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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 여러 가지 항산화 성분을 많이 함유하고 있는 오동나무 잎을 이용하여 화장품 원료로의 적용 가능성을 확인하기 위하여 오동나무 잎 추출물의 항산화능과 항염 효능을 알아보았다. 전자상자성공명법 (electron paramagnetic resonance, EPR)을 이용한 su-peroxide anion radical 소거능을 확인하여 항산화능을 살펴보았으며 항염 효능으로서 대식세포주를 이용한 염증반응의 신호전달 과정을 탐색하여 어떠한 과정에서의 신호 전달을 막아주는지 알아보았다.
- 또한 위에서 확인된 오동나무 잎 추출물의 항염 효능은 염증 반응 신호 전달의 초기 단계인 IkB-α 의 분해를 억제함으로서 나타내는 것을 확인하였다. 따라서 이와 같은 오동나무잎 추출물의 항산화 효능과 항염 효능을 이용하여 피부자극 완화 소재로서의 적용 가능성을 확인하였다.
- COX-2 단백질의 발현여부를 확인한 결과 100 ㎍/rnL의 농도에서 단백질의 발현양이 감소하였으며 이는 PGE2 결과와 일치함을 보여주고 있다. 또한 염증 반응 신호 전달 과정의 초기 단계에 해당하는 IkB-α 단백질의 분해를 오동나무 잎 추출물이 억제하는지 여부를 알아보았다. LPS 처리후 시간별로 IkB-α 단백질의 분해정도를 확인한 결과 LPS 처리 30 min 후 IkB* 단백질이 분해됨을 확인하였으며 오동나무 잎 추출물 처리시 IkB-α 단백질의 분해를 억제시켜줌을 확인하였다(Figure 5).
- 오동나무 잎 추출물이 화장품 소재로 사용되었을시 안전한 소재임을 평가하기 위하여 세포에 대한 독성을 평가하였다. 사람 유래의 섬유아세포(CCD-986sk)와 쥐 유래의 대식세포(Raw 264.
- 오동나무의 묘목과 꽃, 잎에 존재하는 유효 성분을 연구한 기존의 연구 결과를 바탕으로 하여 오동나무 잎에 존재하는 항산화 물질들을 이용한 기능성 화장품 원료로의 적용 가능성을 알아보기 위하여 그 효능을 평가하였다. 오동나무 잎 추출물의 superoxide anion radical 소거능을 평가한 결과 그다지 높은 소거능은 아니지만 오동나무 잎 추출물에서의 항산화 효능을 확인할 수 있었다.
제안 방법
- 배양후 배지를 제거하고, 무혈청 배지에 최종 농도가 20, 50, 100 ㎍/mL으로 되도록 오동나무 잎 추출물을 처리한 후염증 반응 유도 인자인 lipopolysaccharides (LPS)를 100 ng/mL의 농도로 처리하여 주었다. 24 h 배양 후 PGE2 kit 시약을 이용하여 PGE2의 생성 정도를 측정하였다.
- 배양 후 배지를 제거하고, 무혈청 배지에 최종 농도가 20, 50, 100 ㎍/mL으로 되도록 오동나무 잎 추출물을 처리한후 염증 반응 유도 인자인 lipopolysaccharides (LPS)를 100 ㎍/mL의 농도로 처리하여 주었다. 24 h 배양 후 배지를 이용하여 NO의 생성 정도를 측정하였다. 세포배양액 50 μL와 Griess 시약 50 μL를 혼합하여 10 min 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광값을 측정하였다.
- 원심분리 후 상등액을 취한 뒤 각 well당 50 ㎍의단백질을 취하여 12% SDS-PAGE에 전기영동 하였다. PVDF 막으로 단백질을 blot시킨 후 1 : 500, 1 : 1000의비율로 iNOS, COX-2, IkB-α antibody를 1 h 동안 상온에서 배양, peroxidase conjugated anti-rabbit 2차 항체를 이용하여 단백질을 표지하고 Labfrontier사의 western blot 확인 시약과 BioMax XAR 필름을 이용하여 결과를 확인하였다.
