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문제 정의
- 그러나 이ycerol은 상온에서 세포내에 독성을 나타내므로 저온에서 평형을 유지해야 하는 단점을 가지고 있으나, 보편적으로 glycerol보다 간편하게 이용되는 물질은 아직 명확하지 않다. 이에 본 연구에서는 소 동결 정액 제조 시 가장 보편적으로 사용되고 있는 Tris-Egg yolk extender와 침투성 동결 보호제 인 glycerol을 제주 흑우의 동결 정액을 생산을 수행하여 glycerol 과 동결 속도가 제주 흑우 정자의 생존율 및 첨체 양상에 미치는 영향을 조사하고자 실시하였다.
- 희소 한우로 분류된 제주 흑우 동결 정액 생산과 동결 방법 확립을 통하여 제주 흑우 정액의 동결 보존과 이용성 증대 및 유전 자원의 보존성을 증대시키기 위하여 본 연구를 실시하였다. 제주 흑우의 동결 정액 제조 시 7%의 이ycerol 첨가에서 72.
제안 방법
- 정액 채취는 인공질(Model 66000-D, Nasco, FHK, 일본)을 사용하여 채정하였다. 정액 채취를 위해서 암컷을 안전 정액 채취실 보정틀에 고정시킨 후, 제주 흑우 수컷을 2~3회 암컷의 주위를 맴돌게 하여 흥분을 유도하였다. 승가가 이루어지면 수컷의 pgis를 인공질에 삽입하여 정액채취를 하였다.
- 채취된 정액은 즉시 실험실로 운반하고, 실험실의 클린 벤치 내에서 원정액을Tris-egg yolk extender를 이용하여 5 단계를 거쳐 점차적으로 희석하며 총 2시간 동안 냉각시켰다. 마지막 희석 후, glycerol(3, 5, 7%)이 첨가된 희석액을 첨가하여 2시간 동안 평형을 유도하였으며, 평형이 된 정자는 5xl026 * * 로5 조정한 후에 0.5 ml의 straw에 충전 봉합하였다. 동결 속도가 정자에 미치는 영향을 관찰하고자 7%의 glycerol을 첨가한 희석액을 사용하여 액체질소의 표면에서 각각 3 cm 높이에서 5분, 5 cm 높이에서 10분, 8 cm 높이에서 10분간 노출시켜 예비 동결을 실시한 후에 액체질소에 침지하여 동결을 완료하였다.
- 5 ml의 straw에 충전 봉합하였다. 동결 속도가 정자에 미치는 영향을 관찰하고자 7%의 glycerol을 첨가한 희석액을 사용하여 액체질소의 표면에서 각각 3 cm 높이에서 5분, 5 cm 높이에서 10분, 8 cm 높이에서 10분간 노출시켜 예비 동결을 실시한 후에 액체질소에 침지하여 동결을 완료하였다. 동결된 정액은일정시간 동안 LN2 tank에서 보관한 후에 필요시 융해하여 사용하였다.
- 동결된 정액은일정시간 동안 LN2 tank에서 보관한 후에 필요시 융해하여 사용하였다. 동결 정액의 융해는 공기 중에서 약 10초간 융해한후 37℃ 온수에서 20초간 침지시켜 융해한 후 정자의 생존율및 첨체 양상을 조사하였다.
- 정액의 활력과 평가는 MicroLux 현미경(X 70, Olympus, Ja- pan)하에서 정자의 활력을 평가하였으며, 혈구 계산판에 5/21 의 정액을 놓고 커버 글라스를 덮은 후 100배율에서 정자의 운동성을 평가하였다. 혈구 계산판의 격자 2군데를 반복적으로 관찰하여, 관찰되는 거의 모든 정자들이 소용돌이 치며 활발하게 움직이는 것을 90% 이상으로, 생존 정자들이 격자 별로 100개 가량을 관찰하여 활발하게 움직이는 정자들이 80% 이상일 때 80%로, 70% 이상일 때 70%로 판단하고, 움직이는 정도가 전진 운동 또는 느리게 전진 운동하는 수준일 때 50%, 느리게 전진 운동하거나 진자 운동 혹은 미동하는 수준일 때 20%로 평가하였다.
