서해안에 자생하는 갯메꽃의 뿌리로부터 8종의 내생진균을 분리하였다. 그리고 식물생장촉진검정을 확인하기 위하여 분리된 내생진균의 배양여액을 난장이벼에 처리하였다. Cs-9-7 균주의 배양여액 처리구에서 난장이벼의 생장촉진활성이 가장 높았다. 그리고 Cs-9-7 균주의 배양여액은 GC/MS-SIM을 사용하여 이차대사산물을 분석하였을 때, $GA_3$(1.229 ng/mL), $GA_4$(3.535 ng/mL), $GA_7$(1.408 ng/mL) 그리고 $GA_{12}$(0.378 ng/mL)의 지베렐린이 확인되었다. 그리고 분리된 내생진균의 동정을 위하여, 유니버샬 프라이머 ITS1과 ITS4를 사용하여 ITS 영역의 염기서열을 결정하였다. Cs-9-7 균주의 동정결과 A. tubingensis와 99%의 유사성이 확인되었으며, A. tubingensis Cs-9-7라고 명명하였다.
서해안에 자생하는 갯메꽃의 뿌리로부터 8종의 내생진균을 분리하였다. 그리고 식물생장촉진검정을 확인하기 위하여 분리된 내생진균의 배양여액을 난장이벼에 처리하였다. Cs-9-7 균주의 배양여액 처리구에서 난장이벼의 생장촉진활성이 가장 높았다. 그리고 Cs-9-7 균주의 배양여액은 GC/MS-SIM을 사용하여 이차대사산물을 분석하였을 때, $GA_3$(1.229 ng/mL), $GA_4$(3.535 ng/mL), $GA_7$(1.408 ng/mL) 그리고 $GA_{12}$(0.378 ng/mL)의 지베렐린이 확인되었다. 그리고 분리된 내생진균의 동정을 위하여, 유니버샬 프라이머 ITS1과 ITS4를 사용하여 ITS 영역의 염기서열을 결정하였다. Cs-9-7 균주의 동정결과 A. tubingensis와 99%의 유사성이 확인되었으며, A. tubingensis Cs-9-7라고 명명하였다.
Eight endophytic fungal strains were isolated from the roots of Calystegia soldanella from the western coast of South Korea. The culture filtrate of the eight endophytic fungi were applied to waito-c rice seedlings in order to verify potential plant growth promotion activities. The results of bioass...
Eight endophytic fungal strains were isolated from the roots of Calystegia soldanella from the western coast of South Korea. The culture filtrate of the eight endophytic fungi were applied to waito-c rice seedlings in order to verify potential plant growth promotion activities. The results of bioassay indicated that the Cs-9-7 fungal strain possessed the highest plant growth promotion activity. Fungal culture filtrates were analyzed to verify secondary metabolites using gas chromatography and mass spectroscopy with selected ion monitoring (GC/MS-SIM). The culture filtrate of the Cs-9-7 fungal strain was confirmed to contain gibberellins GA3 (1.229 ng/mL), GA4 (3.535 ng/mL), GA7 (1.408 ng/mL) and GA12 (0.378 ng/mL). Polymerase chain reactions (PCR) were performed so as to determine the internal transcribed spacer (ITS) regions for the identification of isolated strains with universal primers ITS-1 and ITS-4. The Cs-9-7 fungal strain, isolated from the root of C. soldanella, has been named Aspergillus tubingensis Cs-9-7.
Eight endophytic fungal strains were isolated from the roots of Calystegia soldanella from the western coast of South Korea. The culture filtrate of the eight endophytic fungi were applied to waito-c rice seedlings in order to verify potential plant growth promotion activities. The results of bioassay indicated that the Cs-9-7 fungal strain possessed the highest plant growth promotion activity. Fungal culture filtrates were analyzed to verify secondary metabolites using gas chromatography and mass spectroscopy with selected ion monitoring (GC/MS-SIM). The culture filtrate of the Cs-9-7 fungal strain was confirmed to contain gibberellins GA3 (1.229 ng/mL), GA4 (3.535 ng/mL), GA7 (1.408 ng/mL) and GA12 (0.378 ng/mL). Polymerase chain reactions (PCR) were performed so as to determine the internal transcribed spacer (ITS) regions for the identification of isolated strains with universal primers ITS-1 and ITS-4. The Cs-9-7 fungal strain, isolated from the root of C. soldanella, has been named Aspergillus tubingensis Cs-9-7.
