토마토 종자로부터 PCR을 이용한 Pseudomonas syringae pv. tomato의 검출 Development and Evaluation of PCR-Based Detection for Pseudomonas syrinage pv. tomato in Tomato Seeds원문보기
P. syringae pv. tomato는 토마토에서 bacterial speck병을 일으키는 종자전염 세균으로, 감수성 품종에서 주로 발병하여 경제적으로 큰 손실을 입힌다. 따라서 P. syringae pv. tomato는 한국을 비롯한 많은 나라에서 식물 검역대상 세균으로 지정하여 관리되고 있다. 본 연구에서 우리는 토마토 종자로부터 PCR을 이용하여 Pst를 검출할 수 있는 방법을 개발하였다. P. syringae pv. tomato의 hrpZ 유전자에서 특이적인 프라이머를 개발하였다. 개발된 프라이머는 P. syringae pv. tomato에서만 501 bp 크기의 특이적 DNA를 증폭하였으며, P. syringae pv. glycinea, P. syringae pv. maculicola, P. syringae pv. atropurpurea, P. syringae pv. morsprunorum와 같은 다른 토마토 세균병원균과 P. syringae pathovar 균주들에서는 증폭되지 않았다. Nested PCR 프라이머를 이용한 PCR에서도 오직 P. syringae pv. tomato에서만 119 bp 크기의 특이적 DNA가 증폭되었고, 토마토 종자에서 P. syringae pv. tomato을 정확하고 민감하게 검출하였다. 본 연구는 현재까지 사용되고 있는 Pst의 검출방법의 민감도를 비교한 최초의 보고로 본 연구에서 개발된 PCR방법들은 토마토 종자에서 Pst을 검출하는 매우 유용한 방법으로 생각된다.
P. syringae pv. tomato는 토마토에서 bacterial speck병을 일으키는 종자전염 세균으로, 감수성 품종에서 주로 발병하여 경제적으로 큰 손실을 입힌다. 따라서 P. syringae pv. tomato는 한국을 비롯한 많은 나라에서 식물 검역대상 세균으로 지정하여 관리되고 있다. 본 연구에서 우리는 토마토 종자로부터 PCR을 이용하여 Pst를 검출할 수 있는 방법을 개발하였다. P. syringae pv. tomato의 hrpZ 유전자에서 특이적인 프라이머를 개발하였다. 개발된 프라이머는 P. syringae pv. tomato에서만 501 bp 크기의 특이적 DNA를 증폭하였으며, P. syringae pv. glycinea, P. syringae pv. maculicola, P. syringae pv. atropurpurea, P. syringae pv. morsprunorum와 같은 다른 토마토 세균병원균과 P. syringae pathovar 균주들에서는 증폭되지 않았다. Nested PCR 프라이머를 이용한 PCR에서도 오직 P. syringae pv. tomato에서만 119 bp 크기의 특이적 DNA가 증폭되었고, 토마토 종자에서 P. syringae pv. tomato을 정확하고 민감하게 검출하였다. 본 연구는 현재까지 사용되고 있는 Pst의 검출방법의 민감도를 비교한 최초의 보고로 본 연구에서 개발된 PCR방법들은 토마토 종자에서 Pst을 검출하는 매우 유용한 방법으로 생각된다.
The bacterial speck of tomato caused by Pseudomonas syringae pv. tomato leads to serious economic losses especially on fruits of susceptible genotype. Thus, Pseudomonas syringae pv. tomato is a plant quarantine bacterium in many countries including Korea. In this study, we developed specific PCR ass...
The bacterial speck of tomato caused by Pseudomonas syringae pv. tomato leads to serious economic losses especially on fruits of susceptible genotype. Thus, Pseudomonas syringae pv. tomato is a plant quarantine bacterium in many countries including Korea. In this study, we developed specific PCR assays for detection of the bacterium from tomato seeds. A specific primer set is designed from the hrpZ gene for specific detection of Pseudomonas syringae pv. tomato. A 501 bp PCR product corresponding to hrpZ gene was amplified only form Pseudomonas syringae pv. tomato strains, but no PCR product was amplified from other tomato bacterial pathogens, such as Pseudomonas syringae pv. glycinea, P. syringae pv. maculicola, P. syringae pv. atropurpurea, P. syringae pv. morsprunorum, and from other P. syringae pathovar strains. The nested-PCR primer set corresponding to an internal fragment of the 501 bp sequence (hrpZ) gine was used to specific detection of Pseudomonas syringae pv. tomato in tomato seed. A 119 bp PCR product using nested PCR primer was highly specific and sensitive to detect low level of Pseudomonas syrigae pv. tomato in tomato seeds. We believe that the PCR assays developed in this study is very useful to detect Pseudomonas syringae pv. tomato from the tomato seeds.
