 저해되었으며 [14], 10 μM에서는 29% 저해되었다[1]. 또한, iNOS 발현도 다양한 EGCG의 농도 증가(1-15 μM)에 따라 점진적으로 감소하는 경향을 나타내었다. 본 연구에서, 비록 실험조건이나 저해 비율은 다르지만 EGCG 처리에 의한 NO농도와 iNOS 발현 감소는 이전의 결과와 매우 유사하게 관찰되지만 이전 실험과 의 저해비율 차이는 처리농도와 처리방법의 차이에 의한 것으로 추정된다.
7 세포에 2시간 동안 50, 100, 200, 400 μM EGCG를 처리한 후 1 μg/ml LPS로 24시간 자극하여 NO농도 와 iNOS의 발현을 분석하였다. 먼저, RAW264.7 세포의 생존 율과 세포형태는 비록 일부 농도에서 통계학적 의미 없이 약간 감소하였으나 EGCG의 농도에 상관없이 일정한 수준을 유 지하였으며, 특이적인 변화를 나타내지 않았다(Fig. 3A). 또한, NO농도는 LPS를 처리한 그룹이 No그룹에 비하여 급격히 증 가하여 63 μmol/l까지 증가하였으나 400 μM EGCG를 처리한 그룹에서만 68.
또한, iNOS 발현도 다양한 EGCG의 농도 증가(1-15 μM)에 따라 점진적으로 감소하는 경향을 나타내었다. 본 연구에서, 비록 실험조건이나 저해 비율은 다르지만 EGCG 처리에 의한 NO농도와 iNOS 발현 감소는 이전의 결과와 매우 유사하게 관찰되지만 이전 실험과 의 저해비율 차이는 처리농도와 처리방법의 차이에 의한 것으로 추정된다. 또한 두 가지 nitric oxide assay방법으로 측정된 NO농도의 차이는 비록 Greiss reagent는 동일하지만 en- hancer, enzyme cofactor, nitrate reductase 등의 차이에 의한 영향으로 사료된다.
그러나 EGCG에 대한 IL-6의 반응에 대한 보고는 거의 없다. 본 연구에서는 LPS 자극에 대한 EGCG의 저해효과에 관여하는 사이토카인을 확인하기 위해 4가지 종류의 사이토 카인의 발현변화를 관찰하였으며, 대부분은 농도의존적으로 감소하는 경향을 나타내었지만 IL-6는 유의적인 변화가 없었다. 따라서, 이러한 결과는 다른 사이토카인과 다르게 IL-6는 LPS 자극에 의한 EGCG 억제효능에 관여하지 못함을 제시하는 최초의 결과이다.
4B). 이러한 결과는 EGCG 처리가 anti-inflammaroty 사이토카인과 pro- inflammatory 사이토카인의 발현에 미치는 영향에 차이가 있음을 제시하고 있으며, 특히, IL-6의 발현에는 유의적인 영향 이 없음을 제시하고 있다.
따라서, 본 연구에서는 LPS에 의해 유도된 염증반응에서 NO농도, iNOS 발현, pro-inflammatory와 anti-inflammatory 사이토카인의 발현에 미치는 EGCG의 영향을 분석하고자 하였다. 특히, 본 연구에서는 EGCG가 LPS에 의해 유도된 IL-1β, TNF-α, IL-10의 발현 을 억제하는 효과를 나타내었지만 IL-6의 발현에는 영향을 주 지 못함을 제시하고 있다.
이상의 결과를 종합하면, 이전의 연구결과에서는 200 μM 이하의 낮은 농도의 EGCG를 처리하고 고농도의 LPS를 자극 한 후 1-2종류의 사이토카인과 iNOS를 분석한 연구를 수행하 였지만, 본 연구의 결과는 400 μM까지의 고농도 EGCG를 처 리한 후 다양한 pro-inflammatory와 anti-inflammatory 사이 토카인을 분석함으로서 차별화된 연구를 수행하였다. 특히, 본 연구의 결과는 EGCG가 LPS의 자극에 의해 활성화된 RAW264.7 세포를 효과적으로 억제하는 효능을 나타냄을 제 시하고 있으며, 이러한 과정에 사이토카인들이 서로 다르게 특이적 반응을 중계함을 제시하고 있다. 또한, 이러한 결과는 EGCG의 염증반응에 미치는 효능작용기전의 해석에 중요한 정보를 제공할 것으로 사료된다.

후속연구

7 세포를 효과적으로 억제하는 효능을 나타냄을 제 시하고 있으며, 이러한 과정에 사이토카인들이 서로 다르게 특이적 반응을 중계함을 제시하고 있다. 또한, 이러한 결과는 EGCG의 염증반응에 미치는 효능작용기전의 해석에 중요한 정보를 제공할 것으로 사료된다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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