- 0.9% NaCl 용액에 0.5% Eosin Y를 용해한 후 10 #의정액을 슬라이드글라스 위에 올린 다음 동량의 염색액을 섞어도말한 다음 커버 글라스를 덮고 MicroLux 현미경(x 70, Olym pus, Japan)하에서 관찰하였다. 100배율에서 염색 상태를 관찰하여 표본 1개당 200개의 정자를 카운트하여 붉게 염색된 죽은 정자의 비율을 계산하였으며, 개체 당 2개의 표본을 만들어 총 400개의 정자를 카운트하여 생존율을 평가하였다.
- 5% Eosin Y를 용해한 후 10 #의정액을 슬라이드글라스 위에 올린 다음 동량의 염색액을 섞어도말한 다음 커버 글라스를 덮고 MicroLux 현미경(x 70, Olym pus, Japan)하에서 관찰하였다. 100배율에서 염색 상태를 관찰하여 표본 1개당 200개의 정자를 카운트하여 붉게 염색된 죽은 정자의 비율을 계산하였으며, 개체 당 2개의 표본을 만들어 총 400개의 정자를 카운트하여 생존율을 평가하였다.
- 정자막 온전성을 즉정하기 위하여 Jeyendran 등(1984)의 방법을 변형하여 저삼투압 용액을 이용한 정자미부의 팽창 형태를분석하였다(Hypo-Osmetic Swelling Test). 37℃의 저장액(150 mOsm/kg, 0.
- 변형하여 저삼투압 용액을 이용한 정자미부의 팽창 형태를분석하였다(Hypo-Osmetic Swelling Test). 37℃의 저장액(150 mOsm/kg, 0.45% NaCl 용액) 1 ml에 정자 샘플 100 /"를 혼합하여 37℃에서 5분간 정치시킨 후 슬라이드 글라스에 도말하여 개체 당 2개의 표본을 만들어 표본 당 200개의 정자를카운트하여 정자의 온전성을 평가하였다.
- 첨체막의 변화 양상을 즉정하기 위하여 Chlortetracycline (CTC) 염색법을 사용하였으며, 이 방법으로 정자의 수정능 획득과 첨체막 변화 양상을 조사하였다. 정액을 400 xg에서 2분간 원심분리하여 세척 한 다음 500㎕의 PBS를 첨 가하여 재부유시 킨 다음 500 의 CTC 용액(750μM CTC, 130 mM Nacl, 5 mM cysteine in 20 mM Tris buffer; pH 7.
대상 데이터
- 정액 채취로 사용된 흑우는 3세 이상의 수컷 4두를 선발하여 별도 공간에서 자유 급식하여 사육하였으며, 월 4회 정액을 채취하였다. 정액 채취는 인공질(Model 66000-D, Nasco, FHK, 일본)을 사용하여 채정하였다.
- 별도 공간에서 자유 급식하여 사육하였으며, 월 4회 정액을 채취하였다. 정액 채취는 인공질(Model 66000-D, Nasco, FHK, 일본)을 사용하여 채정하였다. 정액 채취를 위해서 암컷을 안전 정액 채취실 보정틀에 고정시킨 후, 제주 흑우 수컷을 2~3회 암컷의 주위를 맴돌게 하여 흥분을 유도하였다.
- 본 실험에 이용된 보존액의 조성은 Table 1과 같으며, 동결보호제로 3, 5, 7%의 glycerol을 사용하였다. 채취된 정액은 즉시 실험실로 운반하고, 실험실의 클린 벤치 내에서 원정액을Tris-egg yolk extender를 이용하여 5 단계를 거쳐 점차적으로 희석하며 총 2시간 동안 냉각시켰다.
데이터처리
- Change of sperm capacitation status according to diffe rent glycerol concentration. A, B F pattern values for 3, 5, 7% glycerol concentration with different superscripts were sig nificantly different by ANOVA (p<0.05). a,b B pattern va lues for 3, 5, 7% glycerol concentration with different superscripts were significantly different by ANOVA (p<0.
