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문제 정의
- 따라서 본 연구는 고지방식이로 비만을 유도한 마우스에게 느티만가닥버섯 분말을 투여한 후, 체중, 지방조직 무게, 혈청 및 간 중 지질 수준, 부고환 지방 세포 크기와 지방생성 (lipogenesis) 관련 단백질 발현 정도를 측정하여, 항비만 기능성 소재로서의 가능성 여부를 조사하였다.
가설 설정
- 1)NS: not significant.
- 2)NS: not significant.
제안 방법
- 실험기간이 종료된 시점에서 12시간 동안 절식시킨 후, 마취하여 복부대동맥으로부터 혈액을 채취하였다. 간, 복부지방, 부고환지방 및 갈색지방은 적출, 식염수로 씻어 물기를 제거한 후 무게를 측정하였다. 혈액은 1,000×g에서 10분간 원심분리 하여 혈청을 분리하였다.
- 동물실험을 위한 기본실험식이 조성은 AIN-76에 따라 제조하였다. 고지방식이는 총 열량의 40%가 되도록 라드(Gbio, Gwacheon, Korea)를 공급하였으며, 준비된 고지방식이에 느티만가닥버섯 분말을 5% 수준으로 혼합하여 실험식이를 제조하였다. 체중은 주 1회, 식이섭취량은 일주일에 3회 측정하였다.
- 느티만가닥버섯 분말을 첨가한 식이가 지방세포의 지방 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 부고환 지방조직에서 PPARγ, SREBP-1c 및 SCD-1 단백질 발현 정도를 살펴보았다(Fig. 4).
- 본 연구는 느티만가닥버섯의 항비만 효과를 알아보기 위해 4주령된 C57BL/6 수컷 쥐를 30마리를 1주일간 적응시킨 후, 정상식이군, 고지방식이군, 5% 느티만가닥버섯 분말 첨가 식이군으로 나누어 8주간 실시하였다. 체중 및 체중증가량은 고지방식이군에서 유의적으로 증가하였으며, 느티만가닥버섯 분말 첨가 식이군에서 감소하였다.
- 실험기간이 종료된 시점에서 12시간 동안 절식시킨 후, 마취하여 복부대동맥으로부터 혈액을 채취하였다. 간, 복부지방, 부고환지방 및 갈색지방은 적출, 식염수로 씻어 물기를 제거한 후 무게를 측정하였다.
- 이후 난괴법(randomized complete block design)으로 총 3군, 실험군당 10마리씩 배치하여 실험식이를 공급하였다. 실험식이(Table 1)는 정상식이군(N), 고지방식이군(HF), 5% 느티만가닥버섯 분말 첨가군(HFH)으로 나누어 8주간 급여하였으며, 물과 식이는 자유롭게 공급하였다. 동물실험을 위한 기본실험식이 조성은 AIN-76에 따라 제조하였다.
- , Seoul, Korea)에서 구입하여 1주간 기본식이로 적응시켰다. 이후 난괴법(randomized complete block design)으로 총 3군, 실험군당 10마리씩 배치하여 실험식이를 공급하였다. 실험식이(Table 1)는 정상식이군(N), 고지방식이군(HF), 5% 느티만가닥버섯 분말 첨가군(HFH)으로 나누어 8주간 급여하였으며, 물과 식이는 자유롭게 공급하였다.
- 조직은 약 4 μm 두께로 박절편기를 사용하여 자른 후 hematoxylin-eosin(H&E)으로 염색하고, xylene으로 처리한 다음 봉입하여 광학현미경으로 관찰하였다.
- 고지방식이는 총 열량의 40%가 되도록 라드(Gbio, Gwacheon, Korea)를 공급하였으며, 준비된 고지방식이에 느티만가닥버섯 분말을 5% 수준으로 혼합하여 실험식이를 제조하였다. 체중은 주 1회, 식이섭취량은 일주일에 3회 측정하였다.