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문제 정의
Table 2. Identification of endophytic fungi in this study.
제안 방법
후)분주하도록">분주 하도록 하였다. GAs는 2회에 걸쳐 ethereal diazomethane으로 methyl ester로 유도한 후 질소가스로 고정화 하였다. Sample은 dichloromethane에 용해시켜서 1 µL를 30 m×0.
건조한 각 GA의 분획을 100% methanol에 용해하여 동일한 GA들을 포함한 분획을 추가하여 1 mL의 reaction vial에 각각 분주하여 40℃ 조건으로 질소가스로 고정화하였다. 각 GA분획 중에서 불순물이 많은 분획은 NH2 PreSep extraction cartrige를 사용하여 불순물 제거 후에 각각 분주 하도록 하였다. GAs는 2회에 걸쳐 ethereal diazomethane으로 methyl ester로 유도한 후 질소가스로
건조한 각 GA의 분획을 100% methanol에 용해하여 동일한 GA들을 포함한 분획을 추가하여 1 mL의 reaction vial에 각각 분주하여 40℃ 조건으로 질소가스로 고정화하였다. 각 GA분획 중에서 불순물이 많은 분획은 NH2 PreSep extraction cartrige를 사용하여 불순물 제거 후에 각각
후)식물생장 촉진실험">식물생장촉진실험 재료로 준비하였다. 그리고 CBM에 진탕배양한 G. fujikuroi와 내생진균들은 filter paper(Whatman)를 사용하여 내생진균 배양액을 여과하였고, 배양여액(CB: culture filtrate) 30 mL을 동결건조를 5~7일 수행하였으며, 완전히 동결건조된 배양여액은 1 mL의 멸균증류수를 처리하여, 30배 농축되게 만들어 실험재료로 준비하였다[6, 11, 12]. 그리고 CBM도 같은 조건으로 만들어
">결정하였다[14]. 그리고 ClustalX로 다중정렬을 수행하였고, Lasergene 7과 BioEdit 프로그램을 사용하여 염기서열을 정리하였다. 그리고 내생진균
후)50분 획으로">50분획으로 나누었다. 그리고 liquid scintillation spectrometry를 이용하여 3H-GA를 표준 물질로 사용하여 retention time을 확인하였다.
후)실험 재료로">실험재료로 사용하였다. 그리고 갯메꽃에서 내생진균들을 분리하기 위하여 내생균들을 분리하기 위하여 스트렙토마이신(streptomycin) 80 ppm이 포함된 Hagem minimal medium을 사용하여 25℃에서 배양하였으며[20, 22], potato dextrose agar(PDA) plate에 계대배양하여 순수 분리하였다.
그리고">17]. 그리고 증폭된 단편들은 QIAquick PCR purification kit(Qiagen Inc., Germany)를 사용하여 정제하였으며, ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit(PE Biosystems, USA)를 사용하였고, DNA 단편들은 ABI 310 DNA sequencer(Perkin Elmer, New Jersey, USA)를 사용하여 염기서열을 결정하였다[14]. 그리고 ClustalX로
후)내생진균이동정되었고,">내생진균이 동정되었고, 모두 자낭균문(ascomycota)에 속하는 것이 확인되었다. 내생진균 중에는 Trichocomaceae 과에 속하는 Penicillium 속이 가장 많이 분포하고 있는 것이 확인 되었고, 분리된 내생진균의 유연관계를 확인하기 위하여 계통분석을 수행하였다[7, 13]. 그리고 내생진균의 염기서열을 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 GenBank에 등록하여 accession No.
내생진균은 DNeasy Plant mini kit(QIAgen)를 이용하여 genomic DNA를 추출하였다[11, 12, 20]. 추출된 genomic DNA는 universal primer인 ITS1(5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3')과 ITS4(5'-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3')를 사용하여 rDNA-ITS 영역을 증폭하였다.
