[논문]LPS로 유도된 대식세포 활성에서 발효 산약 추출물의 억제 효과

임성원; 이선희; 허정무; 이영미; 김대기

LPS로 유도된 대식세포 활성에서 발효 산약 추출물의 억제 효과
The Inhibitory Effect of Fermented Dioscoreae batatas Extract on Lipopolysaccharide-induced Macrophage Activation 원문보기

약학회지 = Yakhak hoeji, v.55 no.5, 2011년, pp.404 - 410

임성원 (전북대학교 의과대학 및 의과학연구소) , 이선희 (전북대학교 의과대학 및 의과학연구소) , 허정무 (종근당 건강(주)) , 이영미 (원광대학교 약학대학 한약학과 및 원광한약연구소) , 김대기 (전북대학교 의과대학 및 의과학연구소)

Abstract ▼ AI-Helper

This study was to elucidate the anti-inflammatory activities of a methanol extract derived from the fermented bark of Dioscoreae batatas on LPS-induced activation in macrophages. It was fermented with Lactobacillus fermentum and L. plantarum and then analyzed to identify the contents of methanol extract and diosgenin. The fermented product showed 3-fold increase in the extraction yield by methanol, and 1.8-fold increase in diosgenin contents, compared to that from the dried bark of D. batatas. Although the methanol extract from the unfermented D. batatas inhibited lipopolysaccharide (LPS)-induced production of nitric oxide (NO) and TNF-${\alpha}$ in J774 A.1 cells, the methanol extract from the fermented product revealed significantly the enhanced the inhibitory activities on LPS-induced production of NO and TNF-${\alpha}$. Taken together, our results indicate that fermentation of bark of D. batatas elevates the functional activity inhibiting macrophage activation through the increase of the content of anti-inflammatory compounds. Thus, its methanol extract may be useful as a functional material for the therapy of inflammatory diseases.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

후)발효 과정을">발효과정을 거치며 젖산균에 의해 다당류가 대사되어 diosgenin으로 변화되는 것으로 판단된다. 따라서 산약 발효물에서 diosgenin 함량의 증가는 약리학적인 생리활성에 변화가 예상되며, 대식세포 활성에 미치는 효과를 조사하였다.
본 연구에서는 산약 분말을 젖산균 발효하여 메탄올으로 추출한 시료에 대하여 LPS-유도된 대식세포 활성에 미치는 변화를 산약분말 메탄올추출물과 비교분석하였다. 산약을 L.
본 연구에서는 젖산균을 활용하여 산약을 발효시키고, 그 발효물의 methanol 추출물에서 대식세포 활성에 미치는 영향을 연구하므로써 기능성식품으로의 가능성을 검토하고자 하였다.

