This study was conducted to establish a freezing method of miniature pig spermatozoa. The semen 더aculated from PWG M-type miniature pig was collected by gloved-hand method. The semen was diluted with same volume extender (m-Modena B). The frozen solution used frozen solution of four different (LEY, ...
This study was conducted to establish a freezing method of miniature pig spermatozoa. The semen 더aculated from PWG M-type miniature pig was collected by gloved-hand method. The semen was diluted with same volume extender (m-Modena B). The frozen solution used frozen solution of four different (LEY, TCG, BF-5 and m-Modena+egg yolk) for find optimal frozen solution in miniature pig sperm. The diluted semen for frozen rate assay was added to LEY solution (solution I: 11% lactose+egg yolk; solution II: solution I+glycerol+OEP), and frozen depending on freezing rate by the three different freezing methods (A: until $5^{\circ}C$ for 1 hrs, holding at $-102^{\circ}C$ for 10 min; B: until $5^{\circ}C$ for 2 hrs, holding at $-102^{\circ}C$ for 10 min; C: until $5^{\circ}C$ for 3 hrs, holding at -80 and $-102^{\circ}C$ for 10 min). Semen cooled until $5^{\circ}C$ was added with glycerol 1, 3 and 5%, and take a equilibrium time for 0, 10 and 30min. Frozen-thawed sperm were evaluated for viability, acrosomal status and morphological abnormality. The results of frozen-thawed sperm ability by frozen solution, viability was higher in LEY solution compared to other three different frozen solution. AR pattern of LEY solution were lower than other three different frozen solution. The results of freezing rate, viability was higher in B method compared to other methods (p<0.05). Acrosomal statute was intacted in A and B methods than C method. The experiment for glycerol condition was showed that sperm viability was higher in extender with 1% and 3% glycerol and equilibrium time of 0 min. The acrosome damage was lower in extender with 1% glycerol and equilibrium time of 10 min than other conditions. In conclusion, the optimal conditions for cryopreservation of miniature pig spermatozoa obtained in LEY frozen solution, cooling rate of 1~2 hrs, 1~3% glycerol concentrations and glycerol equilibrium time of 0~10 min.
This study was conducted to establish a freezing method of miniature pig spermatozoa. The semen 더aculated from PWG M-type miniature pig was collected by gloved-hand method. The semen was diluted with same volume extender (m-Modena B). The frozen solution used frozen solution of four different (LEY, TCG, BF-5 and m-Modena+egg yolk) for find optimal frozen solution in miniature pig sperm. The diluted semen for frozen rate assay was added to LEY solution (solution I: 11% lactose+egg yolk; solution II: solution I+glycerol+OEP), and frozen depending on freezing rate by the three different freezing methods (A: until $5^{\circ}C$ for 1 hrs, holding at $-102^{\circ}C$ for 10 min; B: until $5^{\circ}C$ for 2 hrs, holding at $-102^{\circ}C$ for 10 min; C: until $5^{\circ}C$ for 3 hrs, holding at -80 and $-102^{\circ}C$ for 10 min). Semen cooled until $5^{\circ}C$ was added with glycerol 1, 3 and 5%, and take a equilibrium time for 0, 10 and 30min. Frozen-thawed sperm were evaluated for viability, acrosomal status and morphological abnormality. The results of frozen-thawed sperm ability by frozen solution, viability was higher in LEY solution compared to other three different frozen solution. AR pattern of LEY solution were lower than other three different frozen solution. The results of freezing rate, viability was higher in B method compared to other methods (p<0.05). Acrosomal statute was intacted in A and B methods than C method. The experiment for glycerol condition was showed that sperm viability was higher in extender with 1% and 3% glycerol and equilibrium time of 0 min. The acrosome damage was lower in extender with 1% glycerol and equilibrium time of 10 min than other conditions. In conclusion, the optimal conditions for cryopreservation of miniature pig spermatozoa obtained in LEY frozen solution, cooling rate of 1~2 hrs, 1~3% glycerol concentrations and glycerol equilibrium time of 0~10 min.
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문제 정의
그러므로 본 연구는 미니 돼지 정액의 동결보존율 향상을 위해 동결액, 냉각 속도 그리고 glycerol 농도와 평형 시간 등을 조절하여 미니 돼지 정액의 최적 동결조건을 확립하고자 하였다.