내생진균이 생산하는 이차대사산물의 분석을 확인하기 위하여 HPLC column은 µ BondaPak C18 column(3.9×300 mm)을 사용하였으며 GAs는 acetic acid 1%, methanol 28%, methanol 100% 농도구배에 의하여 분리 하도록 하였고, 유속은 분당 1.5 mL로 총 50분획으로 나누었다.
후)반응 조건은">반응조건은 predenaturation(95℃, 2 min), denaturation(95℃, 30 sec), annealing(54.5℃, 1 min), extension (72℃, 1 min), total cycles(35 cycles) 그리고 final extension(72℃, 7 min)으로 수행하였으며, 증폭된 PCR 산물은 1.5% Agarose gel에서 전기영동 후, Ethidium bromide (EtBr)로 15분 염색하여 UV transilluminator에서 밴드를 확인하였다[13, 17]. 그리고 증폭된 단편들은 QIAquick PCR purification kit(Qiagen Inc.
본 연구에서는 갯메꽃(C. soldanella)의 뿌리내부에 서식 하는 진균류를 분리하고, 이들 균주의 배양여액을 이용하여 식물생장촉진활성을 확인하고, 내생진균의 배양여액을 분석하였으며, 마지막으로 분리된 균주들을 동정하였다.
시료는 C18 column(90-130µm, 60 pore size, Altech)과 Celite/SiO2 column(용매 formic acid로 포화된 ethyl acetate:hexane = 95:5)을 이용하여 pH 8.5±0.5로 조정하고 인산완충용액을 이용하여 분획한 후, 여액(인산완충용액)에 PVPP를 처리하여 진탕하였다.
염생식물에서 분리한 내생진균의 분자적인 동정을 위하여 rDNA-ITS 영역의 염기서열을 blastn 프로그램을 이용하여 분석하였고, GenBank database에 저장되어있는 균류들의 배열과 균류들을 분석하였다[12, 13].
염생식물에서 분리한 내생진균이 생산하는 식물호르몬을 분석하였다. 그 결과, 다양한 GAs를 생산하는 것을
를 제공받았다(Table 2). 우리는 다양한 A. tubingensis의 균주들을 이용하여 최대서열배치 및 다중정렬을 수행하였고, 균주들을 이용하여 계통수(phylogenetic tree)를 분석하였다. 그러나 다양하고 많은 방법들 중에서 neighbor joining(NJ) 방법은 다양한 균주들과
">처리 하였다. 정성과 정량 분석은 hydrocarbon standard를 이용하여 KRI value를 나타냈으며, 각 GA와 [2H2] GA internal standards(obtained from Prof. Lewis N. Mander, Australian National University, Canberra, Australia)의 3개의 ion mass를 비교하여 정량 분석하였다[7, 13, 16].
해안식물의 뿌리로부터 토양을 모두 제거하고, 계면활성제인 Tween 80을 가하고 10분간 교반한 후에 증류수로 세척하였다. 그리고 표백제인 Perchloric acid 1%에 10분간 2회 교반 후에 증류수로 세척하고, 수분을 제거한 후에 2~3 cm 길이로 절단하여
대상 데이터
5973 Network Mass Selective Detector(Hewlett Packard)가 설치된 GC/MS를 사용하였으며 data는 HP5970C Chemstation(Hewlett Packard)을 사용하여 처리 하였다.
정성과 정량 분석은 hydrocarbon standard를 이용하여 KRI value를 나타냈으며, 각 GA와 [2H2] GA internal standards(obtained from Prof.
추출된 genomic DNA는 universal primer인 ITS1(5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3')과 ITS4(5'-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3')를 사용하여 rDNA-ITS 영역을 증폭하였다. PCR 조건은 최종농도 10 mM Tris-HCl(pH 8.5), 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 200 nM dNTPs, 10 pmol의 primer 그리고 0.1 unit의 Ex-Taq DNA polymerase(Takara)를 사용하였다.
그리고">12]. 그리고 CBM도 같은 조건으로 만들어 실험재료로 사용하였다.