- 4) 185 μL에 DTPA 2 μL, DMPO 2 μL, xanthin 8 μL와 catalase 1 μL를 혼합한 후, xanthin oxidase 2 μL를 넣어 최종 부피가 200 μL가 되도록 하였다. Xanthin pxidase를 첨가하면 즉시 superoxide anion radical이 생성되기 시작하는데, 이들을 EPR을 이용하여 그 신호의 세기를 측정하였다.
- Xanthin/xanthin oxidase 방법으로 superoxide anion radical을 발생시키고, 오동나무 잎 추출물과 대조군으로 사용한 quercetin에 의한 superoxide anion radical의 제거속도를 DMPO spin trap을 이용한 EPR로 측정하였으며, 이 반응에서 함께 생성되는 금속이온과 과산화수소를 제거하기 위해 DTPA와 catalase를 첨가하여 주었다. 0.
- 7 세포가 들어있는 부유액 100 μL를 넣고 24 h 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고, 무혈청 배지에 최종 농도가 20, 50, 100 ㎍/mL으로 되도록 오동나무 잎 추출물을 처리한후 염증 반응 유도 인자인 lipopolysaccharides (LPS)를 100 ㎍/mL의 농도로 처리하여 주었다. 24 h 배양 후 배지를 이용하여 NO의 생성 정도를 측정하였다.
- 7 세포와 CCD~986sk 세포가 들어있는 부유액 100 μL를 넣고 24 h 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고, 적당한 농도(20, 50, 100 ㎍/mL)로 희석되어진 오동나무 잎 추출물이 첨가된 무혈청 배지에서 24 h 배양하였다. 배양 후 MTT 시약을 각 well에 첨가하고, 4 h 동안 항온기에서 반응시킨 후, MTT 시약이 함유된 배지를 제거하였다.
- 7 세포가 들어있는 부유액 1 mL을 넣고 24 h 배양하였다. 배양후 배지를 제거하고, 무혈청 배지에 최종 농도가 20, 50, 100 ㎍/mL으로 되도록 오동나무 잎 추출물을 처리한 후염증 반응 유도 인자인 lipopolysaccharides (LPS)를 100 ng/mL의 농도로 처리하여 주었다. 24 h 배양 후 PGE2 kit 시약을 이용하여 PGE2의 생성 정도를 측정하였다.
- 세포배양액 50 μL와 Griess 시약 50 μL를 혼합하여 10 min 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광값을 측정하였다. 양성 대조군으로는 NO 생성 억제제인 NG-methyl-L-arginine acetate salt (L-NMMA)를 50, μM 이 되도록 시료와 같은 방법으로 처리하여 NO 생성 저해능을 비교하였다.
- 오동나무 잎 추출물의 NO 생성 저해능을 확인하고 또다른 염증 유발 매개체인 PGE2의 생성 억제 효능을 평가하였다. LPS로 활성화된 Raw 264.
- 오동나무 잎 추출물의 항염 효능을 평가하기 위하여 Raw 264.7 세포에 LPS를 처리하여 주고 세포 배양 배지내에 존재하는 NO의 생성양을 Griess reagent로 측정하였다. LPS 처리시 세포내 NO 생성량이 급격히 증가하는것을 확인하였으며 양성 대조군으로 사용된 NMMA 처리시 NO의 생성량이 51% 감소하는 것을 확인하였다(Figure 2).
- 원심분리 후 상등액을 취한 뒤 각 well당 50 ㎍의단백질을 취하여 12% SDS-PAGE에 전기영동 하였다. PVDF 막으로 단백질을 blot시킨 후 1 : 500, 1 : 1000의비율로 iNOS, COX-2, IkB-α antibody를 1 h 동안 상온에서 배양, peroxidase conjugated anti-rabbit 2차 항체를 이용하여 단백질을 표지하고 Labfrontier사의 western blot 확인 시약과 BioMax XAR 필름을 이용하여 결과를 확인하였다.
