[논문]초고속 Real-time PCR을 이용한 Tomato yellow leaf curl virus의 신속진단

김택수; 최승국; 고민정; 이민호; 최형석; 이세원; 박경석; 박진우

doi:10.5423/rpd.2012.18.4.298

초고속 Real-time PCR을 이용한 Tomato yellow leaf curl virus의 신속진단
Ultra-rapid Real-time PCR for the Detection of Tomato yellow leaf curl virus 원문보기

Research in plant disease = 식물병연구, v.18 no.4, 2012년, pp.298 - 303

김택수 (국립농업과학원 농업미생물과) , 최승국 (국립원예특작과학원 원예특작환경과) , 고민정 (국립농업과학원 농업미생물과) , 이민호 (국립농업과학원 유기농업과) , 최형석 (국립농업과학원 농업미생물과) , 이세원 (국립농업과학원 농업미생물과) , 박경석 (국립농업과학원 농업미생물과) , 박진우 (국립농업과학원 농업미생물과)

초록
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토마토황화잎말림바이러스(Tomato yellow leaf curl virus; TYLCV)는 온실가루이(Bemisia tabaci)에 의해서 영속전염되는 DNA 바이러스로 토마토에 발생하는 가장 중요한 병 중 하나이다. 우리나라에서 TYLCV는 2008년 최초로 보고된 이래 급속하게 전국적으로 확산되어 토마토 생산에 심각한 경제적 손실을 일으키고 있다. 토마토 생산과정에서 TYLCV의 확산을 최소화하기 위해 바이러스의 조기진단이 매우 중요하다. 본 연구에서는 바이러스의 신속진단을 위해 초고속 정밀 PCR 진단기술을 개발하였으며, 이는 마이크로칩을 기반으로 하여 $5{\mu}l$의 시료만으로 PCR을 수행할 수 있도록 고안된, 휴대가 가능할 정도의 소형 GenSpector$^{TM}$ TMC-1000 PCR 기기를 이용한 새로운 기술이다. 본 연구에서 개발된 초고속 정량 PCR을 이용하였을 때 TYLCV 진단을 위한 30 cycle의 PCR과 용융점분석(melting curve analysis)에 15분 이내의 시간이 소요되었으며, GenSpector$^{TM}$ TMC-1000 PCR을 이용한 초고속 정밀진단 기술은 향후 TYLCV의 대발생을 모니터링하는데 유용하게 사용될 수 있을 것으로 생각한다. 본 연구결과는 GenSpector$^{TM}$ TMC-1000 PCR기반의 초고속정량 PCR 기술을 이용한 식물 바이러스의 진단기술 개발로는 최초의 보고이다.