제안 방법

LPS로 자극한 J774 A.1 세포에서 산약 미발효물 및 발효물의 메탄올추출물을 농도별로 처리하여 Nitric oxide(NO) 생성에 미치는 영향을 비교하였다(Fig. 3). 대식세포 후)분석 전까지">분석전까지 -20℃ 이하에서 보관하였다. NO의 정량은 Griess reagent를 이용하여 측정하였다. 96 well plate에 세포배양액 100 µl와 Griess reagent(0.
대식세포 활성은 양성대조군으로 LPS(0.1 µg/ml)를 처리하여 비교하였으며, 실험은 제조사에서 제공한 protocol에 따라 실행하였다.
대식세포주 J774 A.1을 96 well plate에 1×104 cells/well로 분주하고 24시간 동안 세포를 안정시킨 후 시료를 농도별로 희석한 배지를 처리하여 5% CO2, 37℃ 조건의 incubator에서 48시간을 배양하였다.
후)산약발효물은">산약 발효물은 (주)한풍제약연구소에서 다음과 같이 제조하여 제공받았다. 발효균주 L. fermentum(KCCM40026)와 L. plantarum(KCCM11322)를 각각 MRS plate에서 2회 계대배양 후 MRS 액상 배지에 1 loop 접종하여 37℃, 48시간 배양하였다. 배양된 후)발효물현탁액의">발효물 현탁액의 4%가 되도록 혼합하여 37℃에서 교반하면서 3일간 배양하였다. 발효상태는 pH의 변화로 확인하였으며, 발효 과정에서 합성된 유기산의 산도를 측정하였다. 최종 발효물은 60℃에서 본 실험에서 사용한 시료들에 의한 세포독성을 측정하기 위해 CCK-8을 이용하여 세포생존율을 측정하였다. 대식세포주 J774 A.
산약 건조분말(NFD) 및 발효물 건조분말(FD) 50 g에 methanol 500 ml을 가하여 상온에서 24시간 교반하여 추출한 후 Whatman 여과지로 걸러 불용물을 제거하였다. 여과액을 rotary evaporator (EYELA, Tokyo, Japan)로 농축한 후 후)산약발효물의">산약 발효물의 pH, 산도, 추출율 및 diosgenin 함량 변화
산약 건조분말을 3일간 젖산균 발효를 시킨 후 얻어진 발효건조물의 pH와 발효과정에서 합성된 유기산의 산도를 측정하였다. 산약은 steroidal saponin계 화합물로 알려진 diosgenin을 함유하고 있다.
후)산약발효물의">산약 발효물의 추출물이 J774 A.1 세포의 세포생존율에 미치는 영향
산약 미발효물(NFD) 및 산약 발효물(FD)의 메탄올 추출물이 J774 A.1 세포의 생존 및 증식에 미치는 영향을 비교하고자 다양한 농도로 세포에 처리하여 48시간 배양 후 미처리대조군(100%) 을 기준으로 각각의 세포생존율을 측정하였다(Fig. 2). 1~500 µg/ ml 세포에서 분비된 cytokines의 농도를 측정하기 위하여 배양액을 원심 분리하여 상층액을 취하고 ELISA Kit(eBioscience, SanDiego, CA)를 사용하여 TNF-α와 IL-1β 분비량을 측정하였다.
후)발효물건 조분말(FD)">발효물 건조분말(FD) 50 g에 methanol 500 ml을 가하여 상온에서 24시간 교반하여 추출한 후 Whatman 여과지로 걸러 불용물을 제거하였다. 여과액을 rotary evaporator (EYELA, Tokyo, Japan)로 농축한 후 동결 건조하여 메탄올추출 물을 얻었으며 이를 본 연구에 사용하였다.
발효상태는 pH의 변화로 확인하였으며, 발효 과정에서 합성된 유기산의 산도를 측정하였다. 최종 발효물은 60℃에서 수분함량 6% 이하가 되도록 열풍 건조하였으며, 이를 분쇄하여 산약발효분말 시료를 제조하였다. 후)최종 발효물의">최종발효물의 pH 와 유기산의 산도를 측정하고자, 시료 10 g에 끓여 식힌 증류수 100 ml를 가하고 pH를 측정하였으며, 이에 페놀프탈레인시약 0.5 ml를 가하여 0.1 N NaOH로 30초간 홍색이 지속될 때까지 적정하여, 다음 식에 따라 산도를 산출하였다.
후)µl를">µl를 혼합하여 실온에서 10분간 반응시킨 후 550 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 표준품 Sodium nitrite를 통하여 얻어진 standard curve로부터 nitrite의 농도를 산출하였다.

대상 데이터

후)그 밖의">그밖의 시약과 용매들은 Sigma사(St. Louis, MO)에서 구입하여 사용하였다.
마우스 대식세포주 J774 A.1세포는 한국세포주은행(Seoul, Korea)으로 부터 분양받았으며, 세포배양을 위한 Dulbecco's modified Eagle's media(DMEM) 및 fetal bovine serum(FBS)는 Hyclone(Logan, UT)에서 구입하였고, Penicillin(100 units/ml)-streptomycin(100 µg/ml)은 WelGENE (Daegu, Korea)에서, 세포증식 분석시약 Cell Counting Kit-8 (CCK-8)은 Dojindo사(Kumamoto, Japan)에서, Lipopolysaccharide (LPS)는 Sigma사(St. Louis, MO)에서 구입하였다.
">분말화 하였다. 발효를 위해 사용한 젖산 균주는 MRS 배지에 Lactobacillus fermentum(KCCM40026) 와 L. plantarum(KCCM11322)를 한국미생물보존센터(Seoul, Korea)에서 분양받았다. 마우스 대식세포주 J774 A.
본 실험에 사용한 시료는 국내에서 재배한 마(Dioscorea batatas)를 익산 금마농협으로부터 구입하여, 물로 수세 후 표면의 물기를 제거, 열풍건조기를 이용하여 건조(60℃) 시킨 뒤 100 mesh 이내로 분쇄하여 분말화 하였다. 발효를 위해 사용한 젖산 균주는 MRS 배지에 Lactobacillus fermentum(KCCM40026) 와 L.
후)산약발효물은">산약 발효물은 (주)한풍제약연구소에서 다음과 같이 제조하여 제공받았다. 발효균주 L.