본 연구는 미니 돼지 동결 체계를 확립하기 위해 동결보존에 영향을 미치는 동결액, 동결 속도 그리고 동해보호제의 농도와 평형 시간의 조건을 확립하고자 하였다. 그중 정액 동결보존에 있어서 동결액의 조성은 중요한 인자로 작용하며, 일반적으로 정자 동결보존액의 구성은 비침투성 동해방지제 (milk와 egg yolk), 침투성 동해방지제 (glycerol, ethylene glycol, dimethyl sulfoxide), buffer (Tris 나 TES), 당 (glucose, lactose, raffinose, saccharose, trehalose), 염 (sodium citrate, citric add) 그리고 항생저] 등으로 구성된다.
제안 방법
1% BSA와 5 μl의 SYBR-14 working stck (2 μl SYBR-14+198 ill DMSO)을 첨가하여 incubater (37 ℃) 상에서 10분간 정치시켰다. 10분 후 5 μl의 PI (propidium iodide)를 첨가하여 incubater(37℃)상에서 10 분간정치 후 형광현미경(400배) 하에서 관찰하였다.
첨가하였다. 1차 동결액 첨가 후 세포동결기로 2시간 동안 25℃에서 5 ℃까지 냉각시킨 후 2차 동결액을 1차 동결액량의 1/2을 첨가하여 0.5 ml, 5 ml straw를 제작하였다. 제작된 straw는 제작된 styrofoam box에 액체질소를 6 cm 정도를 담고, 표면으로부터 10 cm 위에서 10분간 정치 후 액체질소에 침적하여 액체질소통에 보관하였다.
A: 상온에서 정액을 희석액과 정장물질을 원심분리를 이용하여 제거한 후 1차 동결액과 혼합 후 얼음이 담긴 스티로폼 박스에 보온제 등을 감아서 넣고 -20 ℃ 냉장고에서 1시간 동안 5℃로 냉각 후 2차 동결액을 첨가하여, 10분간 -20℃에서 예비동결 후 액체질소에 침적하여 냉동보존하였다.
제작된 CTC sample 중 10 pl 를 slide glass에 분주하여 5 μl의 DABCO와 혼합하여, 형광현민경 (400배) 하에서 정자 두부를 관찰하였다. CTC 와 Hoechst 33258에 의해 염색된 정자의 모습을 형광현미경 (400배) 하에서 관츨된 정자의 모습으로, 염색된 정자 중 두부 전체가 황색 형광으로 염색된 것은 수정능 획득 및 첨체 반응이 일어나지 않은 정자(F), 첨체 부위만 염색된 것은 수정능 획득이 일어난 정자(B), 두부가 거의 되지 않은 것은 첨체 반응이 일어난 정자(AR)로 판정하였다.
정자 부유액 100 μl를 side glass 위에 옮겨 도말하여, 실온에서 완전히 건조시켰다. 건조된 side glass 위에 Rose-Bengal 염색액 500 μl를 떨어뜨려 염색한 후 현미경(400배) 하에서 기형정자를 관잘하였다. Fig.
미니 돼지 정액 동결을 위한 LEY 동결액에 glycerol을 각각 1, 3 및 5%씩 첨가하여 동결에 이용하였으며, 각각의 농도에 따른 평형 시간을 0, 10 및 30분간 실시하여 동결 후 융해하여 성상 검사를 통하여 평가하였다.
미니 돼지 정액 동결의 적정 동결 속도를 확립하기 위해 아래와 같이 조건으로 동결 속도를 달리하여 동결 후 융해하여 일반성상 검사를 통하여 평가하였다.
미니 돼지의 최적의 동결조건을 찾기 위해 미니 돼지 정 액 동결에 적합한 동결액으로 Lactose Egg Yolk (305.3 mM lactose+20% egg yolk, LEY), Tris citric acid glucose egg yolk (158.5 mM Tris+53.3 mM citric add+35.5 mM glucose+20% egg yolk, TCG), Beltsville F5 (52.4 mM TES+16.5 mM Tris+177.6 mM glucose+20% egg yolk, BF-5) 및 m-Modena B+20% egg yolk 4가지 1차 동결액을 준비하고 각각 2차 동결액은 1차 동결액에 1.5% Orvus Es Paste (OEP ; Nova Chem, U.S.A)와 9% glycerol을 첨가하여 냉장보관하여 실험에 사용하였다. 동결 시 OEP 와 glycerol의 최종농도는 각각 0.