The bacterial speck of tomato caused by Pseudomonas syringae pv. tomato leads to serious economic losses especially on fruits of susceptible genotype. Thus, Pseudomonas syringae pv. tomato is a plant quarantine bacterium in many countries including Korea. In this study, we developed specific PCR assays for detection of the bacterium from tomato seeds. A specific primer set is designed from the hrpZ gene for specific detection of Pseudomonas syringae pv. tomato. A 501 bp PCR product corresponding to hrpZ gene was amplified only form Pseudomonas syringae pv. tomato strains, but no PCR product was amplified from other tomato bacterial pathogens, such as Pseudomonas syringae pv. glycinea, P. syringae pv. maculicola, P. syringae pv. atropurpurea, P. syringae pv. morsprunorum, and from other P. syringae pathovar strains. The nested-PCR primer set corresponding to an internal fragment of the 501 bp sequence (hrpZ) gine was used to specific detection of Pseudomonas syringae pv. tomato in tomato seed. A 119 bp PCR product using nested PCR primer was highly specific and sensitive to detect low level of Pseudomonas syrigae pv. tomato in tomato seeds. We believe that the PCR assays developed in this study is very useful to detect Pseudomonas syringae pv. tomato from the tomato seeds.
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문제 정의
tomato는 한국을 비롯한 많은 나라에서 식물 검역대상 세균으로 지정하여 관리되고 있다. 본 연구에서 우리는 토마토 종자로부터 PCR을 이용하여 Pst를 검출할 수 있는 방법을 개발하였다. P.
syringae 균주들과 거의 차이가 나지 않기 때문에 Pst 검출만을 위한 방법으로 사용되기는 어렵다. 본 연구에서는 새로운 PCR 프라이머를 이용하여 기존의 방법보다 더 빠르고, 특이성이 높으며, 민감한 검출 방법을 개발하고자 하였다. PCR 프라이머는 Pst hrp pathogenicity island의 내부에서 hrpZ 유전자 부분을 이용하여 디자인 하였으며, PCR의 검출 민감도를 높이기 위해 1st PCR 산물의 내부 영역에서 nested PCR 프라이머를 개발하였다.
제안 방법
PCR 프라이머들의 특이성을 확인하기 위해서 Cho 등(2011)의 방법에 의해서 Pst균주 6개와 Pseudomonas spp., 그리고 주요 식물세균병원균들의 DNA와 프라이머 Pst-JH-F/R을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 실험결과, 오직 Pst 균주들에서만 501 bp 크기의 밴드가 증폭되는 것을 확인하였고, 다른 균주들에서는 어떤 DNA밴드도 검출되지 않았다(Fig.
본 연구에서는 새로운 PCR 프라이머를 이용하여 기존의 방법보다 더 빠르고, 특이성이 높으며, 민감한 검출 방법을 개발하고자 하였다. PCR 프라이머는 Pst hrp pathogenicity island의 내부에서 hrpZ 유전자 부분을 이용하여 디자인 하였으며, PCR의 검출 민감도를 높이기 위해 1st PCR 산물의 내부 영역에서 nested PCR 프라이머를 개발하였다. 또한 검출방법을 단순화하기 위해 토마토 종자 추출물을 직접 PCR에 사용하였다.
3)의 염기서열 내부에서 1113 bp 크기의 hrpZ 유전자 부분을 blast를 통해 확인 후 Primer3 프로그램을 이용하여 증폭산물이 501 bp 크기를 가지는 Pst-JH-F(5`-RGY TRA TYY RYG RAA AGY TC-3`)와 Pst-JH-R(5`-CRT CGR YYT CGR GRT TTC YY-3`) 1st PCR 프라이머를 선발하였다. PCR검출의 민감도를 높이기 위해서 1st PCR의 증폭 산물의 내부의 염기서열로부터 Pst-JH-F-ne(5`-RCA AGR CCC RGY YCC CYA CY-3`)와 Pst-JH-R-ne(5`-TTG RYY AAY GRC RYC RAR AG-3`)의 nested PCR용 프라이머를 디자인하였다. PCR 프라이머들의 특이성을 확인하기 위해서 Cho 등(2011)의 방법에 의해서 Pst균주 6개와 Pseudomonas spp.
syringae pv. tomato의 hrpZ 유전자에서 특이적인 프라이머를 개발하였다. 개발된 프라이머는 P.