데이터처리

모든 실험은 3회 반복 실시하였으며, 실험 Data는 mean±S.D. 로 표시하였고, Student's t-test를 이용하여 통계학적 분석을 하 여 통계적 유의성(p<0.05)을 판정하였다.

이론/모형

Cells (1×10⁴ cells/well) were cultured for 48 h with various concentrations of the extracts. Cell viability was measured by CCK-8 assay. Data are represented as mean from the triplicate experiments.
산약은 steroidal saponin계 화합물로 알려진 diosgenin을 함유하고 있다. Diosgenin는 대식세포 활성 억제하는 주요성분으로 마품종 및 산지에 따라 diosgenin의 함유량이 다소 차이가 있지만 젖산균 발효에 의한 함량 변화가 예측되므로 산약 발효물에서diosgenin의 함량을 HPLC/MS법으로 분석하였다(Table I). 발효 직전의 산약분말(NFD) 현탁액의 pH는 6.
표준품 Diosgenin은 methanol과 DMSO 3 : 1(v/v)에 녹인 후 일정 농도로 희석하여 검량선 작성하였다. Diosgenin의 함량 분석은 역상 HPLC 법으로 6410B Triple Quad LC/MS(Agilant, SantaClara, CA)를 사용하여 Table I과 같이 실행하였다.
1 µg/ml) for 24 h. NO production from the cells was determined by Griess method. Data are represented as mean from the triplicate experiments (*P< 0.
산약 및 발효물 추출물이 LPS에 의해 유도된 J774 A.1 세포의 염증성 인자 TNF-α 분비에 미치는 영향을 비교하고자 ELISA법으로 측정하였다(Fig. 4).
후)생리활성 물질의">생리활성물질의 함량과 밀접한 관련이 있을 것으로 사료된다. 한편 발효물에서 산약의 지표성분으로 diosgenin의 함량에 대한 변화를 확인하고자 HPLC/MS법으로 분석하였다(Fig. 1). 산약
성능/효과
- 1~100 µg/ml 농도범위에서 미발효물 메탄올추출물을 처리한 경우 세포증식에 큰 변화가 없었지만, 발효물 메탄올추출물의 경우 농도 의존적으로 세포증식률이 증가하였으며, 100 µg/ml에서는 미발효물 메탄올추출물에 비하여 25% 이상 세포증식율이 증가함을 보였다.
- 1~500 µg/ ml 농도범위에서 미발효물 및 발효물 메탄올추출물의 처리군 모두에서 세포사멸은 관찰되지 않았다.
- 발효과정을 통해 얻어진 최종 발효 산물(FD)의 pH는 3.95±0.04이었고 유기산의 산도는 1.62± 0.11%를 보였다.
- 산약 건조분말 시료의 메탄올 추출률은 6.7± 0.3%이었으며, 발효물의 경우 미발효물에 비하여 3배 높은 20.1± 0.5% 추출율을 보였다(Table II).
- 이상의 결과로 산약 미발효물 및 발효물 메탄올추출물이 LPS 유도 대식세포의 TNF-α 분비를 유의적으로 각각 41.6%, 64.0% 억제함을 확인하였으며, 특히 산약 발효물 메탄올추출물에서 LPS에 의해 유도된 대식세포의 TNF-α 분비 에 대한 억제효과가 미발효물에 비해서 1.5배 증가하는 것을 확인하였다.
- ">감소시켰다. 이상의 결과로 산약발효물 메탄올추출물에서 LPS에 의해 유도된 대식세포 NO 생성에 대한 억제효과가 미발효물에 비해서 1.5배 유의하게 증가하는 것을 확인하였다. NO는 인체에 침입한 병원체나 암세포를 제거하는 면역반응에 중요한 세포독성물질로 알려져 있다.
- 이상의 결과로부터 산약 및 발효물 메탄올 추출물은 1~100 µg/ml 이하 농도에서 대식세포 활성에 영향을 미치는 것으로 사료된다.
- 07 mg이었다. 이와 같은 결과로부터 젖산균 발효에 의해 산약 특성이 변화하고 diosgenin의 함량이 증가하는 경향을 확인하였다. 산약에는 인체에서 황체호르몬의 전구물질으로 알려진 dioscin 및 diosgenin을 함유하고 있음이 보고되었다.
- 후)식품 발효의">식품발효의 일반적인 특성인 유기산의 산도가 증가하였고, 산약 고유의 특성인 점액성 물질은 일반 관능검사에서 관찰되지 않았다. 한편 산약을 젖산균으로 일정조건으로 발효한 경우 메탄올에 의한 추출률이 산약건조분말과 비교해서 3배 이상 증가 하였고, 항염작용이 알려진 steroidal saponin계 화합물 diosgenin 함량이 증가되는 것을 확인하였다. 이와 비례하여 LPS에 의해 유도된 대식세포 NO 생성과 TNF-α 분비량이 산약발효 메탄올 추출물은
  후속연구
  