- 7)에 대한 시료의 농도 증가에 따른 세포 독성을 평가한 결과 20~100 ㎍/mL의 범위내에서 두 세포 모두 세포 생존율이 90% 이상임을 확인하였다(Figure 1). 이로써 오동나무 잎 추출물에 큰 세포 독성을 나타내는 물질이 존재하지 않음을 확인하였으며 따라서 이후 실험에서는 20~100 ㎍/mL의 범위내에서 오동나무 잎 추출물의 항염 효능 평가를 실시하였다.
- 가지고 있다. 이를 이용하여 superoxide anion radical 소거에 따른 DMPO-OOH'의 EPR 신호 세기의 감소를 통해 오동나무 잎 추출물의 superoxide anion radical 소거활성을 정량적으로 측정하였다. 양성대조군으로서 높은 항산화능을 갖고 있는 플라보노이드 계열 물질인 quercetin을 사용하였다.
- 전자상자성공명법 (electron paramagnetic resonance, EPR)을 이용한 su-peroxide anion radical 소거능을 확인하여 항산화능을 살펴보았으며 항염 효능으로서 대식세포주를 이용한 염증반응의 신호전달 과정을 탐색하여 어떠한 과정에서의 신호 전달을 막아주는지 알아보았다.
대상 데이터
- Raw 264.7 세포는 한국 세포주 은행 (Korean cell line bank: KCLB)에서 분양 받아 사용하였으며 CCD-986sk 세포는 미국 표준 균주(American type culture collec-tion: ATCC)에서 분양받아 사용하였다. 10% fetal bovine serum, penicillin (100 units/mL), streptomycin (100 ㎍/mL)이 첨가된 Dulbecco's modified Eagles medium (DMEM) 배지와 Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) 배지로 5% CO2, 37℃에서 배양하였다.
- 음건하였다. 건조된 잎을 분말로 만들어 70% 에탄올(1 : 20 w/v)로 추출하여 실험에 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 오동나무CPaWawiia coreana Uyeki) 잎은 정선군 농업 기술 센터로부터 공급받아 음건하였다. 건조된 잎을 분말로 만들어 70% 에탄올(1 : 20 w/v)로 추출하여 실험에 사용하였다.
- 10% fetal bovine serum, penicillin (100 units/mL), streptomycin (100 ㎍/mL)이 첨가된 Dulbecco's modified Eagles medium (DMEM) 배지와 Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) 배지로 5% CO2, 37℃에서 배양하였다. 실험에 사용된 시약들은 dimethyl sulfoxide (DMSO)는 Merck (USA), FeCI2, 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oxdde (DMPO), diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), xanthin, xan- thin oxidase, catalase, lipopolysaccharides (LPS), 3-(4,5- dimethyl thiazo-2-yl)-2,5-dipheny] tetrazolium bromide (MTT)는 Sigma (USA)에서 구입하여 사용하였고, COX- 2, iNOS, IkB-α monoclonal antibodies 및 peroxidase conjugated secondary antibody는 Santa Cruz Biotech-nology (CA, USA)에서 구입하였다.
- 이를 이용하여 superoxide anion radical 소거에 따른 DMPO-OOH'의 EPR 신호 세기의 감소를 통해 오동나무 잎 추출물의 superoxide anion radical 소거활성을 정량적으로 측정하였다. 양성대조군으로서 높은 항산화능을 갖고 있는 플라보노이드 계열 물질인 quercetin을 사용하였다. 평가 결과 quercetin 10 ㎍/mL의 농도에서 62.
이론/모형
- NO와 PGE2 생성 저해능이 확인된 오동나무 잎 추출물을 이용하여 iNOS, COX-2 단백질의 발현에 영향을 미치는지 여부를 western blotting 기법을 이용하여 평가하였다. LPS에 의해 iNOS와 COX-2 단백질의 발현양이 뚜렷히 증가하였으며 iNOS의 경우 오동나무 잎 추출물의 낮은 농도인 20 ㎍/mL의 농도에서도 급격하게 그 발현양이 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Figure 4).
