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문제 정의
- 따라서, 본 연구에서는 우리나라에서 소비되는 대표적인 연골어류인 홍어의 껍질을 각종 효소로 가수분해하여 collagenase-1 저해활성이 있는 생리기능성 펩타이드를 분리 정제하고, 분리정제된 펩타이드의 아미노산 서열을 확인하였다. 이를 통해서, 홍어껍질로부터 분리된 주름개선효과가 있는 collagenase-1 저해활성 펩타이드의 화장품 소재 및 주름개선제 소재로서의 가능성을 제시하고자 하였다.
제안 방법
- 5% acetic acid)으로 30분간 gel상의 염색을 제거하였다. Collagenase-1 저해 활성은 염색되지 않은 환의 크기를 측정하여 계산하였다.
- Human Dermal Fibroblasts(HDF) 세포를 2×104 cells/well 농도로 96- well plate에 접종한 후, 각 well에 시료를 처리하여 배양기(37˚C, 5% CO2)에서 24시간 배양하였다.
- Pepsin 가수분해물로부터 collagenase-1 저해 펩타이드를 분리정제하기 위해 Sephadex G-25 column에 주입하여 gel chromatography를 실시하였다. 분리정제 과정을 거쳐 총 4개의 획분을 얻었으며(Fig.
- B). Sephadex G-25 column에서 분리된 활성획분 F1으로부터 collagenase-1 저해 펩타이드를 분리정제하기 위하여 C18 ODS column를 이용한 HPLC에서 분리를 실시하였다. HPLC에서 분획된 총 4개 획분의 저해활성을 측정한 결과, F1-2의 활성은 다른 획분에 비하여 0.
- 각 획분 중에서 저해 활성이 가장 우수한 획분은 ODS column(Gromsil-120 ODS-5ST, Ø10×250 mm, 5 µm)을 이용한 HPLC로 분리하였다.
- 제조된 sample solution은 37˚C로 설정된 항온수조에서 한 시간 동안 반응시킨 후, agarose gel상의 paper disk 위에 15 µL를 가 하였다. 그리고 실온에서 1시간 방치한 후, 37˚C 항온수조에서약 16시간 동안 반응시킨 다음, paper disk를 제거하고 agarose gel을 coomassie blue 용액(0.25% Coomassie brilliant blue G-250, 5% methanol, 7.5% acetic acid)으로 30분간 염색 후, destaining solution(12.5% methanol, 7.5% acetic acid)으로 30분간 gel상의 염색을 제거하였다. Collagenase-1 저해 활성은 염색되지 않은 환의 크기를 측정하여 계산하였다.
- 따라서, 본 연구에서는 우리나라에서 소비되는 대표적인 연골어류인 홍어의 껍질을 각종 효소로 가수분해하여 collagenase-1 저해활성이 있는 생리기능성 펩타이드를 분리 정제하고, 분리정제된 펩타이드의 아미노산 서열을 확인하였다. 이를 통해서, 홍어껍질로부터 분리된 주름개선효과가 있는 collagenase-1 저해활성 펩타이드의 화장품 소재 및 주름개선제 소재로서의 가능성을 제시하고자 하였다.
- Histidine 및 phenylalanine 등의 환 구조를 갖는 아미노산 잔기를 갖는 물질이 collagenase-1 활성 부위에 결합력이 강하며, P1’은 leucine 과 같은 소수성 아미노산 잔기의 결합력이 강하다고 보고하였다(Borkakoti, 2004). 또한 체내에는 collagenase-1, 즉 MMP-1의 저해제인 tissue inhibitors of metallopreteinase-1(TIMP-1)가 존재하며, TIMP-1의 구조와 홍어껍질 유래의 collagenase-1 저해 펩타이드의 구조를 비교하였다. Lodemel et al.
- 4). 분리된 F1-2 획분은 HPLC에서 재분리정제를 실시하였다. 재분리 정제 과정을 거쳐 단일 획분인 F1-2-I를 얻었으며, F1-2-I 획분의 collagenase-1 저해활성 값은 IC50 값으로 83.
- 세포 독성은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2-5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)시약을 이용하여 세포 생존율을 측정 하는 Mosmann(1983)의 방법을 변형하여 실시하였다. Human Dermal Fibroblasts(HDF) 세포를 2×104 cells/well 농도로 96- well plate에 접종한 후, 각 well에 시료를 처리하여 배양기(37˚C, 5% CO2)에서 24시간 배양하였다.
- 5 mL)하여 수행하였다. 용출액을 분광광도계로 215 nm에서 흡광도를 측정 하여 분획하였으며, 각 분획물은 동결건조하고 일정량을 정평하여 저해 활성을 측정하였다. 각 획분 중에서 저해 활성이 가장 우수한 획분은 ODS column(Gromsil-120 ODS-5ST, Ø10×250 mm, 5 µm)을 이용한 HPLC로 분리하였다.