1B). 개발된 프라이머가 토마토 DNA를 주형으로 DNA를 증폭할 수 있는지 여부를 확인하기 위해서 2종류의 토마토 종자, 2종류의 고추 종자, 1종류의 알팔파 종자에서 DNA를 추출하여 동일한 PCR을 수행하였다. 실험결과, 모든 토마토 종자의 DNA에서 어떤 특이적인 DNA도 증폭되지 않았다(자료 미제공).
PCR 프라이머는 Pst hrp pathogenicity island의 내부에서 hrpZ 유전자 부분을 이용하여 디자인 하였으며, PCR의 검출 민감도를 높이기 위해 1st PCR 산물의 내부 영역에서 nested PCR 프라이머를 개발하였다. 또한 검출방법을 단순화하기 위해 토마토 종자 추출물을 직접 PCR에 사용하였다.
ELISA의 경우 종자에서 검출을 할 때 교차반응에 의해 거짓반성반응이 일어나고, 검출민감도가 낮아 종자에서의 Pst의 검출이 불가능하다는 단점을 가지고 있다(Cuppels 등, 2006). 본 연구에서 Pst의 특이적인 검출을 위해 Pst의 hrp pathogenicity island 영역에서 프라이머를 제작하여 PCR에 사용되었다. Pst의 hrp island 영역은 다른 syringae 균주들과 구별될 수 있는 특이적 염기 서열을 가지고 있다 (Zaccardelli 등, 2005).
본 연구에서 개발한 PCR방법에 의해 증폭되는 주형 DNA의 농도 한계를 측정하기 위해 DNA를 10 ng 기준으로 10배씩 희석하여 PCR을 수행하였다. 실험결과, 10 ng의 1000배 희석농도인 0.
1A). 종자에 낮은 농도로 감염되어 있는 Pst의 경우 일반 PCR 검출방법으로 검출이 불가능하기 때문에 민감도를 높이기 위해서 1st PCR 증폭산물의 내부 영역에서 nested PCR 프라이머인 Pst-JH-F/R-ne을 선발하였다. 선발된 nested PCR 프라이머의 특이성을 확인하기 위한 PCR에서 Pst 균주들에서 만 119 bp 크기의 밴드가 증폭되는 것을 확인하였고, 다른 균주에서는 어떤 DNA도 증폭되지 않았다(Fig.
혈청학적 검출방법인 ELISA의 경우 인공오염 된 토마토 종자에서 병원균 접종농도 103 CFU/ml까지 양성반응을 확인하였다 (Table 2).
대상 데이터
본 연구에 사용한 균주는 Table 1과 같으며, 각각 한국농업미생물자원센타(Korean Agricultural Culture Collection, Korea), 한국미생물자원센타(Korean Collection for Type Cultures, Korea), 벨기에 BCCM-LMG(Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms, Belgium)에서 분양 받았다. 또한 일부는 충북대학교 세균병학실험실 수집균주도 사용되었다.
또한 일부는 충북대학교 세균병학실험실 수집균주도 사용되었다. 본 연구에서 Pst의 검출을 위해 개발된 프라이머는 NCBI에 서 보고된 Pst DC3000균주의 hrp pathogenicity island (AF232004.3)의 염기서열 내부에서 1113 bp 크기의 hrpZ 유전자 부분을 blast를 통해 확인 후 Primer3 프로그램을 이용하여 증폭산물이 501 bp 크기를 가지는 Pst-JH-F(5`-RGY TRA TYY RYG RAA AGY TC-3`)와 Pst-JH-R(5`-CRT CGR YYT CGR GRT TTC YY-3`) 1st PCR 프라이머를 선발하였다. PCR검출의 민감도를 높이기 위해서 1st PCR의 증폭 산물의 내부의 염기서열로부터 Pst-JH-F-ne(5`-RCA AGR CCC RGY YCC CYA CY-3`)와 Pst-JH-R-ne(5`-TTG RYY AAY GRC RYC RAR AG-3`)의 nested PCR용 프라이머를 디자인하였다.
이론/모형
Pst에 농도 별로 인공오염 시킨 토마토종자에서 DNA의 추출과정 없이 PCR을 수행하기 위해서 Cho 등(2010)의 방법을 이용하여 종자 추출물을 제조하였다. 토마토종자의 추출물을 이용하여 기존의 Pst의 검출방법으로 사용되었던 반선택배지(KBC)의 경우 배양 72시간 후에 조사하였을 때, Pst의 전형적인 콜로니가 배지상에서 나타났고, 104 CFU/ml의 접종농도까지 검출이 가능하였다(Table 2).