Abstract ▼ AI-Helper

Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), transmitted exclusively by the whitefly (Bemisia tabaci) in a circulative manner is one of the most important virus in tomato. Since the first report of TYLCV incidence in Korea in 2008, the virus has rapidly spread nationwide. TYLCV currently causes serious economic losses in tomato production in Korea. Early detection of TYLCV is one of the most important methods to allow rouging of infected tomato plants to minimize the spread of TYLCV disease. We have developed an ultra-rapid and sensitive real-time polymerase chain reaction (PCR) using a new designed real-time PCR system, GenSpectorTM TMC-1000 that is a small and portable real-time PCR machine requiring only a $5{\mu}l$ reaction volume on microchips. The new system provides ultra-high speed reaction (30 cycles in less than 15 minutes) and melting curve analysis for amplified TYLCV products. These results suggest that the short reaction time and ultra sensitivity of the GenSpector$^{TM}$-based real-time PCR technique is suitable for monitoring epidemics and pre-pandemic TYLCV disease. This is the first report for plant virus detection using an ultra-rapid real-time PCR system.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서 개발된 초고속 정량 PCR을 이용하였을 때 TYLCV 진단을 위한 30 cycle의 PCR과 용융점분석(melting curve analysis)에 15분 이내의 시간이 소요되었으며, GenSpector^TM TMC-1000 PCR을 이용한 초고속 정밀진단 기술은 향후 TYLCV의 대발생을 모니터링하는데 유용하게 사용될 수 있을 것으로 생각한다. 본 연구결과는 GenSpector^TM TMC-1000 PCR기반의 초고속정량 PCR 기술을 이용한 식물 바이러스의 진단기술 개발로는 최초의 보고이다.
, 2007), 꿀벌에 발생하는 Sacbrood virus(SBV; Yoo 등, 2012) 등 동물 바이러스의 성공적인 진단기술 개발이 보고되고 있다. 본 연구는 최근 토마토 재배농가에서 문제가 되고 있는 TYLCV의 조기 발견을 통한 확산방지 시스템 구축을 위하여 마이크로칩 기반의 ultra-rapid real-time PCR을 이용한 TYLCV의 신속한 진단방법을 개발하고 농업 현장이나 검역 현장에서 활용할 수 있는 가능성을 검토하고자 수행하였다.
본 연구에서는 바이러스의 신속 진단을 위해 초고속 정밀 PCR 진단기술을 개발하였으며, 이는 마이크로칩을 기반으로 하여 5 µl의 시료만으로 PCR을 수행할 수 있도록 고안된, 휴대가 가능할 정도의 소형 GenSpectorTM TMC-1000 PCR 기기를 이용한 새로운 기술이다.