- 통계 분석은 통계 분석 프로그램(SPSS Version 18.0)을 이용하였으며, glycerol 농도에 따른 동결 융해 후 정자의 활력및 생존율과 예비 동결 조건에 대한 결과는 ANOVA를 이용하여 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- 정자의 생존성은 Eosin Y 염색법을 이용하여 생존율을 평가하였다. 0.
- 염색된 정액은 빛이 차단된 4℃에서 보관하였으며, 염색 후 24시간 이내에 판독하였다. 정자의 첨체 막 변화 양상의 판독은 Fraser 등(1995)의 분류를 따랐다(Table 2).
- 또한 Oh 등(2010)은 돼지 정자의 수정능 예측을 위해 CTC 방법의 사용은 수정 능력이 불량한 개체를 예즉하는데 있어 유용하다고 보고한 바 있다. CTC를 이용한 정자의 수정능 획득을 측정하기 위해서 Fraser 등(1995)이 제시한대로 수정능 획득이 일어나지 않은 F pattern과 수정능 획득이 일어난 B pattern 그리고 첨체 빈응이 일어난 AR pattern으로 분류한다. 수정 전 정자는 F pattern과 B pattern의 비율이 높아야 하며, 인위적인수정능 획득을 유도하지 않은 경우 F pattern의 비율이 높아야한다(Fraser, 2004).
성능/효과
- 평가하였다. 혈구 계산판의 격자 2군데를 반복적으로 관찰하여, 관찰되는 거의 모든 정자들이 소용돌이 치며 활발하게 움직이는 것을 90% 이상으로, 생존 정자들이 격자 별로 100개 가량을 관찰하여 활발하게 움직이는 정자들이 80% 이상일 때 80%로, 70% 이상일 때 70%로 판단하고, 움직이는 정도가 전진 운동 또는 느리게 전진 운동하는 수준일 때 50%, 느리게 전진 운동하거나 진자 운동 혹은 미동하는 수준일 때 20%로 평가하였다.
- 같다. 제주 흑우 정액의 동결을 위해 사용된 glycerol의 농도에 따른 정자의 활력 및 생존성의 변화에 대한 결과로 7%의 glycerol을 사용하여 제주 흑우 정액을 동결하였을 때 동결 보존 후의 정자의 활력은 72.5±0.1%로 유의적으로 높은 성적을나타냈으나@<0.05), 5% 첨가와는 유의적 차이를 나타내지 않았다. 동결 융해 후 생존률에 있어서 활력과 마찬가지로 7%의 glycerol을 사용하였을 때 43.
- 05). 그러나 첨체 반응을 나타내는 AR pattern에 있어서는 첨가된 glycerol의 농도가 증가함에 따라 AR pattern의 비율이 감소하는 경향을 보였으나 유의적인 차이는 나타나지 않았다.
- 온전성 변화에 대한 결과이다. 동결 융해 후 정자의 활력, 생존율 그리고 정자막 온전성 모두 5 cm 높이에서 10분간예비 동결 실험구에서 다소 높은 결과를 나타냈지만 유의적 차이는 볼 수 없었다.
- 2는 예비 동결 조건이 동결 융해 후 정자의 첨체 양상의 변화에 미치는 영향에 대한 결과이다. 동결 융해 후 정자의 첨체막 양상을 살펴보고자 CTC staining을 시행한 결과 F pattern 은 glycerol의 농도에 따라 그 비율이 증가하는 양상을 나타냈으며, B pattern의 비율은 5 cm 높이에서 10분 예비 동결한 실험구에서 다소 높은 비율을 나타냈으며, 8 cm 높이에서 10분간 예비 동결한 실험구에서는 3 cm 높이에서 5분간 예비 동결한실험구보다 다소 높은 비율을 나타냈지만 3개의 실험구 모두 유의적 차이는 없었다. 그러나 AR pattern에 있어서는 3 cm 높이에서 5분간 예비 동결을 하였을 때 유의적으로 AR pattern의비율이 증가함을 알 수 있었다(?<0.
