Objectives : Chrysanthemum boreale flower is widely distributed in Korea, Japan, China, and Eastern countries. C. boreale flower is also one of the herbs used for the treatment of various inflammatory disease in Korean Medicine. So, this research was designed to study anti-inflammatory effect of C. ...
Objectives : Chrysanthemum boreale flower is widely distributed in Korea, Japan, China, and Eastern countries. C. boreale flower is also one of the herbs used for the treatment of various inflammatory disease in Korean Medicine. So, this research was designed to study anti-inflammatory effect of C. boreale flower and its mechanism. Methods : We investigated nitro oxide (NO) and prostaglandin $E_2$ ($PGE_2$) production by ELISA. And expressions of inducible nitric oxide synthase (iNOS), Cyclooxygenase-2 (COX-2) and nuclear factor-${\kappa}B$ P50/65 (NF-${\kappa}B$ P50, NF-${\kappa}B$ P65) were measured in RAW 264.7 murine macrophage cells induced by LPS. Results : MeOH ex., EtOAc fr., $CHCl_3$ fr. and Water fr. of C. boreale flower showed anti-inflammatory effect through inhibition of NO and PGE expression respectively. Among them, EtOAc fr. and $CHCl_3$ fr. inhibited production of NO and $PGE_2$ through inhibition of iNOS and COX-2 expression. And MeOH ex., EtOAc fr. and $CHCl_3$ fr. inhibited translocation of NF-${\kappa}B$ P65, NF-${\kappa}B$ P50 by inhibiting phosphrylation of $I{\kappa}B$. Conclusions : MeOH ex. EtOAc fr, $CHCl_3$ fr., and Water fr. of the C. boreale flower have anti-inflammatory activity.
Objectives : Chrysanthemum boreale flower is widely distributed in Korea, Japan, China, and Eastern countries. C. boreale flower is also one of the herbs used for the treatment of various inflammatory disease in Korean Medicine. So, this research was designed to study anti-inflammatory effect of C. boreale flower and its mechanism. Methods : We investigated nitro oxide (NO) and prostaglandin $E_2$ ($PGE_2$) production by ELISA. And expressions of inducible nitric oxide synthase (iNOS), Cyclooxygenase-2 (COX-2) and nuclear factor-${\kappa}B$ P50/65 (NF-${\kappa}B$ P50, NF-${\kappa}B$ P65) were measured in RAW 264.7 murine macrophage cells induced by LPS. Results : MeOH ex., EtOAc fr., $CHCl_3$ fr. and Water fr. of C. boreale flower showed anti-inflammatory effect through inhibition of NO and PGE expression respectively. Among them, EtOAc fr. and $CHCl_3$ fr. inhibited production of NO and $PGE_2$ through inhibition of iNOS and COX-2 expression. And MeOH ex., EtOAc fr. and $CHCl_3$ fr. inhibited translocation of NF-${\kappa}B$ P65, NF-${\kappa}B$ P50 by inhibiting phosphrylation of $I{\kappa}B$. Conclusions : MeOH ex. EtOAc fr, $CHCl_3$ fr., and Water fr. of the C. boreale flower have anti-inflammatory activity.
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문제 정의
3333px;">)의 분비량, inducible nitrc oxide synthase (iNOS)와 Cyclooxygenase -2 (COX-2)의 단백질 발현을 측정하였다. 그 결과 MeOH 추출물과 CHCl3, EtOAc, water 분획물은 모두 유의한 항염증 효과를 나타내었고, 특히 chloroform 분획물은 뛰어난 항염증 효능이 있었으므로 이에 보고하는 바이다.
본 실험에서는 산국 꽃 추출물에 의한 P50, P65의 활성을 조사하기 위해 세포내 P50, P65의 억제인자인 IκB의 양을 정량하였다.
제안 방법
COX-2의 활성을 조사하기 위하여, 세포 내 PGE2의 양을 정량하였다. 실험은 NO assay와 동일한 방법으로 세포질 용액을 취하여 유리된 PGE2의 양을 PGE2 EIA system (Amersham, RPN222)의 프로토콜에 따라 측정하였다.
MTS assay를 이용하여 1.25 ∼ 20 ㎍/㎖의 농도에서 산국 꽃의 세포독성 실험을 수행하였다.
7 세포는 한국세포주은행 (Korean Cell Line Bank, Korea)에서 분양받았다. RAW 264.7의 세포 성장을 위한 기본 배지로는 DMEM을 사용하였고, 10% FBS, streptomycin sulfate (100 ㎍/mL), penicillin G (100 units/mL), 10 mM sodium bicarbonate를 첨가하였다. RAW 264.
iNOS의 활성을 관찰하기 위하여, NO 생성량을 측정하였다. RAW 264.