서해안에 자생하는 해안식물인 갯메꽃을 이용하였다. 그리고 미생물 샘플은 갯메꽃의 뿌리로부터 순수 분리한 내생 진균들을 사용하였고, G. fujikuroi(KCCM 12329) 균주는 한국미생물보존센터(KCCM)로부터 분양받아서 대조구(positive control)로 사용하였으며[13, 18], 식물생장 촉진활성 검정을 위하여 난장이벼(waito-c rice)를 사용하였다.
서해안에 자생하는 해안식물인 갯메꽃을 이용하였다. 그리고 미생물 샘플은 갯메꽃의 뿌리로부터 순수 분리한
후)식물생장촉진 활성">식물생장촉진활성 검정에는 난장이벼를 사용하였고, uniconazol 20 ppm과 스포탁을 24시간 처리하여 발아한 난장이벼를 water agar(0.6%)에 파종하여 식물생장촉진실험 재료로 준비하였다. 그리고 CBM에 진탕배양한 G.
데이터처리
통계처리는 실험으로부터 얻어진 결과를 SPSS version 18.0을 이용하여 일원 배치분산분석(ANOVA)을 통하여 기술통계 값을 확인하였고, 사후검정은 Duncan’s multiple range test(DMRT)의 방법을 이용하여 유의확률 p<0.05 수준에서 비교 분석하였다.
이론/모형
후)다 중정렬을">다중정렬을 수행하였고, Lasergene 7과 BioEdit 프로그램을 사용하여 염기서열을 정리하였다. 그리고 내생진균 계통분석은 MEGA 4.1프로그램 Neighbor-Joining(NJ) 방법으로 분석하였다[13, 15].
성능/효과
후)난장이 벼에">난장이벼에 3반복으로 처리하였으며, 갯메꽃에서 분리된 collection No. Cs-9-7의 배양여과액을 처리하였을 때, 난장이벼의 생장을 가장 효과적으로 촉진하는 것을 확인 할 수 있었으며 지상부길이와 식물체길이를 비교하였을 때[12, 13], 처리구인 G. fujikuroi 배양여과액과 활성이 비슷한 것을 확인 할 수 있었다. 그리고 평균값에서 조금 차이가 있었지만, 사후검정인 DMRT를
갯메꽃으로부터 분리된 내생진균은 형태적으로 선별되었으며, 자낭속에 자낭포자를 형성하는 균류들을 확인할 수 있었다. 그리고 내생진균은 Penicillium 속, Aspergillus 속, Paraphoma
후)식물 호르몬을">식물호르몬을 분석하였다. 그 결과, 다양한 GAs를 생산하는 것을 확인 할 수 있었으며, Cs-9-7 균주는 GA3(1.229 ng/mL), GA4(3.535 ng/mL), GA7(1.409 ng/mL), GA12(0.379 ng/mL)를 생산하는 것을 확인하였다. 그리고 많은 양을 생산하는 GA4와 GA7의 GC-MS 그래프는 Fig.
">사용 되어왔다[7]. 그래서 식물생장촉진활성을 나타낸 Cs-9-7 균주는 A. tubingensis 균주로 확인 되었고, Cs-9-7 균주를 동정하여 계통분석으로 인한 유연관계를 확인 하였다(Fig. 3).
후)균 주가">균주가 생산하는 GA3는 대조구와 비슷하게 생산하는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 GA4와 GA7 및 GA12는 대조구 보다 많은 양을 생산하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2).
후)자낭 속에">자낭속에 자낭포자를 형성하는 균류들을 확인할 수 있었다. 그리고 내생진균은 Penicillium 속, Aspergillus 속, Paraphoma 속이 분리되었다. 그리고 분리된 내생진균은 8종의
후)속 이">속이 분리되었다. 그리고 분리된 내생진균은 8종의 내생진균이 동정되었고, 모두 자낭균문(ascomycota)에 속하는 것이 확인되었다. 내생진균 중에는 Trichocomaceae 과에 속하는 Penicillium 속이 가장 많이 분포하고 있는 것이
본 연구에서는 Cs-9-7 균주인 A. tubingensis의 내생진균이 생산하는 다양한 GAs을 확인하였으며, A. tubingensis Cs-9-7(JN585944)로 명명하였다. 그리고
후속연구
그리고">13]. 그리고
갯메꽃의 뿌리로부터 다양한 내생진균 및 식물생장촉진활성을 가지는 A. tubingensis Cs-9-7을 분리 하였으며, 이를 이용하여 해양미생물연구와 해안사구복원 및 보호에 이용될 것이 기대된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
GA(gibberellin)란 무엇인가?