- 간 조직의 총 지방 농도는 Folch법(16)으로 총 지질을 추출하여 측정하였다. 총콜레스테롤과 중성지방 농도는 위에서 추출한 총 지방을 클로르포름으로 녹여 혈장에서와 같은 방법으로 (주)신양화학의 kit를 이용하여 측정하였다.
- 간 및 지방조직의 일부분을 적출하여 4% formaldehyde 용액에 24시간 고정한 후 증류수로 수세한 다음 탈수시켰다. 탈수는 78%, 80%, 90% 및 100% 에탄올로 단계적으로 탈수 시킨 다음 paraffin 과정을 거쳐 포매하였다. 조직은 약 4 μm 두께로 박절편기를 사용하여 자른 후 hematoxylin-eosin(H&E)으로 염색하고, xylene으로 처리한 다음 봉입하여 광학현미경으로 관찰하였다.
- 5% 탈지분유로 blocking한 뒤 membrane를 1차 항체에 반응시킨 다음 horseradish peroxidase linked 2차 항체에 노출시켰다. 항체에 결합된 단백질의 signal은 ECL(Intron, Seongnam, Korea)을 사용하여 현상하였다. 항체 sterol regulatory element binding protein-1c(SREBP-1c)와 β-actin은 Santa Cruz 제품(Santa Cruz, CA, USA)을 사용하였고, peroxisome proliferator-activated receptor γ(PPARγ)와 stearoyl-CoA desaturase-1(SCD-1)는 Cell Signaling(Danvers, MA, USA)제품을 사용하였다.
- 혈청 중 중성지질과 총콜레스테롤 함량은 (주)신양화학 (Seoul, Korea)의 kit를 이용하여 정하였다. 혈청 중 인슐린의 함량은 Millipore사(Billerica, MA, USA)의 Milliplex map kit를 사용하여 분석하였으며, 렙틴의 함량은 ALPCO사(APLCO Diagnostic, Windham, NH, USA)의 Leptin ELISA kit를 이용하였다.
- 혈청 중 중성지질과 총콜레스테롤 함량은 (주)신양화학 (Seoul, Korea)의 kit를 이용하여 정하였다. 혈청 중 인슐린의 함량은 Millipore사(Billerica, MA, USA)의 Milliplex map kit를 사용하여 분석하였으며, 렙틴의 함량은 ALPCO사(APLCO Diagnostic, Windham, NH, USA)의 Leptin ELISA kit를 이용하였다.
대상 데이터
- 4주 된 C57BL/6 수컷 쥐 30마리를 오리엔트바이오사(Orient Bio Co. Ltd., Seoul, Korea)에서 구입하여 1주간 기본식이로 적응시켰다. 이후 난괴법(randomized complete block design)으로 총 3군, 실험군당 10마리씩 배치하여 실험식이를 공급하였다.
- 실험에 사용된 느티만가닥버섯은 강원도 강릉지역의 농업법인 (주)해송산업에서 구입하여 20℃ 이하 냉풍건조기에 3일간 건조 후 분쇄하여 분말로 만든 시료를 사용하였다.
- 항체 sterol regulatory element binding protein-1c(SREBP-1c)와 β-actin은 Santa Cruz 제품(Santa Cruz, CA, USA)을 사용하였고, peroxisome proliferator-activated receptor γ(PPARγ)와 stearoyl-CoA desaturase-1(SCD-1)는 Cell Signaling(Danvers, MA, USA)제품을 사용하였다.
데이터처리
- 본 실험결과는 SPSS 통계프로그램(version 18.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 평균과 표준오차를 나타내었다. 실험군 간의 유의성 검증은 p<0.
- 실험군 간의 유의성 검증은 p<0.05 수준에서 one way ANOVA를 시행한 후 Duncan's multiple range test를 이용하여 분석하였다.
이론/모형
- 간 조직의 총 지방 농도는 Folch법(16)으로 총 지질을 추출하여 측정하였다. 총콜레스테롤과 중성지방 농도는 위에서 추출한 총 지방을 클로르포름으로 녹여 혈장에서와 같은 방법으로 (주)신양화학의 kit를 이용하여 측정하였다.
