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문제 정의
- solanacearum의 검출을 위해서는 종자에 직접 적용이 가능하고, 풋마름병 병원균 중 가장 문제가 되고 있는 race 1과 race 3을 동시에 검출할 수 있어야 한다. 따라서 본 연구에서는 식물 검역 현장에서 적용이 가능한 가지과 종자로부터 R. solanacearum race 1과 race 3을 한 번의 PCR로 동시에 검출할 수 있는 검출법을 개발하고자 하였다. 또한 검출의 민감도를 높이기 위해 nested-PCR 및 DNA의 추출없이 종자 추출물을 직접 PCR에 이용하는 방법을 개발하였다.
- solanacearum race 1과 race 3 균주을 특이적으로 검출이 가능하며, 가지과 종자 DNA와는 반응하지 않는다. 또한 본 연구에서는 DNA의 추출없이 종자 추출액을 직접 PCR에 이용하는 방법을 제시하였다. 종자 추출액을 직접 PCR에 이용하는 방법은, DNA를 사용하는 PCR 방법들(Kang 등, 2007; Poussier 등, 2002; Schonfeld 등, 2003)에 비해 시간을 절약할 수 있고 DNA 오염에 의해 나타날 수 있는 거짓양성반응을 방지할 수 있는 장점을 가졌다.
- 따라서 Ralstonia solanacearum는 한국을 비롯한 여러 나라에서 식물검역병으로 지정되어있다. 본 연구에서는 가지과 종자로부터 Ralstonia solanacearum 검출할 수 있는 PCR 방법을 개발하였다. 프라이머 RSJH-F와 RS-JH-R는 오직 Ralstonia solanacearum race 1, 3으로부터 401 bp 크기의 DNA를 증폭하였다.
제안 방법
- 16S rDNA 염기서열(HQ829834.1)을 Primer3 프로그램을 이용하여 증폭크기가 401 bp가 되도록 RS-JH-F(5'-TYAMAMAYGMARGYCRARCR-3')와 RS-JH-R(5'-TYTYTMCRGRCRARARTRCY-3')을 제작하였고, PCR의 검출 민감도를 높이기 위해서 1st PCR의 증폭 영역의 내부의 염기서열을 이용하여 RS-JH-F-ne(5'-AYGRCYTRARGRTRAMARTR-3')와 RS-JH-R-ne(5'-GYTYAYCRTYCYCYCRGMCY-3')의 nested PCR용 프라이머를 디자인하였다.
- ELISA 및 반선택배지를 이용한 검출민감도 조사. 인공오염 시킨 토마토와 고추 종자 추출액을 이용하여 반선택배지와 ELISA, PCR 검정을 수행하여 각 방법의 검출 민감도를 비교하였다.
- 0 이상을 positive contol로 하였다. Negative control은 키트에서 제공된 샘플을 이용하였으며, O.D. 405 nm의 파장에서 0.03 이하인 것을 negative control로 하였다. O.
- O.D. 405 nm의 파장에서 0.1 이상의 값을 가진 것을 positive(+) 반응으로 인정하고 0.1 미만의 값이 나온 것을 negative(−) 반응으로 인정하여 검출 한계농도를 조사하였다.
- PCR was carried out with primers, RS-JH-F, RS-JH-R, and 10ng of DNA of R. solanacearum race 3 KACC10699 (1) and its 10- fold serial dilution (2−6) (A).
- 종자추출액 1 µl을 1st PCR에 사용하였고, nested PCR에는 1st PCR 산물을 10배 희석 후 그 희석액 1 µl를 사용하였다. PCR 조건은 1st PCR, nested PCR, direct PCR에 모두 동일하였다; 94℃에서 10분간 전처리 한 후, 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초로 30 cycle을 수행한 뒤 72℃에서 5분간 처리하였다. 검출민감도를 조사하기 위해 DNA 농도를 10 ng/µl로 조정한 후 10배 희석법을 이용하여 DNA를 희석하고 각 희석액으로 PCR을 수행하였다.
- PCR 조건. R. solanacearum 검출을 위한 모든 PCR 실험은 Accupower HotStart PCR용 PreMix(BioNeer Co., Korea)와 GeneAmp PCR system2400(Perkin Elmer, USA)를 이용하여 수행하였다. 1st PCR에는 10 ng의 genomic DNA를 사용하였고, 증폭된 1st PCR 산물을 10배 희석 후 1 µl를 nested PCR에 사용하였다.