- 동결 융해 후 정자의 첨체막 양상을 살펴보고자 CTC staining을 시행한 결과 F pattern 은 glycerol의 농도에 따라 그 비율이 증가하는 양상을 나타냈으며, B pattern의 비율은 5 cm 높이에서 10분 예비 동결한 실험구에서 다소 높은 비율을 나타냈으며, 8 cm 높이에서 10분간 예비 동결한 실험구에서는 3 cm 높이에서 5분간 예비 동결한실험구보다 다소 높은 비율을 나타냈지만 3개의 실험구 모두 유의적 차이는 없었다. 그러나 AR pattern에 있어서는 3 cm 높이에서 5분간 예비 동결을 하였을 때 유의적으로 AR pattern의비율이 증가함을 알 수 있었다(?<0.05).
- 특히 사람에서는 수정 능력 혹은 가임능력을 평가하기 위하여 정자막의 온전성을 검사하는저장액에서 정자 미부의 팽창 패턴을 평가하여 그 수정 능력을 예측하고 있다<최 등, 1993). 본 연구의 결과, 동결 보호제의 농도는 정자의 동결에 있어 그 생존성과 활력 그리고 수정능력에 중요한 요인으로서 기 여하고 있음을 알 수 있다. 그러나적절한 동결 보호제의 농도가 첨가되어 동결 정액을 제조할경우, 예비 동결 속도와 높이는 정자의 활력, 생존성 그리고수정 능력에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
- 본 연구의 결과, 동결 보호제의 농도는 정자의 동결에 있어 그 생존성과 활력 그리고 수정능력에 중요한 요인으로서 기 여하고 있음을 알 수 있다. 그러나적절한 동결 보호제의 농도가 첨가되어 동결 정액을 제조할경우, 예비 동결 속도와 높이는 정자의 활력, 생존성 그리고수정 능력에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 이러한결과는 개(이 등, 2003; 지 등, 2007)와 말(최 등, 2010)의 동결정액 제조시 예비 동결의 높이가 정자의 활력과 생존율에 영향을 끼치며, AndroMed(Minitub, Germany)를 이용한 제주 흑우 동결 정액 제조시 예비 동결의 높이와 시간이 생존율에 영향을 끼친다는 보고(조 등, 2009)와는 다른 결과를 나타내었으나, 이 역시 사용되는 희석제 및 동결법의 차이에 의한 것으로 사료된다.
- 수정능이 획득된 정자는 난자를 둘러싸고 있는 투명 대에 의해 수정되기 전에 첨체 반응이 일어나지만(Yanagimach, 1994), 난자의 투명대와 결합하기 전에 첨체 반응이 일어난 정자는 난자의 투명대와의 결합에 필요한 중요한 요소를 잃어버리기 때문에 정상적인 수정에 참여할 수 없다(Adeoya-Osi- guwa와 Fraser, 2004). 본 연구에서 7% glycerol를 사용하였을 때 유의 적으로 높은 F pattern을 나타냈으나, B pattern은 가장 낮은 비율을 나타내 었다. 이는 Suzuki 등(2003)이 보고한 B pattern의 비율이 정액의 질을 판단하는 척도로 사용된다고 보고한바와 상이한 결과를 나타내고 있으나, AR pattern을 살펴보면또한 유의적으로 낮은 비율을 나타내고 있다.
- 정자에 있어cold shock는 tyrosine phosphorylation에 변화를 주어 정자가 사실상 수정능이 획득되지 않았음에도 수정능 획득이 이루어진 것처럼 보이는 capacitation-like state를 유발한다(Bravo 등, 2005). 본 실험의 결과, 3%와 5% 농도의 glycerol 실험구에서 높은 B pattern의 비율은 cold shock에 의해 발생된 capacitation-likedstate로 사료된다. 또한 예비 동결의 높이와 시간에 따른 결과에서 3 cm, 5분간 예비 동결한 경우 F와 B pattern에는 큰 차이가 없었으나, AR pattern이 증가함을 나타내었다.
- 본 실험의 결과, 3%와 5% 농도의 glycerol 실험구에서 높은 B pattern의 비율은 cold shock에 의해 발생된 capacitation-likedstate로 사료된다. 또한 예비 동결의 높이와 시간에 따른 결과에서 3 cm, 5분간 예비 동결한 경우 F와 B pattern에는 큰 차이가 없었으나, AR pattern이 증가함을 나타내었다. 이러한 결과 역시 cold shock로 인한 조기 첨체 반응이 발생한 것으로 판단된다.