제안 방법

TYLCV real-time PCR을 위한 표준시료 제작. 712 bp의 PCR products를 DNA extraction kit(Intron, USA)로 추출한 후 pGEMR-T Easy Vector를 이용하여 클로닝하였다. 클로닝된 TYLCV 외피단백질 유전자는 nanodrop(Thermo ND-1000, USA)을 이용하여 1000 pg에서 0.
Ultra-rapid real-time PCR을 이용한 포장 시료의 TYLCV 감염 여부를 확인하기 위해 충남 공주에서 채집한 TYLCV 감염 의심 토마토 시료를 진단하였다. DNA 추출과 PCR은 위에 언급한 방법과 동일하게 수행하였으며, Ultra-rapid real-time PCR과 PCR을 동시에 수행하여 결과를 비교하였다.
GenSpector TMC-1000 전용으로 제작된 2 × master mix (Genet Bio, Korea) 3 µl에 100 pg으로 조정한 주형 DNA 1 µl, 10 pmol의 프라이머 TYLCV-f2, TYLCV-r2-1을 각각 1 µl씩 넣어 총 6 µl로 조정한 후, 이 중 5 µl를 PCR-chip에 넣어 반응시켰다.
Viral DNA Extraction kit(Intron, Korea)를 이용하여 제시된 과정에 따라 TYLCV에 감염된 토마토 잎에서 DNA를 분리한 후, Maxime PCR premix kit(Intron, USA)에 제공된 PCR용 tube에 주형(template) DNA 1 µl 및 TYLCV 검출용 프라이머 TYLCV-1f와 TYLCV-1r-2(Table 1)를 각각 1 µl씩 넣고, 17 µl의 멸균수를 넣어 최종반응액을 20 µl로 조성하였다. PCR 조건은 94℃에서 pre-denaturation 5분, 94℃에서 denaturation 30초, 56℃에서 annealing 30초, 72℃에서 extension 30초의 조건으로 35 cycle의 PCR을 수행하였다.
진단용 프라이머 제작. PCR용 프라이머는 국립농업과학원 작물보호과 바이러스연구실에서 분양받은 TYLCV용 프라이머를 이용하였으며(Table 1), real-time PCR 및 ultra-rapid real-time PCR용 프라이머는 NCBI의 유전자정보를 바탕으로 DNAMAN software(Lynnon, Canada)를 사용하여 디자인한 후 바이오니아(Bioneer, Korea)사에 제작을 의뢰하여 합성하였다(Table 1).
PCR 기기. PCR은 PTC-100^TM(MJ Research, USA) 기기를 사용하였고, real-time PCR은 Icycler^TM IQ(Bio-Rad, USA) 기기를 사용하였다. Ultra-rapid real-time PCR은 GenSpector TMC-1000(Samsung, Korea) 기기를 사용하였는데, GenSpector TMC-1000은 백금과 실리콘칩을 기반으로 제작되었으며, 1초당 10℃의 온도변화가 가능하며 총 5 µl를 PCR 반응액으로 사용하도록 디자인되었다.
Real-time PCR을 위해 2 × iQTM SYBR®Green supermix(Bio-Rad, USA) 25 µl에 농도별로 희석된 주형 DNA 1 µl와 10 pmol의 real-time PCR용 프라이머 TYLCV-f2, TYLCV-r2-1(Table 1)을 각각 1 µl씩 넣고, 최종적으로 멸균수 22 µl를 넣어 총 50 µl로 조정하였다.
Ultra-rapid real-time PCR은 GenSpector TMC-1000(Samsung, Korea) 기기를 사용하였는데, GenSpector TMC-1000은 백금과 실리콘칩을 기반으로 제작되었으며, 1초당 10℃의 온도변화가 가능하며 총 5 µl를 PCR 반응액으로 사용하도록 디자인되었다.
TYLCV 감염 토마토 잎에서 바이러스의 진단. Ultra-rapid real-time PCR을 이용한 포장 시료의 TYLCV 감염 여부를 확인하기 위해 충남 공주에서 채집한 TYLCV 감염 의심 토마토 시료를 진단하였다. DNA 추출과 PCR은 위에 언급한 방법과 동일하게 수행하였으며, Ultra-rapid real-time PCR과 PCR을 동시에 수행하여 결과를 비교하였다.
Viral DNA Extraction kit(Intron, Korea)를 이용하여 제시된 과정에 따라 TYLCV에 감염된 토마토 잎에서 DNA를 분리한 후, Maxime PCR premix kit(Intron, USA)에 제공된 PCR용 tube에 주형(template) DNA 1 µl 및 TYLCV 검출용 프라이머 TYLCV-1f와 TYLCV-1r-2(Table 1)를 각각 1 µl씩 넣고, 17 µl의 멸균수를 넣어 최종반응액을 20 µl로 조성하였다.
GenSpector TMC-1000 전용으로 제작된 2 × master mix (Genet Bio, Korea) 3 µl에 100 pg으로 조정한 주형 DNA 1 µl, 10 pmol의 프라이머 TYLCV-f2, TYLCV-r2-1을 각각 1 µl씩 넣어 총 6 µl로 조정한 후, 이 중 5 µl를 PCR-chip에 넣어 반응시켰다. 반응조건은 94℃에서 pre-denaturation 1분을 수행한 후, 94℃에서 denaturation, 56℃에서 annealing, 72℃에서 extension 과정을 30 cycle로 PCR 하였으며, 최적조건을 확립하기 위하여 denaturation/annealing/extension은 각각 10초/10초/10초, 5초/5초/5초, 3초/3초/3초로 반응시간을 달리하여 수행하였다.
Real-time PCR을 위해 2 × iQ^TM SYBR^®Green supermix(Bio-Rad, USA) 25 µl에 농도별로 희석된 주형 DNA 1 µl와 10 pmol의 real-time PCR용 프라이머 TYLCV-f2, TYLCV-r2-1(Table 1)을 각각 1 µl씩 넣고, 최종적으로 멸균수 22 µl를 넣어 총 50 µl로 조정하였다. 반응조건은 94℃에서 pre-denaturation 5분, 94℃에서 denaturation 30초, 56℃에서 annealing 30초, 72℃에서 extension 30초로 하여 총 35 cycle의 real-time PCR을 수행하였다.
712 bp의 PCR products를 DNA extraction kit(Intron, USA)로 추출한 후 pGEMR-T Easy Vector를 이용하여 클로닝하였다. 클로닝된 TYLCV 외피단백질 유전자는 nanodrop(Thermo ND-1000, USA)을 이용하여 1000 pg에서 0.1 pg까지 10배 단위로 희석한 후 real-time PCR의 상대정량을 위한 주형으로 사용하였다.