- 2)로 25 mL 되게 정용하였다. 이 중 일정량을 취하여 아미노산 자동분석기(Hitachi, Japan)로 분석하였다.
- 정제된 collagenase-1 저해 펩타이드의 아미노산 서열 분석은 Q-TOF mass spectrometer(Micromass, UK)을 사용하여 실시하였다. 그리고 정제된 collagenase-1 저해 펩타이드의 분자량 분석은 liquid chromatography-mass spectrometry(LC-MS)를 이용하여 electrospray ionization(ESI)방법으로 측정하였다.
- 홍어껍질 단백질 가수분해물은 alcalase, α-chymotrypsin, neutrase, papain, pepsin 및 trypsin을 사용하여 효소별로 제조하였다. 즉, 홍어껍질의 가수분해는 껍질의 단백질 함량을 기준으로 1 g을 정평하고 1%(w/v) 기질용액이 되도록 하여 1시간 동안 안정화시킨 후 각 효소별 최적 가수분해 조건(Table 1)으로 온도 및 pH를 조절하여 효소를 첨가하고 6시간 동안 가수분해하였다. 이때 기질 대 효소의 비는 100:1(w/w)로 하였으며, 반응 종료 후 가수분해물은 원심분리(6,000 rpm, 15분)하여 상층액을 동결건조한 후 실험에 사용하였다.
- 홍어 껍질에서 분리 정제된 collagenase-1 저해 펩타이드의 세포독성은 신생아의 표피에서 분리한 인간 피부 섬유아세포인 HDF 세포를 대상으로 하여 측정하였다. Fig.
- 홍어껍질 단백질 가수분해물은 alcalase, α-chymotrypsin, neutrase, papain, pepsin 및 trypsin을 사용하여 효소별로 제조하였다.
- 홍어껍질의 단백질 가수분해는 가장 일반적이고 널리 사용되고 있는 시판용 효소인 alcalase, α-chymotrypsin, neutrase, papain, pepsin 및 trypsin을 이용하여 가수분해를 실시하였고, 단백질 가수분해물의 수득율은 각 단백질 가수분해물의 무게를 측정하여 계산하였으며, 각각의 수득율은 Table 4에 나타내었다.
대상 데이터
- Baker사(USA)에서 구입하였고, HPLC용 column은 Alltech사(Deerfield, IL, USA)의 Gromsil-120 ODS-5ST를 사용하였다. Collagenase-1 저해 활성 측정에 사용된 collagenase-1은 Simga-Aldrich(USA)에서 구입하였다. 세포독성 실험에 사용된 Human dermal fibroblasts(HDF)는 한국세포주은행에서 구입하였으며, 그 밖의 시약은 분석용 특급시약을 사용하였다.
- 그리고 홍어껍질 가수분해물로부터 collagenase-1 저해 펩타이드를 정제하기 위하여 사용된 Sephadex G-25 수지는 SigmaAldrich(USA), HPLC(Agilent 1100, USA)로 펩타이드를 분리 정제하는데 사용된 acetonitrile은 J.T. Baker사(USA)에서 구입하였고, HPLC용 column은 Alltech사(Deerfield, IL, USA)의 Gromsil-120 ODS-5ST를 사용하였다. Collagenase-1 저해 활성 측정에 사용된 collagenase-1은 Simga-Aldrich(USA)에서 구입하였다.
- Collagenase-1 저해 활성 측정에 사용된 collagenase-1은 Simga-Aldrich(USA)에서 구입하였다. 세포독성 실험에 사용된 Human dermal fibroblasts(HDF)는 한국세포주은행에서 구입하였으며, 그 밖의 시약은 분석용 특급시약을 사용하였다.
- 홍어 껍질을 가수분해하기 위한 효소로 alcalase(from Bacillus licheniformis, 2.4 AU/g)와 neutrase(from Bacillus amyloliquefaciens, 1.5 AU/g)는 Novozymes(Denmark)의 제품을 구입하였고, α-chymotrypsin(from bovine pancreas, 40-60 units/mg protein), trypsin(from porcine pancreas, 1,000-2,000 units/mg solid), papain(from papaya latex, 1.5-10 units/mg)은 Sigma-Aldrich(USA)의 제품을 구입하였으며, pepsin(from porcine gastric mucosa, 400-800 units/mg protein)은 Junsei Chem.
- 홍어(Dipturus chilensis) 껍질은 전라도 나주의 영산홍어(주)에서 구입하였고, 껍질을 깨끗이 수세한 후 잘게 마쇄하여 실험에 사용하기 전까지 -80℃ 냉동고에 보관하였다.