- 지방조직을 일정량 채취하여 lysis buffer를 넣고 균질화하여 13,000 rpm에서 4℃, 10분간 원심분리 하였다. 단백질 농도는 Bradford법(17)을 이용하여 정량하였다. 추출한 단백질을 10% SDS-polyacrylamide gel에 loading하여 전기영동 한 뒤 PVDF membrane으로 이동시켰다.
- 실험식이(Table 1)는 정상식이군(N), 고지방식이군(HF), 5% 느티만가닥버섯 분말 첨가군(HFH)으로 나누어 8주간 급여하였으며, 물과 식이는 자유롭게 공급하였다. 동물실험을 위한 기본실험식이 조성은 AIN-76에 따라 제조하였다. 고지방식이는 총 열량의 40%가 되도록 라드(Gbio, Gwacheon, Korea)를 공급하였으며, 준비된 고지방식이에 느티만가닥버섯 분말을 5% 수준으로 혼합하여 실험식이를 제조하였다.
성능/효과
- 또한, 간 중 지질 함량도 느티만가닥버섯 분말 첨가군에서 감소하였다. HE staining으로 관찰한 간내 지방 축적과 지방세포의 크기도 느티만가닥버섯 분말 첨가 식이군에서 현저히 감소하였다. 부고환 지방조직에서 관찰한 지방생성 관련 유전자인 PPARγ, SREBP-1c, SCD-1의 단백질 발현은 고지방식이군과 비교 시, 느티만가닥버섯 분말 첨가 식이군에서 억제되었다.
- 간 조직 중 총지질, 총콜레스테롤, 중성지질의 함량은 Table 5에 나타내었다. 간 총지방 함량은 정상식이군에 비하여 고지방식이군에서 67% 증가하였다. 반면, 느티만가닥버섯 분말 첨가 식이군은 고지방식이군에 비하여 51% 감소하였다.
- 고지방식이군의 혈청 인슐린 농도는 1.36±0.12 ng/mL로 정상식이군 0.85±0.15 ng/mL에 비하여 유의적으로 증가하였으나, 느티만가닥버섯 분말을 첨가한 식이군은 약 34% 감소하여 0.90±0.06 ng/mL을 나타내었다.
- 따라서 본 연구에서 관찰된 느티만가닥버섯 분말 보충에 따른 혈청 인슐린과 렙틴 농도 감소는 SREBP-1C와 PPARγ의 발현을 조절하고, 그 결과 지방산 합성에 관여하는 SCD-1 발현 억제에 영향을 미친 것으로 사료된다.
- 지방전구세포인 3T3-L1 세포를 이용하여 차가버섯 물 추출물의 지방세포분화 억제효과를 관찰한 Joo 등(38)의 연구에서, 차가버섯 물추출물은 C/EBPα와 PPARγ의 단백질 발현을 감소시켰다. 또한, 흰목이버섯(Tremella fuciformis)에서 추출한 다당체를 3T3-L1 세포에 처리하였을 시, 세포내 지방구 축적이 억제되었으며 지방구내 중성지방 함량도 감소되었다. 이와 더불어 지방세포 분화에 중요한 역할을 하는 전사인자인 PPARγ와 렙틴의 mRNA 발현도 감소하였다(39).
- 백색지방 조직에 해당하는 부고환 지방과 장간막지방의 무게는 고지방식이군에서 약 2배 정도 증가하였고, 느티만가닥버섯 분말을 첨가한 식이군에서 유의적으로 감소하여 정상식이군보다 더 낮은 수준을 보였다. 이는 체중증가 억제 효과와 일치하였으며, 내장지방이 만성퇴행성 질환의 위해 요인임을 고려해 볼 때 시사하는 바가 크다고 할 수 있겠다.
- 본 연구 결과, 느티만가닥버섯 분말의 급여는 고지방식이로 인한 간 및 지방조직의 지방축적을 억제하여 체지방 감소에 효과적인 소재임을 알 수 있었다.