- 본 연구에서 제주 흑우의 동결 정액 제조시 7%의 glycerol 첨가가 높은 활력, 생존율 그리고 수정 능력을 유지시켰으며, 첨체의 손상 역시 가장 적게 나타났다. 예비 동결 시 조건에 있어 모든 실험구는 정자의 활력, 생존율 그리고 수정 능력에있어 어떠한 차이도 보이지 않았으나, 3 cm, 5 min 예비 동결시 빠른 cooling으로 인한 첨체 손상으로 조기 첨체 반응을 유도하는 것으로 사료된다.
- 손상 역시 가장 적게 나타났다. 예비 동결 시 조건에 있어 모든 실험구는 정자의 활력, 생존율 그리고 수정 능력에있어 어떠한 차이도 보이지 않았으나, 3 cm, 5 min 예비 동결시 빠른 cooling으로 인한 첨체 손상으로 조기 첨체 반응을 유도하는 것으로 사료된다.
- 제주 흑우의 동결 정액 제조 시 7%의 이ycerol 첨가에서 72.5±0.05%의 활력과 43.9±3.33%의 생존율 그리고 35.50±6.84%의 정자막 온전성을 나타내, 타 실험구에 비하여 높은 결과를나타내었다. 또한 정자 첨체막 양상 평가에 있어 7% 이ycerol 농도에서 수정에 필요한 정자의 비율이 높게 나타났다.
- 84%의 정자막 온전성을 나타내, 타 실험구에 비하여 높은 결과를나타내었다. 또한 정자 첨체막 양상 평가에 있어 7% 이ycerol 농도에서 수정에 필요한 정자의 비율이 높게 나타났다. 예비동결 조건에 있어 높이와 시간은 정자의 활력, 생존율 그리고 정자막 온전성에 유의적인 영향을 나타내지는 않았으나, 3 cm, 5 min의 예비 동결 조건은 빠른 cooling으로 인한 첨체 손실을 유발하여 조기 첨체 반응을 일으키는 것으로 나타났다.
- 또한 정자 첨체막 양상 평가에 있어 7% 이ycerol 농도에서 수정에 필요한 정자의 비율이 높게 나타났다. 예비동결 조건에 있어 높이와 시간은 정자의 활력, 생존율 그리고 정자막 온전성에 유의적인 영향을 나타내지는 않았으나, 3 cm, 5 min의 예비 동결 조건은 빠른 cooling으로 인한 첨체 손실을 유발하여 조기 첨체 반응을 일으키는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 본 연구에서 사용된 glycerol의 농도와 예비동결 결과의 활용으로 희소 가축의 생식세포 및 유전 자원 보존을 위한 중요한 보존 방법이 될 것이며, 생존율과 운동성증대를 위한 다양한 희석제를 활용한 연구가 필요할 것으로사료된다.
후속연구
- 그러나 현재 제주 흑우의 정액의 채취와 동결 보존에 관련된연구가 매우 미흡한 실정이다. 따라서 현재 멸실 위험 축종인제주 흑우의 증식을 위한 수단으로, 정액의 생산과 보급이 지속적으로 이루어져야 할 것이다. 인공수정은 소뿐만 아니라다른 가축에 있어 유전적인 개선과 유전 자원의 확보에 크게공헌하고 있다.
- 예비동결 조건에 있어 높이와 시간은 정자의 활력, 생존율 그리고 정자막 온전성에 유의적인 영향을 나타내지는 않았으나, 3 cm, 5 min의 예비 동결 조건은 빠른 cooling으로 인한 첨체 손실을 유발하여 조기 첨체 반응을 일으키는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 본 연구에서 사용된 glycerol의 농도와 예비동결 결과의 활용으로 희소 가축의 생식세포 및 유전 자원 보존을 위한 중요한 보존 방법이 될 것이며, 생존율과 운동성증대를 위한 다양한 희석제를 활용한 연구가 필요할 것으로사료된다.
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