성능/효과
, 그리고 주요 식물세균병원균들의 DNA와 프라이머 Pst-JH-F/R을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 실험결과, 오직 Pst 균주들에서만 501 bp 크기의 밴드가 증폭되는 것을 확인하였고, 다른 균주들에서는 어떤 DNA밴드도 검출되지 않았다(Fig. 1A). 종자에 낮은 농도로 감염되어 있는 Pst의 경우 일반 PCR 검출방법으로 검출이 불가능하기 때문에 민감도를 높이기 위해서 1st PCR 증폭산물의 내부 영역에서 nested PCR 프라이머인 Pst-JH-F/R-ne을 선발하였다.
syringae pv. tomato을 정확하고 민감하게 검출하였다. 본 연구는 현재까지 사용되고 있는 Pst의 검출방법의 민감도를 비교한 최초의 보고로 본 연구에서 개발된 PCR방법들은 토마토 종자에서 Pst을 검출하는 매우 유용한 방법으로 생각된다.
또한 1st PCR의 증폭산물들을 10 배 희석 후 1 µl을 사용하여 nested PCR을 수행했을 때 1st PCR의 증폭 최종농도보다 100배 더 희석한 시료에서도 특이적 DNA가 증폭되었다(Fig. 2B).
tomato을 정확하고 민감하게 검출하였다. 본 연구는 현재까지 사용되고 있는 Pst의 검출방법의 민감도를 비교한 최초의 보고로 본 연구에서 개발된 PCR방법들은 토마토 종자에서 Pst을 검출하는 매우 유용한 방법으로 생각된다.
본 연구에서 개발된 PCR 프라이머를 이용하여 인공오염 시킨 토마토 종자에서 PCR을 수행한 결과, 1st PCR의 경우 103 CFU/ml까지 특이적 DNA가 증폭되었다.
본 연구에서 개발된 PCR방법과 nested PCR방법은 기존의 PCR 검출방법들이 종자로부터 병원균을 검출할 수 있을 만큼 민감도가 충분하지 않다는 단점을 개선하였고, 또 한 종자 추출액을 직접 PCR에 이용하는 방법은 기존의 Pst의 검출을 위해 DNA를 추출하여 PCR에 사용하던 방법들(Berewill 등, 1994; Cuppels와 Anisworth, 1995; Cuppels, 2006; Leite 등, 1994; Manceau와 Horvais, 1997; Zaccardelli 등, 2005)에 비해 DNA의 추출로 소비되는 시간을 절약할 수 있고, DNA의 오염 등에 의해 일어날 수 있는 거짓양성반응을 방지할 수 있다는 장점을 가졌다. 따라서 본 연구에서 개발된 PCR방법은 토마토 종자로부터 빠르고 정확하게 Pst를 검출하는데 사용될 수 있을 것으로 생각된다.
종자에 낮은 농도로 감염되어 있는 Pst의 경우 일반 PCR 검출방법으로 검출이 불가능하기 때문에 민감도를 높이기 위해서 1st PCR 증폭산물의 내부 영역에서 nested PCR 프라이머인 Pst-JH-F/R-ne을 선발하였다. 선발된 nested PCR 프라이머의 특이성을 확인하기 위한 PCR에서 Pst 균주들에서 만 119 bp 크기의 밴드가 증폭되는 것을 확인하였고, 다른 균주에서는 어떤 DNA도 증폭되지 않았다(Fig. 1B). 개발된 프라이머가 토마토 DNA를 주형으로 DNA를 증폭할 수 있는지 여부를 확인하기 위해서 2종류의 토마토 종자, 2종류의 고추 종자, 1종류의 알팔파 종자에서 DNA를 추출하여 동일한 PCR을 수행하였다.
본 연구에서 개발한 PCR방법에 의해 증폭되는 주형 DNA의 농도 한계를 측정하기 위해 DNA를 10 ng 기준으로 10배씩 희석하여 PCR을 수행하였다. 실험결과, 10 ng의 1000배 희석농도인 0.01 ng에서 501 bp 크기의 특이적 DNA가 증폭되었다(Fig. 2A). 또한 1st PCR의 증폭산물들을 10 배 희석 후 1 µl을 사용하여 nested PCR을 수행했을 때 1st PCR의 증폭 최종농도보다 100배 더 희석한 시료에서도 특이적 DNA가 증폭되었다(Fig.