이론/모형
- 정제된 collagenase-1 저해 펩타이드의 아미노산 서열 분석은 Q-TOF mass spectrometer(Micromass, UK)을 사용하여 실시하였다. 그리고 정제된 collagenase-1 저해 펩타이드의 분자량 분석은 liquid chromatography-mass spectrometry(LC-MS)를 이용하여 electrospray ionization(ESI)방법으로 측정하였다.
- 홍어껍질의 일반성분은 원료를 수세한 후 AOAC방법 (AOAC, 1995)에 따라 분석하였다. 수분은 상압가열건조법, 조회분은 건식회화법, 단백질은 Kjeldahl법 그리고 지방은 Soxhlet법으로 측정하였다.
- 홍어껍질의 일반성분은 원료를 수세한 후 AOAC방법 (AOAC, 1995)에 따라 분석하였다. 수분은 상압가열건조법, 조회분은 건식회화법, 단백질은 Kjeldahl법 그리고 지방은 Soxhlet법으로 측정하였다.
성능/효과
- Fig. 7에서와 같이, 6.25 및 12.5 µg/mL의 저농도에서는 세포독성이 나타나지 않아 없어 HDF 세포가 모두 생존할 수 있었고, 그보다 높은 25 및 50µg/mL 농도에서 90%이상의 생존율을 보였다.
- Sephadex G-25 column에서 분리된 활성획분 F1으로부터 collagenase-1 저해 펩타이드를 분리정제하기 위하여 C18 ODS column를 이용한 HPLC에서 분리를 실시하였다. HPLC에서 분획된 총 4개 획분의 저해활성을 측정한 결과, F1-2의 활성은 다른 획분에 비하여 0.25 mg/mL의 농도에서 68.3%로 가장 높았다(Fig. 4). 분리된 F1-2 획분은 HPLC에서 재분리정제를 실시하였다.
- 따라서 홍어껍질은 단백질 함량이 높아 단백질 가수분해에 의해 생리활성소재로 개발이 가능함을 확인할 수 있었다. Table 3에서와 같이 홍어껍질의 아미노산 조성을 분석한 결과, 주요 아미노산은 glycine(32.36%), alanine(10.52%) 이었으며, 이들의 함량은 전체 구성아미노산의 40% 이상을 차지하고 있었다. 그 외에 serine, aspartic acid, arginine, leucine 등의 아미노산이 포함되어 있었다.
- 홍어 껍질의 일반성분 분석결과는 Table 2에 나타내었다. 껍질의 수분, 회분, 지질, 탄수화물 및 단백질 함량비는 각각 70.9%, 1.5%, 1.4%, 2.6%, 23.6%로 나타났으며, 단백질의 비율이 가장 높았다. 단백질의 경우 건조 중량 기준으로 환산하면 81.
- 홍어껍질의 단백질 가수분해는 가장 일반적이고 널리 사용되고 있는 시판용 효소인 alcalase, α-chymotrypsin, neutrase, papain, pepsin 및 trypsin을 이용하여 가수분해를 실시하였고, 단백질 가수분해물의 수득율은 각 단백질 가수분해물의 무게를 측정하여 계산하였으며, 각각의 수득율은 Table 4에 나타내었다. 단백질 가수분해물 중 alcalase 가수분해물의 수득율이 79.63%로 가장 높았으며, papain 가수분해물은 16.07%로 가장 낮았다. 앞서 보고된 연구와 비교하면, Jia et al.
- 1). 따라서 pepsin 가수분해물 및 doxycycline의 농도를 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/mL로 희석하여 collagenase-1 저해 활성을 측정한 결과, pepsin 가수분해물의 collagenase-1 저해활성은 농도 의존적으로 증가하였으며, 특히 0.2 및 0.4 mg/mL의 농도에서는 doxycycline보다 저해 활성이 더 높았다. 한편, alcalase 가수분해물의 수득율이 가장 높았지만 collagenase-1 저해 활성은 pepsin 가수분해물이 가장 높은 것으로 보아 가수분해도와 collagenase-1 저해 활성과는 상관관계가 없는 것으로 판단되었다.
- (1998)의 연구에서 보도된 어류 껍질의 단백질 함량은 60-70%범위였으며, 홍어껍질의 단백질 함량은 대구 및 명태껍질과 비슷한 함량이었다. 따라서 홍어껍질은 단백질 함량이 높아 단백질 가수분해에 의해 생리활성소재로 개발이 가능함을 확인할 수 있었다. Table 3에서와 같이 홍어껍질의 아미노산 조성을 분석한 결과, 주요 아미노산은 glycine(32.
- 이와 같이 valine과 같은 소수성 아미노산이 collagenase-1 저해 활성에 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있었다. 또한, 홍어껍질에 분리된 collagenase-1 저해 펩타이드의 아미노산 서열은 소수성 아미노산인 leucine 및 valine 다량으로 존재하였으며, 이러한 아미노산 잔기가 collagenase-1의 활성 부위에 특이적으로 결합하여 저해 활성을 나타내는 것을 알 수 있 었다.