보완하여 실시하였다. Live sperm과 dead sperm 사이의 DNA의 차이를 이용한 형광염색 방법으로 live sperm은녹색으로 염색되며, dead sperme 붉은색으로 염색되게 된다.
Deborah 등(2003)의 방법을 수정 . 보완하여 첨체율을 검사하였다. 정자부유액 100 μl에 2 μl의 Hoechst 33258을 첨가하여 실온에서 3분간 정치 후 1 ml의 3% polyvinylpyrrolidone (PVP, ICN Biomedicals)를 첨가시켜, 실온에서 원심분리(400xg, 5분) 하여 상층액을 제거한 후 100 μl 의 PBS를 부유하였다 부유된 정액에 동량의 CTC solution) (750 uM chlortetracycline(Sigma)+5 mM cysteine+-130 mM NaQ+20 mM Tris(pH 7.
생존율 검사는 Maxwell과 Johnson(1997)의 Live/Dead™ sperm viability kit (Molecular Probes) 를 이용한 방법을 수정. 보완하여 실시하였다.
06 mM potassium chloride)와 혼합 후 원심분리(400xg, 37℃, 10 분)하여 상층액을 제거하여 다시 BTS를 부유하였다. 융해된 정액은 일반성상 검사(생존율, 기형율 및 첨체율)를 실시하였다.
정액 동결은 운반된 희석정액을 상온(25℃)에서 1시간 정도 정치시킨 후 원심분리 (400x& 15℃, 10분)한 후, 각각의 1차 동결액을 정자농도 IxlCTo] 되도록 첨가하였다. 1차 동결액 첨가 후 세포동결기로 2시간 동안 25℃에서 5 ℃까지 냉각시킨 후 2차 동결액을 1차 동결액량의 1/2을 첨가하여 0.
4)} 를 첨가하여 정자를 고정시켰다. 제작된 CTC sample 중 10 pl 를 slide glass에 분주하여 5 μl의 DABCO와 혼합하여, 형광현민경 (400배) 하에서 정자 두부를 관찰하였다. CTC 와 Hoechst 33258에 의해 염색된 정자의 모습을 형광현미경 (400배) 하에서 관츨된 정자의 모습으로, 염색된 정자 중 두부 전체가 황색 형광으로 염색된 것은 수정능 획득 및 첨체 반응이 일어나지 않은 정자(F), 첨체 부위만 염색된 것은 수정능 획득이 일어난 정자(B), 두부가 거의 되지 않은 것은 첨체 반응이 일어난 정자(AR)로 판정하였다.
대상 데이터
5%와 3%였다. 동결액 조성 중 OEP를 제외한 모든 시약은 Sigma 제품을 이용하였다.
본 연구에 이용된 정액은 강원대학교 목장에서 사육중인 PWG miniature pig M type(60kg)에서 음경 수압법으로 정액을 채취하여 이용하였다. 채취된 정액은 m-Mo-dena B 희석제(Lee 등, 2005)로 1차 희석하여 실험실로 1 시간 이내 운반하여 연구에 이용하였다.
정액을 채취하여 이용하였다. 채취된 정액은 m-Mo-dena B 희석제(Lee 등, 2005)로 1차 희석하여 실험실로 1 시간 이내 운반하여 연구에 이용하였다.
데이터처리
본 실험에서 얻어진 결과는 SAS@9.2 package/PC를 이용하여 Duncan의 Multiple Range Test에 의하여 유의차 (p<0.05)를 검정하였다.
성능/효과
Table 3에서는 이ycerol 농도와 평형 시간에 따른 동결 융해된 미니 돼지 정자의 생존율을 나타냈다. 1, 3%의 glycerol 농도에서 0이 가장 높은 생존율을 보였으며, 두 농도 간 생존율에서 유의적 차이8<0.05)를 보이지 않고 있다. 반면, 5%의 경우 1와 3%의 생존율에 비해 유의적으로 낮게 나타났다.
차이를 나타낸다. Glycerol 농도 1%에서 10분간 평형 시킨 sample에서 첨체 반응이 일어나 수정 능력을 잃은 AR pattern의 비율이 유의적으로(p<0.05) 가장 낮게 나타났다. Glycerol 농도 1과 5%에서 30분간 평형 시간을 가졌을 때 AR pattern이 40% 이상으로 가장 높게 나타났다.