대상 데이터

공시 바이러스. 2009년 경남 함안과, 의령, 2010년 충남 공주의 토마토 시설하우스에서 황화 및 잎말림 증상을 나타내는 TYLCV 감염주를 채집하였으며, 감염주는 온실에서 TYLCV 보독 담배가루이의 건전주 접종을 통해 계대보존하면서 실험에 사용하였다.

성능/효과

100 pg의 농도로 조정된 주형 DNA를 이용하여 ultra-rapid real-time PCR을 수행한 결과, denaturation/annealing/extenstion의 과정을 각각 10초/10초/10초, 5초/5초/5초, 3초/3초/3초 처리한 경우, 용융온도분석(Tm; Melting temperature analysis)을 포함한 소요시간이 37분 35초, 28분 20초, 15분 29초로 모두 PCR이나 real-time PCR에 비해 현저하게 단축됨을 확인할 수 있었다(Table 2). 반응시간을 3초/3초/3초로 처리한 경우 17.
1000 pg부터 0.1 pg까지 10배 단위 농도로 희석된 TYLCV 외피단백질 유전자를 주형으로 하여 real-time PCR을 수행한 결과, 주형의 농도에 따른 Threshold Cycles(Ct) 값들의 회귀직선(Regression equation)은 Y= −5.309X + 54.559로 계산되었으며, 회귀상수 (Regression coefficient)는 R2= 0.964로 계산되었다(Fig. 1A).
PCR 후 각각의 PCR 반응액 5 µl를 다시 회수하여 전기영동한 결과 검출한계보다 높은 농도인 1 ng에서 0.1 pg까지의 모든 시료에서 예상한 109 bp의 위치(Fig. 1B)에 band가 나타남으로써 제작된 프라이머가 정확하게 작동하였음을 확인하였다.
2). 동일한 결과를 포장에서 채집한 토마토 시료의 ultra-rapid real-time PCR에서도 얻었으며(Fig. 3), 이 결과를 토대로 ultra-rapid real-time PCR을 이용해 15분대에 TYLCV의 진단을 완료할 수 있다는 결론을 얻었다.
100 pg의 농도로 조정된 주형 DNA를 이용하여 ultra-rapid real-time PCR을 수행한 결과, denaturation/annealing/extenstion의 과정을 각각 10초/10초/10초, 5초/5초/5초, 3초/3초/3초 처리한 경우, 용융온도분석(Tm; Melting temperature analysis)을 포함한 소요시간이 37분 35초, 28분 20초, 15분 29초로 모두 PCR이나 real-time PCR에 비해 현저하게 단축됨을 확인할 수 있었다(Table 2). 반응시간을 3초/3초/3초로 처리한 경우 17.0의 Ct 값을 얻었으며, Tm 분석 결과 84.5℃에서 단일 peak를 형성하는 것을 확인하였다(Fig. 2). 동일한 결과를 포장에서 채집한 토마토 시료의 ultra-rapid real-time PCR에서도 얻었으며(Fig.