개발된 프라이머가 토마토 DNA를 주형으로 DNA를 증폭할 수 있는지 여부를 확인하기 위해서 2종류의 토마토 종자, 2종류의 고추 종자, 1종류의 알팔파 종자에서 DNA를 추출하여 동일한 PCR을 수행하였다. 실험결과, 모든 토마토 종자의 DNA에서 어떤 특이적인 DNA도 증폭되지 않았다(자료 미제공).
이 결과는 nested PCR의 검출 민감도가 반 선택배지, ELISA보다는 100−1,000배 더 민감하고, 1st PCR에 의한 검출보다 100배 더 검출 민감도가 높다는 것을 의미한다.
Pst에 농도 별로 인공오염 시킨 토마토종자에서 DNA의 추출과정 없이 PCR을 수행하기 위해서 Cho 등(2010)의 방법을 이용하여 종자 추출물을 제조하였다. 토마토종자의 추출물을 이용하여 기존의 Pst의 검출방법으로 사용되었던 반선택배지(KBC)의 경우 배양 72시간 후에 조사하였을 때, Pst의 전형적인 콜로니가 배지상에서 나타났고, 104 CFU/ml의 접종농도까지 검출이 가능하였다(Table 2). 접종농도 103 CFU/ml 미만에서는 반선택배지에 부생성 세균의 생장으로 인해 정확하게 Pst의 콜로니를 구별하기는 어려웠다.
후속연구
본 연구에서 개발된 PCR방법과 nested PCR방법은 기존의 PCR 검출방법들이 종자로부터 병원균을 검출할 수 있을 만큼 민감도가 충분하지 않다는 단점을 개선하였고, 또 한 종자 추출액을 직접 PCR에 이용하는 방법은 기존의 Pst의 검출을 위해 DNA를 추출하여 PCR에 사용하던 방법들(Berewill 등, 1994; Cuppels와 Anisworth, 1995; Cuppels, 2006; Leite 등, 1994; Manceau와 Horvais, 1997; Zaccardelli 등, 2005)에 비해 DNA의 추출로 소비되는 시간을 절약할 수 있고, DNA의 오염 등에 의해 일어날 수 있는 거짓양성반응을 방지할 수 있다는 장점을 가졌다. 따라서 본 연구에서 개발된 PCR방법은 토마토 종자로부터 빠르고 정확하게 Pst를 검출하는데 사용될 수 있을 것으로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Pseudomonas syringae pv. tomato란 무엇인가?
Pseudomonas syringae pv. tomato(Pst)는 종자 전염성 병원세균으로 다양한 토마토 품종에서 bacterial speck병을 일으키고, 토마토의 재배지역에서 중요한 병원균 중 하나 로 알려져 왔다(Cuppels와 Elmgirst, 1999). Pst에 의한 병 징은 과실과 잎에서 다각형의 점무늬가 나타나고, 점무늬 주위에 점차 노란색의 달무리가 생긴다(Zaccardilli 등, 2005).
Pst가 국내에서도 식물검역 관리 병으로 지정되어 관리되고 있는 이유는 무엇인가?
Pst에 의한 병 징은 과실과 잎에서 다각형의 점무늬가 나타나고, 점무늬 주위에 점차 노란색의 달무리가 생긴다(Zaccardilli 등, 2005). Pst는 발병 시 토마토의 과실에 피해를 입혀 큰 경제적 손실을 가져오기 때문에 중요한 식물 세균병원균으로 알려져 왔고, 국내에서도 식물검역 관리병으로 지정되어 관 리되고 있다(Zaccardilli 등, 2002).
Pseudomonas syringae pv. tomato에 의한 병 징은 무엇인가?
tomato(Pst)는 종자 전염성 병원세균으로 다양한 토마토 품종에서 bacterial speck병을 일으키고, 토마토의 재배지역에서 중요한 병원균 중 하나 로 알려져 왔다(Cuppels와 Elmgirst, 1999). Pst에 의한 병 징은 과실과 잎에서 다각형의 점무늬가 나타나고, 점무늬 주위에 점차 노란색의 달무리가 생긴다(Zaccardilli 등, 2005). Pst는 발병 시 토마토의 과실에 피해를 입혀 큰 경제적 손실을 가져오기 때문에 중요한 식물 세균병원균으로 알려져 왔고, 국내에서도 식물검역 관리병으로 지정되어 관 리되고 있다(Zaccardilli 등, 2002).
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