내생진균은 식물과 공생하며 식물생장에 중요한 역할을 한다고 보고되고 있으며, GA(gibberellin), IAA(auxin), ABA(abscisic acid) 등의 식물호르몬을 생산하는 균주 및 이를 이용한 생물학적 제제에 대한 연구도 증가 하고 있다[13, 14]. 그리고 GA는 식물생장호르몬으로서 diterpenoid 복합체로서, 식물의 생장, 개화촉진, 종자의 발아, 줄기신장, 과육의 성숙 등을 조절한다고 보고되었다[4, 8, 13, 19]. 1920년대에 bakanae 병의 원인균인 Gibberella fujikuroi를 일본의 식물병리학자 Kurosawa가 최초로 발견 하였으며, 1935년에 Yabuta와 Sumiki에 의하여 식물생장물질이 분리되었다[17].
식물생장호르몬인 GA는 어떤 미생물에서 생산되는가?
1920년대에 bakanae 병의 원인균인 Gibberella fujikuroi를 일본의 식물병리학자 Kurosawa가 최초로 발견 하였으며, 1935년에 Yabuta와 Sumiki에 의하여 식물생장물질이 분리되었다[17]. GA는 G. fujikuroi 외에도 Phaeosphaeria sp. L487, Neurospora crassa, Pseudomonas sp., Paceloma manihoticola, Penicillium sp. 등에서 생산된다고 알려져 있으며, 원핵미생물과 식물뿐 아니라 진핵미생물에서도 생산 되어지고 있다[1, 8-10, 18, 19]. GA는 현재까지 136 종류가 알려져 있으며, 이들 중에서 GA1, GA3, GA4 와 GA7이 식물생장촉진활성을 가짐이 밝혀졌으며, 미생물이 생산하는 이차대사산물로 알려져 있다[2, 3, 11].
해안사구가 여러 측면에서 연구와 관심이 집중되고 있는 이유는 무엇인가?
해안사구(coastal sand dune)는 해류와 연안류에 의해서 해안선을 따라 쌓인 모래언덕으로, 물 부족, 빠른 지형변화, 강한 바람, 강한일조량, 염도 등으로 인해 매우 열악한 환경조건을 가지고 있어 식물들의 생육에 부적합하다. 그러나 특이적인 환경지역에 자생하는 식물들이 있으며, 생태적 자원 및 관광자원으로서 상당히 중요시되고 있다. 최근에는 환경 보전 등으로 인하여 점차적으로 세계적인 주목을 받고 있으며, 사구지역의 난개발과 오염, 훼손 등이 심하게 발생하고 있어서 사구식물들을 이용한 사구의 보호가 필요하게 되었다[16, 21]. 특히 해안지역의 특성과 육상지역의 지리적 생태적 특성이 공통적으로 나타나고 있으며, 두 지역의 전이적인 특성을 나타내고 있는 차별적인 생태계로서 해안사구에서만 볼 수 있는 식물 종들이 서식하고 있기 때문에 생태학적인 관점뿐 아니라, 자원보존에서의 관점 및 여러 측면에서 연구와 관심이 집중되고 있다[3, 5]. 최근에는 사구식물들의 보호와 환경 보존을 위하여 사구식물의 발아, 개화 및 성장에 대한 연구와 식물과 공생, 공존하는 미생물들에 대한 연구가 진행되고 있으며[9, 11, 12, 13], 내생진균의 이차대사산물 규명 및 새로운 균주의 개발 등으로 사구식물의 증식과 생장이 사구환경의 보호를 위해서 상당히 중요하다는 것이 알려졌다[9, 13].
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