후속연구

Ct 값은 반응시간이 길어질수록 낮아졌는데(Table 2), 이는 반응시간이 길어질수록 유전자의 증폭이 더 많이 일어나는 것을 의미하는 것이라 추측하지만, HIV를 대상으로 한 기존의 연구에서 반응시간을 충분하게 하는 것이 PCR에서 결코 유리한 것이 아니라는 고찰(Lee 등, 2007) 과는 다소 다른 결과이기에 면밀한 검토가 필요할 것으로 생각한다. Tm 값은 각 처리별로 다소 편차가 있었는데, 이에 대해서는 Lee 등(2007)의 연구와 동일한 경향이 었으며, 잔류 프라이머 등이 Tm 값에 미치는 영향에 대해서는 추후 분석을 통해 보다 정밀한 조건 확립이 필요할 것으로 생각한다.
이와 병행하여, 포장에서 식물체 시료로부터 바이러스 핵산을 추출하는 시간을 단축하기 위해 Cho 등(2006)에 의해 개발된 간이핵산추출법을 ultra-rapid real-time PCR에 접목한다면 전체적으로 1시간 이내의 짧은 시간에 식물 바이러스를 정밀진단할 수 있을 것으로 기대된다. Ultra-rapid real-time PCR 진단용 마이크로칩은 현재 단가가 1점당 7천원 정도로 고가이기 때문에 전체적인 진단비용은 PCR이나 real-time PCR에 비해 1.5배 정도 비싸지만, 향후 수요가 증가하고 대량생산이 된다면 진단비용을 크게 낮출 수 있을 것으로 기대한다. 본 연구에서 사용된 GenSpector TMC-1000(Samsung, Korea) 기기는 일반 PCR 기기와 비슷한 크기이며 휴대용으로 사용하기에는 다소 크지만 승용차에는 충분히 탑재가 가능하며, 향후 기기의 소형화 연구가 동반된다면 농업 현장이나 검역 현장 등에서 바이러스의 정밀진단을 위해 유용하게 실용화될 수 있을 것으로 생각한다.
Ultra-rapid real-time PCR의 주 목적은 고감도로 신속하게 바이러스를 진단하는 데 있으며, 여기에 더해 이동식 장비를 이용해 현장에서 바로 바이러스를 진단할 수 있다면 최고의 효율성을 확보할 수 있을 것이다. 본 연구의 진단대상인 TYLCV는 DNA를 핵산으로 가지기 때문에 역전사 과정이 필요없지만 대부분의 식물 바이러스는 RNA를 핵산으로 가지기 때문에 역전사 과정을 포함하는 전체 반응시간을 단축하는데 초점을 맞추어 연구가 진행되어야 할 것이다(Yoo 등, 2012).
본 연구에서는 바이러스의 신속 진단을 위해 초고속 정밀 PCR 진단기술을 개발하였으며, 이는 마이크로칩을 기반으로 하여 5 µl의 시료만으로 PCR을 수행할 수 있도록 고안된, 휴대가 가능할 정도의 소형 GenSpector^TM TMC-1000 PCR 기기를 이용한 새로운 기술이다. 본 연구에서 개발된 초고속 정량 PCR을 이용하였을 때 TYLCV 진단을 위한 30 cycle의 PCR과 용융점분석(melting curve analysis)에 15분 이내의 시간이 소요되었으며, GenSpector^TM TMC-1000 PCR을 이용한 초고속 정밀진단 기술은 향후 TYLCV의 대발생을 모니터링하는데 유용하게 사용될 수 있을 것으로 생각한다. 본 연구결과는 GenSpector^TM TMC-1000 PCR기반의 초고속정량 PCR 기술을 이용한 식물 바이러스의 진단기술 개발로는 최초의 보고이다.
5배 정도 비싸지만, 향후 수요가 증가하고 대량생산이 된다면 진단비용을 크게 낮출 수 있을 것으로 기대한다. 본 연구에서 사용된 GenSpector TMC-1000(Samsung, Korea) 기기는 일반 PCR 기기와 비슷한 크기이며 휴대용으로 사용하기에는 다소 크지만 승용차에는 충분히 탑재가 가능하며, 향후 기기의 소형화 연구가 동반된다면 농업 현장이나 검역 현장 등에서 바이러스의 정밀진단을 위해 유용하게 실용화될 수 있을 것으로 생각한다.