  결과를 종합하면 산약을 발효함으로써 기능성원료생산이 용이하도록 물리화학적 특성을 개선할 뿐만 아니라, diosgenin의 함량을 증가시켜 항염증작용 활성을 증강시킬 수 있을 것으로 사료된다. 또한 인체 후)대식세포 활성에">대식세포활성에 대한 억제능이 본 연구 결과와 유사하게 증가함을 보고하였다. 따라서 발효기술을 활용하여 산약의 염증유발 사이토카인 및 유발인자의 생성을 억제하는 항염효과를 향상시킬 수 있을 것으로 사료되며 염증성 질환 개선 및 치료제로써 적용을 위해 지속적인 연구가 필요할 것이다.
  
  후)항염증 작용">항염증작용 활성을 증강시킬 수 있을 것으로 사료된다. 또한 인체 섭취시 스테로이성 사포닌의 체내흡수 및 생체이용률을 향상시킬 것으로 보이며, 항염작용, 항비만작용, 항산화효과 등의 약리활성이 증강된 건강기능성 소재개발에 활용 될 수 있을 것으로 사료된다. 하지만 산약이 후)활용될">활용 될 수 있을 것으로 사료된다. 하지만 산약이 발효과정을 통하여 새로이 합성되는 화합물에 대한 정보는 전혀 알려진 바가 없으므로 인체 섭취를 위해서는 향후 동물실험을 통하여 발효산물의 안전성, 생체이용률 및 생리활성에 관한 연구가 필요하다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	마란 무엇인가?	백합목 마과(Dioscoreacea)에 속하는 마(Yam)는 우리나라 전국 산야에 자생하는 덩굴성 다년생 식물로서 국내에는 1속 9종이 있으며 주로 재배되는 마는 Dioscorea batatas Decne.(마) 및 D.
	산약이라 불리는 지하부의 사용 목적은 무엇인가?	(참마) 2종이다. 한방에서는 지하부를 산약 (山藥)이라 하며 약용으로 뿌리줄기의 주피를 벗겨 그대로 또는 쪄서 말린 것을 설사, 구리, 식욕부진, 해수, 소갈, 유정, 대하, 빈뇨 등의 치료 목적으로 오랜 세월 동안 사용되어 왔다. 1-3) 산약의 구성성분은 대부분이 식이섬유이며, 탄수화물(10~15%), 아 미노산, 점액성 당단백질, diosgenin, mucilages, allantoin, dioscorins, batatasins, phenanthrene glycoside, soyacerebroside, beta-sitosterol, palmitic acid, choline, sitosterol계 화합물들이 보고되었다.
	국내에서 주로 재배되는 마는 무엇인가?	백합목 마과(Dioscoreacea)에 속하는 마(Yam)는 우리나라 전국 산야에 자생하는 덩굴성 다년생 식물로서 국내에는 1속 9종이 있으며 주로 재배되는 마는 Dioscorea batatas Decne.(마) 및 D. japonica Thunb.(참마) 2종이다. 한방에서는 지하부를 산약 (山藥)이라 하며 약용으로 뿌리줄기의 주피를 벗겨 그대로 또는 쪄서 말린 것을 설사, 구리, 식욕부진, 해수, 소갈, 유정, 대하, 빈뇨 등의 치료 목적으로 오랜 세월 동안 사용되어 왔다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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