- R. solanacearum 반선택배지를 이용한 검출은 m-SMSA 배지(Casamino acid 1 g, Peptone 10 g, Glucose 5 g, Agar 16 g, Crystal violet 1% 0.5 ml, Polymyxin B sulfate 1% 10 ml, Bacitracin 1% 2.5 ml, Chloromycetin 1% 0.5 ml, Penicillin 0.1% 0.5 ml, Cycloheximide 1% 2.5 ml)에 준비한 종자 추출액을 100 µl씩 도말하여 28℃에서 3일간 배양하였다.
- 개발한 프라이머를 이용한 direct PCR의 검출 한계농도를 기존의 검출방법들과 비교하기 위해 인공오염 시킨 종자를 이용하여 조제한 종자 추출액 1 µl씩을 이용하여 1st PCR과 nested PCR을 수행하였다.
- 검출민감도를 조사하기 위해 DNA 농도를 10 ng/µl로 조정한 후 10배 희석법을 이용하여 DNA를 희석하고 각 희석액으로 PCR을 수행하였다.
- solanacearum race 1과 race 3을 한 번의 PCR로 동시에 검출할 수 있는 검출법을 개발하고자 하였다. 또한 검출의 민감도를 높이기 위해 nested-PCR 및 DNA의 추출없이 종자 추출물을 직접 PCR에 이용하는 방법을 개발하였다.
- 배양 3일 후 전형적인 모양의 콜로니를 positive(+) 반응으로, 아무 것도 자라지 않는 것을 negative(−) 반응으로 판별하여 검출한도를 조사하였다.
- solanacearum의 genomic DNA의 분리를 위해 실험에 사용한 균주들을 Nutrient Broth(NB)에서 28℃, 48시간 배양하였다. 배양한 현탁액을 ExgeneTM cell SV(GeneAll, Korea)을 이용하여 DNA를 추출하였고, 추출된 Genomic DNA의 정량은 QubitTM fluorometer(InvitrogenTM, USA)을 이용하였다. 추출한 DNA는 −20℃에서 보관하여 실험에 사용하였다.
- 본 연구에서 가장 흔히 사용하는 Ralstonia solanacearum의 검출법인 반선택배지(mSMSA)와 ELISA검출법을 새롭게 개발된 PCR 방법과 비교하였다. 반선택배지의 경우 R.
- PCR 프라이머의 특이성 및 민감도. 본 연구에서 개발된 Ralstonia solanacearum 검출용 프라이머의 특이성을 확인하기 위하여 서로 다른 국가에서 분리된 R. solanacearum race 1, 5개 균주와 race 3, 5개 균주, Pseudomonas 속 세균들 그리고 주요 식물 세균병원균의 DNA를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 결과 R.
- 본 연구에서는 16S ribosomal DNA의 염기서열을 이용하여 PCR 프라이머를 제작하였다. 16S rDNA의 경우 세균에서 고유의 기능을 잘 보존하고 있는 부분이기 때문에 다양한 세균을 특이적으로 검출하는 프라이머를 개발하는데 적합한 것으로 알려져 왔다(Jeng 등, 2001; Saglani 등, 2005).
- 종자 추출액을 이용한 PCR의 민감도 검정은 R. solanacearum을 각각의 농도 별로 인공오염 시킨 종자로부터 조제한 종자 추출액 1 µl씩을 PCR 반응에 사용하였다.
- 종자 추출액은 기존에 보고된 조 등(2010)의 방법을 사용하여 조제하였다. 토마토 및 고추종자를 오염시키기 위해서 R. solanacearum을 28℃에서 48시간 배양 후 세균 배양액을 OD600=0.1으로 맞춘 후10배 희석법으로 세균을 희석하여 현탁액을 준비하였다. 준비된 세균 현탁액들의 20 ml에 토마토 및 고추 종자 각각 1g씩 넣고 24시간 동안 28℃의 배양기에서 200 rpm 조건으로 진탕 배양 후 상온에 건조시켰다.
- 가지과 종자에서 병원균 검출. 토마토와 고추 종자에 R. solanacearum의 세균 현탁액을 10배 희석법으로 희석하여 농도별로 접종 후, 종자 추출액을 이용하여 각 방법의 검출 한계농도를 비교 조사하였다. 반선택배지인 mSMSA에서는 배양 72시간 후에 R.
- 2). 풋마름병 병원균 검출 PCR 민감도를 확인하기 위해서 DNA를 10 ng 기준으로 10배씩 희석하여 PCR을 수행하였다. PCR 결과 10 ng의 1000배 희석액인 0.
대상 데이터
- Genomic DNA 분리 및 프라이머 제작. R. solanacearum의 genomic DNA의 분리를 위해 실험에 사용한 균주들을 Nutrient Broth(NB)에서 28℃, 48시간 배양하였다. 배양한 현탁액을 ExgeneTM cell SV(GeneAll, Korea)을 이용하여 DNA를 추출하였고, 추출된 Genomic DNA의 정량은 QubitTM fluorometer(InvitrogenTM, USA)을 이용하였다.