05) 가장 낮게 나타났다. Glycerol 농도 1과 5%에서 30분간 평형 시간을 가졌을 때 AR pattern이 40% 이상으로 가장 높게 나타났다.
05) 첨체 손상이 가장 크게 나타났다. 기형율은 Tris를 기본으로한 TCG 동결액으로 동결하였을 때 유의적으로 (p<0.05) 가장 높게 나타났다.
05) 가장 높았고, 손상된 첨체를 나타내는 AR pattern 율이 가장 낮게 나타났다. 미니 돼지 동결보존에 있어서 가장 낮은 생존율을 나타낸 동결액은 BF-5였으며, 첨체 손상은 Modena 희석제에 egg yolk을 섞어서 제조한 동결액으로 동결하였을 때 유의적으로 (p<0.05) 첨체 손상이 가장 크게 나타났다. 기형율은 Tris를 기본으로한 TCG 동결액으로 동결하였을 때 유의적으로 (p<0.
미니 돼지 정액의 동결보존 조건을 확립하기 위해 Table 1과 같이 4가지 동결액을 이용하여 동결 후 일반성상 검사로 생존율과 기형율 그리고 CTC 염색을 통한 첨체 상태를 분석한 결과, 4가지 동결액 중 LEY 동결액으로 동결하였을 때 생존율이 유의적으로 (p<0.05) 가장 높았고, 손상된 첨체를 나타내는 AR pattern 율이 가장 낮게 나타났다. 미니 돼지 동결보존에 있어서 가장 낮은 생존율을 나타낸 동결액은 BF-5였으며, 첨체 손상은 Modena 희석제에 egg yolk을 섞어서 제조한 동결액으로 동결하였을 때 유의적으로 (p<0.
(Purdy, 2006). 본 연구에서는 당과 난황 이외에 아무것도 첨가하지 않은 LEY 동결액, Tris와 glucose를 기본으로 하는 Tris buffer인 TCG 동결액, TES와 glucose를 기본으로 하는 BF-5 동결액 그리고 돼지 희석제인 Modena에 난황을 섞은 동결액으로 정액을 동결 융해한 결과, TES를 기본으로 하는 BF-5보다 Tris buffer인 TCG가 생존율이 유의적 (p<0.05) 으로 높게 나타났으며, 특히 다당류인 lasctose를 기본으로 하는 LEY 동결액으로 동결을 실시한 결과, 생존율이 68.QN.
그 이유는 빙점이 형성되기 전에는 생존율에 큰 피해가 없지만 비정형성 시 느린 동결 속도는 오히려 정자의 원형질막에 표해를 주기 때문이다. 본 연구에서도 Table 2에서와 같이 동결 속도를 -80℃에서 20분 정치하고, -120℃에서 10분간 정치한 가장 느린 C방법으로 동결을 했을 시 가장 낮은 생존율을 나타냈으며, 동결은 -120 ℃에서 10분간 정치하는 것은 똑같고 냉각 속도만 1시간 정도의 차이를 보이는 A와 B방법의 경우 생존율에서는 유의적인 차이를 보였으나, 첨체손상면에서는 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 이와 같은 결과는 김 등 (2006) 이 실험한 간편동결방법의 결과와 비슷한 경향을 나타냈다.
본 연구의 결과를 종학해 보면 미니돼지의 동결액은 다당류인 Lastose를 기본으로 하는 LEY 동결액이 최적이며, 동결 속도는 5℃까지 2시간에 거쳐 온도를 내렸을 때 가장 높은 생존율을 나타냈다. 최적의 glycerol 농도는 3%로 평형 시간이 없이 바로 동결하는 게 가장 좋다.
결과는 Table 2에 나타냈다. 생존율에서는 A와 B 방법이 60% 이상의 생존율을 보였으나, 유의적으로(p<0.05) B방법에 의해 동결된 정자의 생존율이 높게 나타났으며, 첨체상태를 나타낸 CTC pattern에서 A는 F pattern이 B 에 비해 유의적으로080.05) 높았으나, 상대적으로 B patt-erne B가 유의적으로 높았으며, AR에서 두 방법간의 유의적 차이는 없었다. 한편, 기형율에서는 A방법이 유의적으로 가장 낮은 비율을 나타냈다 0<0.
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