Lipopolysaccharide (LPS) 1 ㎎을 1X PBS 1 ㎖에 녹여서 필터한 후 사용하였다. 각 실험에서 세포를 24시간 배양한 다음 일정량의 시료를 LPS 처리 1시간 전에 넣어서 배양한 후 10 ㎍/㎖ 농도로 LPS를 처리하여 실험을 진행하였다.
그러므로, 산국 꽃의 항염증 활성 및 기전을 밝히기 위하여 Lipopolysaccharide (LPS)로 자극된 murine macrophage 세포에 꽃의 MeOH 추출물과 분획물들을 처리한 후, Nitric Oxide (NO)의 생성량, prostaglandin E2 (PGE2)의 분비량, inducible nitrc oxide synthase (iNOS)와 Cyclooxygenase -2 (COX-2)의 단백질 발현을 측정하였다. 그 결과 MeOH 추출물과 CHCl3, EtOAc, water 분획물은 모두 유의한 항염증 효과를 나타내었고, 특히 chloroform 분획물은 뛰어난 항염증 효능이 있었으므로 이에 보고하는 바이다.
다음 날 TBST로 5분씩 3회 세척한 후 mouse secondary antibody를 1시간동안 상온에서 배양시켰다. 다시 TBST로 10분씩 3회 세척한 후 BCIP/NBT시약을 이용하여 발색하였다.
다음날 TBST로 5분씩 3회 세척한 후, mouse와 goat secondary antibody를 1시간 동안 상온에서 배양시켰다. 다시 TBST로 10분씩 3회 세척한 후 ECL Western Substrate (PIERCE, #3216)용액과 1분간 반응시킨 후 X-선 필름 (Kodak)에 노출시켜 현상하였고, TotalLab V.2.01 Software program을 이용하여 정량하였다.
에서 10 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖의 농도일 때 대조군과 비교하여 독성을 나타내었다. 따라서 이후 실험에서는 세포독성이 없는 5 ㎍/㎖의 농도로 실험을 진행하였다.
00 ㎍/mL의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 24시간 후 MTS와 PMS를 20：1의 비율로 잘 혼합하여 처리하고 3시간 배양한 후, ELISA Reader (Versamax, Molecular Devices Co., U.S.A.)를 이용하여 490 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
본 실험에서는 LPS에 의해 RAW 264.7 세포로부터 생성된 NO의 양을 측정하였으며, NO 발현양을 확인한 후 RAW 264.7 cell에서 iNOS 단백질 발현에 미치는 변화를 확인하였다.
본 실험에서는 MTS assay를 이용하여 산국 꽃의 세포독성 실험을 수행하였다. 그 결과 MeOH ex.
본 실험에서는 Western blotting을 통해 산국 꽃 추출물 및 분획물을 이용하여 COX-2와 COX-2 염증 기전에 관련된 PGE2의 발현량을 측정하였다.
산국 꽃 추출물 및 분획물의 세포 독성을 확인하기 위하여, RAW 264.7 세포에서 MTS/PMS (Cell Titer 96TM Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, Cat. G5421-Promega)를 이용하여 MTS assay를 수행하였다. RAW 264.
산국 꽃 추출물에 의한 COX-2의 활성을 조사하기 위해 세포내 PGE2의 양을 정량하였다. 그 결과, PGE2의 생성이 대조군에 비해 MeOH ex.
산국 꽃 추출물에 의한 P50, P65의 활성을 조사하기 위해 P50, P65의 억제인자인 IκB의 양을 정량하였다.
산국 꽃 추출물이 P50, P65의 활성에 미치는 변화를 확인하였다. 그 결과 P50의 발현량은 대조군에 비해 MeOH ex.
iNOS와 COX-2의 전사인자인 NF-κ B의 발현에 대한 시료의 영향을 조사하기 위해 Western blotting을 실시하였다. 시료를 처리한 세포를 모아 PBS로 2번 씻어낸 후 Nuclear Extract Kit를 이용하여 단백질을 추출하였다. 얻어진 세포 내 단백질 용액을 Pro-measure 시약을 사용해 단백질 농도를 정량하고, 100 ㎍의 단백질을 취하여 샘플버퍼와 혼합하여 95 ℃에서 5분간 가열한 후 -20 ℃에서 보관하였다.
의 양을 정량하였다. 실험은 NO assay와 동일한 방법으로 세포질 용액을 취하여 유리된 PGE2의 양을 PGE2 EIA system (Amersham, RPN222)의 프로토콜에 따라 측정하였다.
대상 데이터
본 실험에 사용된 murine macrophage RAW 264.7 세포는 한국세포주은행 (Korean Cell Line Bank, Korea)에서 분양받았다. RAW 264.
본 실험에서 사용된 RAW 264.7 cell은 murine macrophage로서 박테리아의 세포벽성분인 LPS에 의해 세포의 NOS 효소가 활성화 되면 세포의 염증반응의 중요한 인자인 NO 농도가 증가하게 된다. 이러한 특성에 의해 세포독성을 갖는 물질들의 독성검정을 위해 유용하게 사용되고 있다15).