- 서로 다른 나라에서 분리된 Ralstonia solanacearum race 1, 5개 균주와 race 3, 5개 균주, Pseudomonas 속의 균주들과 대표적인 식물 병원균들을 사용하였다. 본 연구에 사용한 균주는 한국농업미생물 자원센타(KACC)와 BCCM(Belgian Coordinated Collections of Micro-organisms)로부터 분양받았다.
- 본 연구에 사용된 세균 균주는 Table 1과 같다. 서로 다른 나라에서 분리된 Ralstonia solanacearum race 1, 5개 균주와 race 3, 5개 균주, Pseudomonas 속의 균주들과 대표적인 식물 병원균들을 사용하였다. 본 연구에 사용한 균주는 한국농업미생물 자원센타(KACC)와 BCCM(Belgian Coordinated Collections of Micro-organisms)로부터 분양받았다.
- solanacearum full kit(Kisan Biotech, Korea)와 키트가 제공하는 프로토콜을 이용하여 TAS-ELISA 방법으로 수행하였다. 실험에서 positive control은 키트에서 제공된 R. solanacerum의 현탁액을 이용하였고, O.D. 405 nm의 파장에서 3.0 이상을 positive contol로 하였다. Negative control은 키트에서 제공된 샘플을 이용하였으며, O.
데이터처리
- ELISA 및 반선택배지를 이용한 검출민감도 조사. 인공오염 시킨 토마토와 고추 종자 추출액을 이용하여 반선택배지와 ELISA, PCR 검정을 수행하여 각 방법의 검출 민감도를 비교하였다. R.
이론/모형
- 배양 3일 후 전형적인 모양의 콜로니를 positive(+) 반응으로, 아무 것도 자라지 않는 것을 negative(−) 반응으로 판별하여 검출한도를 조사하였다. ELISA에 의한 검출은 R. solanacearum full kit(Kisan Biotech, Korea)와 키트가 제공하는 프로토콜을 이용하여 TAS-ELISA 방법으로 수행하였다. 실험에서 positive control은 키트에서 제공된 R.
- 1st PCR에는 10 ng의 genomic DNA를 사용하였고, 증폭된 1st PCR 산물을 10배 희석 후 1 µl를 nested PCR에 사용하였다. 병원균의 DNA를 사용하지 않는 direct PCR법에는 인공오염 시킨 토마토 및 고추의 종자추출액을 PCR 실험에 사용하였다. 종자추출액 1 µl을 1st PCR에 사용하였고, nested PCR에는 1st PCR 산물을 10배 희석 후 그 희석액 1 µl를 사용하였다.
- 종자 추출액 조제. 종자 추출액은 기존에 보고된 조 등(2010)의 방법을 사용하여 조제하였다. 토마토 및 고추종자를 오염시키기 위해서 R.
성능/효과
- 1st PCR의 증폭산물을 10배 희석후 그 희석액 1 µl을 사용하여 Nested PCR을 수행한 결과 1st PCR의 보다 민감도가 100배 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 3).
- 풋마름병 병원균 검출 PCR 민감도를 확인하기 위해서 DNA를 10 ng 기준으로 10배씩 희석하여 PCR을 수행하였다. PCR 결과 10 ng의 1000배 희석액인 0.01 ng까지 특이적 DNA인 401 bp의 밴드가 증폭되는 것을 확인하였다(Fig. 3). 1st PCR의 증폭산물을 10배 희석후 그 희석액 1 µl을 사용하여 Nested PCR을 수행한 결과 1st PCR의 보다 민감도가 100배 증가하는 것을 확인하였다(Fig.
- solanacearum race 1, 5개 균주와 race 3, 5개 균주, Pseudomonas 속 세균들 그리고 주요 식물 세균병원균의 DNA를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 결과 R. solanacearum race 1과 race 3의 모든 균주의 DNA로 부터 약 401 bp 크기의 밴드가 증폭되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1). 그러나 R.
- TAS-ELISA을 이용하여 풋마름병 병원균 검출 결과 접종 농도 103 CFU/ml의 종자까지 positive(+) 반응을 확인하였고, 토마토와 고추 종자 모두에서 동일한 민감도를 보였다(Table 2).