- 본 연구결과, 고지방식이군의 지방조직에서 PPARγ, SREBP-1c 및 SCD-1 단백질 발현은 증가한 반면, 느티만가닥버섯 분말을 첨가한 식이군에서는 감소하였다.
- 부고환 지방조직에서 관찰한 지방생성 관련 유전자인 PPARγ, SREBP-1c, SCD-1의 단백질 발현은 고지방식이군과 비교 시, 느티만가닥버섯 분말 첨가 식이군에서 억제되었다.
- 이와 더불어 지방세포 분화에 중요한 역할을 하는 전사인자인 PPARγ와 렙틴의 mRNA 발현도 감소하였다(39). 이러한 점을 미루어볼 때, 느티만가닥버섯은 지방생성 관련 단백질의 발현을 조절하여 지방세포의 증식과 분화 기능을 억제함으로써 체내 지방 형성과 축적을 저해하는 것으로 사료되며, 본 결과는 느티만가닥버섯이 항비만 식품으로서의 가능성이 있음을 나타낸다. 향후, 느티만가닥버섯에 함유된 생리활성 물질 규명에 대한 연구가 필요할 것으로 판단된다.
- 부고환 지방조직에서 관찰한 지방생성 관련 유전자인 PPARγ, SREBP-1c, SCD-1의 단백질 발현은 고지방식이군과 비교 시, 느티만가닥버섯 분말 첨가 식이군에서 억제되었다. 이상의 실험결과, 고지방 식이와 함께 공급한 느티만가닥버섯 분말은 체중 감소 및 체지방 축적 억제와 더불어 혈청 지방 수준 개선에도 긍정적 영향을 미치는 것으로 나타났다.
- 본 연구는 느티만가닥버섯의 항비만 효과를 알아보기 위해 4주령된 C57BL/6 수컷 쥐를 30마리를 1주일간 적응시킨 후, 정상식이군, 고지방식이군, 5% 느티만가닥버섯 분말 첨가 식이군으로 나누어 8주간 실시하였다. 체중 및 체중증가량은 고지방식이군에서 유의적으로 증가하였으며, 느티만가닥버섯 분말 첨가 식이군에서 감소하였다. 간 및 지방조직의 무게도 고지방식이군에 비하여 느티만가닥버섯 처리군에서 낮았다.
- 특히, 느티만가닥버섯 분말을 첨가한 식이군(HF-H)의 체중은 대조군에 비하여 유의적으로 낮았으며, 체중증가량에 있어서도 정상군보다 적은 체중증가량(6.03±0.52 g)을 보였다.
- Zhang 등(19)의 연구에서도 고지방식이에 의해 식이섭취량이 유의적으로 감소한 것으로 나타나 본 연구와 같은 경향이었다. 한편, 식이효율은 에너지 밀도가 큰 고지방식이 군이 정상군보다 높았고, 느티만가닥버섯 분말을 첨가한 식이군은 정상식이군과 고지방식이군에 비하여 유의적으로 낮았다. 이는 느티만가닥버섯 분말을 첨가한 식이군의 체중증가량이 정상식이군과 고지방식이군에 비하여 낮은 결과에 의한 것으로 판단된다.
후속연구
- 따라서 느티만가닥버섯은 식이섬유, 폴리페놀 및 에르고스테롤 등이 다량 함유되어 있으며, 이러한 생리활성물질들이 소장에서 콜레스테롤 흡수를 저해하고 변으로 배설은 증가시켜 혈중 지질 수준을 개선시킨 것으로 생각되나 유효성분에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 이러한 점을 미루어볼 때, 느티만가닥버섯은 지방생성 관련 단백질의 발현을 조절하여 지방세포의 증식과 분화 기능을 억제함으로써 체내 지방 형성과 축적을 저해하는 것으로 사료되며, 본 결과는 느티만가닥버섯이 항비만 식품으로서의 가능성이 있음을 나타낸다. 향후, 느티만가닥버섯에 함유된 생리활성 물질 규명에 대한 연구가 필요할 것으로 판단된다.
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