본 연구에 사용된 산국 C. boreale의 꽃은 2007년 10월 경북 영천에서 채취하여 陰乾한 것으로 본 대학 본초학교실에서 감정한 후 細切하여 사용하였다. 시료의 일부는 경희대학교 한의과대학 본초학교실에 보관되어 있다 (Table 1).
이론/모형
LPS에 의해 RAW 264.7 세포로부터 생성된 NO의 양은 Nitrate/Nitrite colorimetric assay kit를 이용하여 세포질에 존재하는 Nitrite의 형태로서 측정하였으며, 실험 방법은 Griess 시약을 사용하여 Cayman Chemical Company의 실험법에 따라 정량하였다.
NO의 생성을 유도하는 효소인 iNOS의 단백질 발현량에 미치는 시료의 영향을 조사하기 위해 western blotting을 실시하였다. 시료를 처리한 세포를 모아 PBS로 2회 씻어낸 후 Pro-prep 시약 100 μL를 가하여 -20℃에서 10분간 방치한 뒤 4℃에서 12,000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 상등액을 얻었다.
PGE2를 생성하는 COX-2의 단백질 발현량에 미치는 영향을 조사하기 위하여 iNOS 측정과 같은 방법으로 western blotting을 실시하였다. 시료를 처리한 세포를 모아 PBS로 2회 씻어낸 후 Pro-prep 시약 100 μL를 가하여 -20℃에서 10분간 방치한 뒤 4℃에서 12000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 상등액을 얻었다.
iNOS의 활성을 관찰하기 위하여, NO 생성량을 측정하였다. RAW 264.7 세포로부터 생성된 NO의 양은 Nitrate/Nitrite colorimetric assay kit를 이용하여 세포질에 존재하는 NO2-의 형태로서 측정하였으며, 실험 방법은 Cayman Chemical Company의 지시에 따라 정량하였다.
iNOS와 COX-2의 전사인자인 NF-κ B의 발현에 대한 시료의 영향을 조사하기 위해 Western blotting을 실시하였다.
성능/효과
결론적으로 淸熱解毒의 효능으로 瘡癰腫毒의 치료에 사용이 가능한 산국 꽃 추출물 및 분획물의 항염증 활성 실험결과 NO생성과 PGE₂생성억제를 통해 항염증 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 그 중 CHCl₃fr.
그 결과 산국 꽃 추출물과 분획물은 iNOS 발현과 NO생성을 억제하여 항염효과를 나타낸다는 결과를 얻었으며, 클로로 포름 분획물에서 가장 높은 효과를 나타내는 것으로 생각된다.
그 결과 산국 꽃 추출물이 세포내에서의 IκB의 인산화를 억제하여 P50, P65가 세포질로부터 핵 안으로 이동하여 전사인자로서 작용하게 하는 것을 억제하는 효과가 있다는 것을 알 수 있었다.
은 IκB의 인산화를 억제하여 NF-κB(P50, P65)가 세포핵 내로 이동하는 것을 억제하는 것으로 나타났다.
이상의 실험 결과 산국 꽃 추출물 및 분획물이 항염 효과 및 기전을 확인할 수 있었다. 모든 추출물 및 분획물에서 일정한 항염 활성이 있었고, 특히 CHCl3 fr.
후속연구
에서의 항염 활성이 가장 뚜렷하였다. 이러한 연구 결과는 한의학 임상에서 淸熱解毒의 목적으로 산국 꽃을 다양한 염증성 질환에 보다 적극적으로 응용할 수 있게 하고, 항염증 치료 한약제제 개발에도 응용될 수 있을 것이라 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
산국은 무엇인가?
산국(Chrysanthemum boreale Makino)은 국화과에 속하는 다년생 초본으로 우리나라 중부 이남의 산간지역에 널리 야생하고 있다1,2). 산국은 감국 C.
염증반응은 어떤 증상을 수반하며, 과도할 때는 어떤 질환을 유발하는가?
염증반응은 통증, 발적, 열종창 등의 증상을 수반하며13), 과도한 염증반응은 암, 비만, 2형 당뇨, 심혈관 질환, 퇴행성 신경질환, 노화 등을 유발할 수 있다14).
산국 꽃의 성분이 가진 항암효과에 대해 어떤 연구 보고가 있었는가?
산국 꽃의 효능에 대하여 장 등8)은 꽃에서 분리한 sesquiterpene lactone은 인체암세포주인 UACC62, HCT15, UO-31, PC3 및 A549 cell에 비교적 강한 세포독성이 나타나는 것으로 보고하였다. 남 등9)은 꽃에서 분리된 일부 성분이 L1210, K562, A549세포에 항암 효과가나타나는 것으로 보고하였다. 항균 활성에 대하여 장 등10)은 S.
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