- 낮은 농도로 감염되어 있는 종자전염 병원세균의 검출에 적합하도록 PCR 검출의 민감도를 높이기 위해서 1st PCR 프라이머 RSJH-F와 RS-JH-R의 내부 영역에서 디자인한 nested PCR용 프라이머인 RS-JH-F-ne와 RS-JH-R-ne을 이용하여 PCR을 수행하였을 때, 모든 R. solanacearum 균주들에서 약 131 bp 크기의 DNA가 증폭되였다(data not shown).
- 인공적으로 병원균을 접종한 가지과 종자를 이용하여 병원균 검출 민감도를 비교하였을 때, 본 연구에서 개발한 nested PCR 방법이 ELISA나 반선택배지보다 100배 높은 민감도를 보여주었다. 따라서, 본 연구에서 개발한 PCR 방법들은 가지과 종자로부터 Ralstonia solanacearum를 검출하는 매우 유용한 방법으로 생각된다.
- 반선택배지인 mSMSA에서는 배양 72시간 후에 R. solanacearum의 전형적인 콜로니가 나타나는 것을 확인하였고, 배양 4일 후부터 병원균 접종농도 103 CFU/ml까지 검출이 가능하였다(Table 2).
- solanacearum 균주들에서 약 131 bp 크기의 DNA가 증폭되였다(data not shown). 본 연구에서 개발된 프라이머가 가지과 종자 DNA를 주형으로 DNA를 증폭시킬 가능성을 확인하기 위해 토마토 4품종과 고추 4품종, 총 8품종의 가지과 종자 DNA를 추출하여 PCR을 수행한 결과, 실험에 사용한 모든 가지과 종자 DNA로부터 어떤 DNA도 증폭되지 않는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2). 풋마름병 병원균 검출 PCR 민감도를 확인하기 위해서 DNA를 10 ng 기준으로 10배씩 희석하여 PCR을 수행하였다.
- 16S rDNA의 경우 세균에서 고유의 기능을 잘 보존하고 있는 부분이기 때문에 다양한 세균을 특이적으로 검출하는 프라이머를 개발하는데 적합한 것으로 알려져 왔다(Jeng 등, 2001; Saglani 등, 2005). 본 연구에서 개발한 PCR과 nested PCR용 프라이머는 한 번의 PCR로 R. solanacearum race 1과 race 3 균주을 특이적으로 검출이 가능하며, 가지과 종자 DNA와는 반응하지 않는다. 또한 본 연구에서는 DNA의 추출없이 종자 추출액을 직접 PCR에 이용하는 방법을 제시하였다.
- 본 연구에서 새롭게 개발된 프라이머를 사용하여 1st PCR을 수행한 결과 다른 두 가지의 검출법과 동일한 검출 농도인 103 CFU/ml까지 검출이 가능하였다.
- 1st PCR의 증폭산물을 이용하여 nested PCR을 수행한 결과 접종농도 10 CFU/ml까지 검출이 가능하였다. 이결과는 nested PCR의 검출 민감도가 선택배지, TAS-ELISA 그리고 일반 PCR법보다 100배 높다는 것을 의미한다.
- 이들 프라이머들은 토마토, 고추를 포함한 가지과 종자 추출액으로부터 어떤 비특이적 DNA도 증폭하지 않았다. 인공적으로 병원균을 접종한 가지과 종자를 이용하여 병원균 검출 민감도를 비교하였을 때, 본 연구에서 개발한 nested PCR 방법이 ELISA나 반선택배지보다 100배 높은 민감도를 보여주었다. 따라서, 본 연구에서 개발한 PCR 방법들은 가지과 종자로부터 Ralstonia solanacearum를 검출하는 매우 유용한 방법으로 생각된다.
- 본 연구에서는 가지과 종자로부터 Ralstonia solanacearum 검출할 수 있는 PCR 방법을 개발하였다. 프라이머 RSJH-F와 RS-JH-R는 오직 Ralstonia solanacearum race 1, 3으로부터 401 bp 크기의 DNA를 증폭하였다. 1차 PCR 증폭산물의 내부에서 디자인 된 nested PCR 프라이머인 RS-JH-F-ne and RS-JH-R-ne는 오직 Ralstonia solanacearum로부터 131 bp 크기의 DNA를 증폭하였다.
후속연구
- 종자 추출액을 직접 PCR에 이용하는 방법은, DNA를 사용하는 PCR 방법들(Kang 등, 2007; Poussier 등, 2002; Schonfeld 등, 2003)에 비해 시간을 절약할 수 있고 DNA 오염에 의해 나타날 수 있는 거짓양성반응을 방지할 수 있는 장점을 가졌다. 따라서 본 연구에서 개발된 PCR 방법은 가지과 종자로부터 신속하고 정확하게 R. solanacearum의 검출에 이용될 수 있을 것으로 생각된다.
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