Ultra-rapid real-time PCR의 주 목적은 고감도로 신속하게 바이러스를 진단하는 데 있으며, 여기에 더해 이동식 장비를 이용해 현장에서 바로 바이러스를 진단할 수 있다면 최고의 효율성을 확보할 수 있을 것이다. 본 연구의 진단대상인 TYLCV는 DNA를 핵산으로 가지기 때문에 역전사 과정이 필요없지만 대부분의 식물 바이러스는 RNA를 핵산으로 가지기 때문에 역전사 과정을 포함하는 전체 반응시간을 단축하는데 초점을 맞추어 연구가 진행되어야 할 것이다(Yoo 등, 2012). 이와 병행하여, 포장에서 식물체 시료로부터 바이러스 핵산을 추출하는 시간을 단축하기 위해 Cho 등(2006)에 의해 개발된 간이핵산추출법을 ultra-rapid real-time PCR에 접목한다면 전체적으로 1시간 이내의 짧은 시간에 식물 바이러스를 정밀진단할 수 있을 것으로 기대된다.
본 연구의 진단대상인 TYLCV는 DNA를 핵산으로 가지기 때문에 역전사 과정이 필요없지만 대부분의 식물 바이러스는 RNA를 핵산으로 가지기 때문에 역전사 과정을 포함하는 전체 반응시간을 단축하는데 초점을 맞추어 연구가 진행되어야 할 것이다(Yoo 등, 2012). 이와 병행하여, 포장에서 식물체 시료로부터 바이러스 핵산을 추출하는 시간을 단축하기 위해 Cho 등(2006)에 의해 개발된 간이핵산추출법을 ultra-rapid real-time PCR에 접목한다면 전체적으로 1시간 이내의 짧은 시간에 식물 바이러스를 정밀진단할 수 있을 것으로 기대된다. Ultra-rapid real-time PCR 진단용 마이크로칩은 현재 단가가 1점당 7천원 정도로 고가이기 때문에 전체적인 진단비용은 PCR이나 real-time PCR에 비해 1.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	토마토황화잎말림바이러스란?	토마토황화잎말림바이러스(Tomato yellow leaf curl virus; TYLCV)는 온실가루이(Bemisia tabaci)에 의해서 영속전염되는 DNA 바이러스로 토마토에 발생하는 가장 중요한 병 중 하나이다. 우리나라에서 TYLCV는 2008년 최초로 보고된 이래 급속하게 전국적으로 확산되어 토마토 생산에 심각한 경제적 손실을 일으키고 있다.
	TYLCV는 몇년도에 최초로 보고되었는가?	토마토황화잎말림바이러스(Tomato yellow leaf curl virus; TYLCV)는 온실가루이(Bemisia tabaci)에 의해서 영속전염되는 DNA 바이러스로 토마토에 발생하는 가장 중요한 병 중 하나이다. 우리나라에서 TYLCV는 2008년 최초로 보고된 이래 급속하게 전국적으로 확산되어 토마토 생산에 심각한 경제적 손실을 일으키고 있다. 토마토 생산과정에서 TYLCV의 확산을 최소화하기 위해 바이러스의 조기진단이 매우 중요하다.
	토마토황화잎말림바이러스의 확산을 최소화하기 위해서는 무엇이 중요한가?	우리나라에서 TYLCV는 2008년 최초로 보고된 이래 급속하게 전국적으로 확산되어 토마토 생산에 심각한 경제적 손실을 일으키고 있다. 토마토 생산과정에서 TYLCV의 확산을 최소화하기 위해 바이러스의 조기진단이 매우 중요하다. 본 연구에서는 바이러스의 신속진단을 위해 초고속 정밀 PCR 진단기술을 개발하였으며, 이는 마이크로칩을 기반으로 하여 $5{\mu}l$의 시료만으로 PCR을 수행할 수 있도록 고안된, 휴대가 가능할 정도의 소형 GenSpector$^{TM}$ TMC-1000 PCR 기기를 이용한 새로운 기술이다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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