- 본 실험에서 가장 높은 농도인 100 µg/mL 에서 81%라는 높은 세포 생존율을 나타내었다.
- 본 연구에서는 collagenase-1 저해성분으로 사용되는 tetracycline계 항생제인 doxycycline을 대조군으로 하여 6종의 단백질 가수분해물의 collagenase-1 저해 활성을 측정한 결과, pepsin으로 처리한 가수분해물의 활성이 다른 효소로 처리한 가수분해물에 비해 높게 나타났다(Fig. 1). 따라서 pepsin 가수분해물 및 doxycycline의 농도를 0.
- 0 mL/min로 60분간 분리하였다. 분리된 획분들은 collagenase-1 저해활성이 측정되었으며, 저해활성이 가장 높은 분획물은 재분리하여 단일획분의 펩타이드를 얻었다.
- Pepsin 가수분해물로부터 collagenase-1 저해 펩타이드를 분리정제하기 위해 Sephadex G-25 column에 주입하여 gel chromatography를 실시하였다. 분리정제 과정을 거쳐 총 4개의 획분을 얻었으며(Fig. 3.A), 각 획분의 collagenase-1 저해활성을 측정한 결과, 0.5 mg/mL의 농도에서 F1 획분의 저해 활성은 67.6%로 가장 높게 나타났다(Fig. 3.B). Sephadex G-25 column에서 분리된 활성획분 F1으로부터 collagenase-1 저해 펩타이드를 분리정제하기 위하여 C18 ODS column를 이용한 HPLC에서 분리를 실시하였다.
- , 2007)에서도 피부세포에서의 독성이 나타나지 않았다. 이에 따라 저분자량의 collagenase-1 저해 펩타이드가 피부 주름 억제 및 세포 보호능에 효과적일 것으로 판단되었다. 따라서 본 연구에서 분리 정제된 collagenase-1 저해 펩타이드는 100 µg/mL 이하 범위에서는 피부에서 세포독성이 나타나지 않았으므로 저분자량 펩타이드로서 피부손상을 보호하는 새로운 기능성 화장품 및 의약품 천연소재로 활용될 수 있을 것이라 여겨진다.
- 정제된 F1-2-I 획분의 아미노산 서열을 분석한 결과, AsnLeu-Asp-Val-Leu- Glu-Val-Phe(분자량 : 961 Da)의 8개의 아미노산을 가지고 있었으며, 이 펩타이드의 IC50 값은 87.0 µM 로 나타났다(Fig. 6).
- 4 mg/mL의 농도에서는 doxycycline보다 저해 활성이 더 높았다. 한편, alcalase 가수분해물의 수득율이 가장 높았지만 collagenase-1 저해 활성은 pepsin 가수분해물이 가장 높은 것으로 보아 가수분해도와 collagenase-1 저해 활성과는 상관관계가 없는 것으로 판단되었다.
- 그러므로 pepsin 가수분해물에서 분리된 collagenase-1 저해 펩타이드는 C말단에 phenylalanine이 존재하였다. 한편, 정제된 저해 펩타이드의 아미노산과 껍질의 구성아미노산 조성을 비교하면 껍질의 구성아미노산 중 함량이 많았던 glycine(32.36%) 과 alanine(10.12%)은 저해 펩타이드에 전혀 포함되지 않았고, 저해 펩타이드에는 소수성 아미노산인 leucine 및 valine이 많이 포함된 것을 알 수 있었다. Borkakoti(2004)의 보고에 따르면, collagenase-1은 기질과 결합하는 특이적인 활성부위인 P1’ , P2’/P3’, P1’(alpha) 및 아연 킬레이트(chelator)를 가지고 있으며, 아연 이외에 칼슘이온에 의존적인 효소이다.
후속연구
- 따라서 본 연구에서 분리 정제된 collagenase-1 저해 펩타이드는 100 µg/mL 이하 범위에서는 피부에서 세포독성이 나타나지 않았으므로 저분자량 펩타이드로서 피부손상을 보호하는 새로운 기능성 화장품 및 의약품 천연소재로 활용될 수 있을 것이라 여겨진다.
- , 2007)에서 저분자의 콜라겐 펩타이드의 collagenase-1 저해 활성을 확인하였으며, 홍어껍질에 다량으로 함유된 콜라겐 펩타이드의 가수분해물에서도 collganase-1 저해 활성을 확인하였다. 또한 단백질 가수분해물 및 저분자 펩타이드는 체내의 흡수율이 높으며, 추출물에 비해 독성이 낮으므로 단백질 가수분해물 및 저분자의 펩타이드가 collagenase-1 저해 물질로 활용 가능성이 높다고 할 수 있겠다.
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