성능/효과
- LPS를 처리하지 않은 시험군에서와 같은 수준으로 iNOS 단백질의 발현양이 상당히 많이 감소한 것을 확인하였다. COX-2 단백질의 발현여부를 확인한 결과 100 ㎍/rnL의 농도에서 단백질의 발현양이 감소하였으며 이는 PGE2 결과와 일치함을 보여주고 있다. 또한 염증 반응 신호 전달 과정의 초기 단계에 해당하는 IkB-α 단백질의 분해를 오동나무 잎 추출물이 억제하는지 여부를 알아보았다.
- 7 세포에 LPS를 처리하여 주고 세포 배양 배지내에 존재하는 NO의 생성양을 Griess reagent로 측정하였다. LPS 처리시 세포내 NO 생성량이 급격히 증가하는것을 확인하였으며 양성 대조군으로 사용된 NMMA 처리시 NO의 생성량이 51% 감소하는 것을 확인하였다(Figure 2). 오동나무 잎 추출물의 효능을 확인한 결과 20 ㎍/mL 의 농도에서 50%의 NO 생성 저해능을 나타냄으로써 NMMA 50 과 유사한 효능을 나타내었다.
- 또한 염증 반응 신호 전달 과정의 초기 단계에 해당하는 IkB-α 단백질의 분해를 오동나무 잎 추출물이 억제하는지 여부를 알아보았다. LPS 처리후 시간별로 IkB-α 단백질의 분해정도를 확인한 결과 LPS 처리 30 min 후 IkB* 단백질이 분해됨을 확인하였으며 오동나무 잎 추출물 처리시 IkB-α 단백질의 분해를 억제시켜줌을 확인하였다(Figure 5).
- LPS로 활성화된 Raw 264.7 세포에서 PGE2의 생합성이 증가하게 됨을 확인하였으며 오동나무 잎 추출물처리시 낮은 농도인 20, 50 ㎍/mL의 농도에서는 LPS만을 처리하였을 때와 PGE2의 생성량이 큰 차이를 나타내지 않았지만 100 ㎍/mL의 농도에서 약 40% 정도 PGE2 생성을 감소시킴을 확인하였다(Figure 3). 이는 오동나무잎 추출물이 NO 생성에 관련된 신호 전달 과정 뿐만 아니라 PGE2의 생성에 관여하는 경로에도 영향을 나타냄을알 수 있었다.
- LPS에 의해 iNOS와 COX-2 단백질의 발현양이 뚜렷히 증가하였으며 iNOS의 경우 오동나무 잎 추출물의 낮은 농도인 20 ㎍/mL의 농도에서도 급격하게 그 발현양이 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Figure 4). LPS를 처리하지 않은 시험군에서와 같은 수준으로 iNOS 단백질의 발현양이 상당히 많이 감소한 것을 확인하였다. COX-2 단백질의 발현여부를 확인한 결과 100 ㎍/rnL의 농도에서 단백질의 발현양이 감소하였으며 이는 PGE2 결과와 일치함을 보여주고 있다.
- LPS에 의해 iNOS와 COX-2 단백질의 발현양이 뚜렷히 증가하였으며 iNOS의 경우 오동나무 잎 추출물의 낮은 농도인 20 ㎍/mL의 농도에서도 급격하게 그 발현양이 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Figure 4). LPS를 처리하지 않은 시험군에서와 같은 수준으로 iNOS 단백질의 발현양이 상당히 많이 감소한 것을 확인하였다.
- 또한 추출물의 항염 효능을 평가한 결과 우수한 NO 생성 저해능을 확인할 수 있었으며, 또 다른 염증 유발 매개체인 PGE2의 생성도 저해함을 확인하였다. NO와 PGE2를 생성하는 iNOS와 COX-2의 단백질 발현양을 측정한 결과 역시 오동나무 잎 추출물이 단백질의 발현을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 위에서 확인된 오동나무 잎 추출물의 항염 효능은 염증 반응 신호 전달의 초기 단계인 IkB-α 의 분해를 억제함으로서 나타내는 것을 확인하였다.
- 오동나무 잎 추출물의 효능을 확인한 결과 20 ㎍/mL 의 농도에서 50%의 NO 생성 저해능을 나타냄으로써 NMMA 50 과 유사한 효능을 나타내었다. 또한 50 μM/mL의 농도에서는 약 90%의 우수한 NO 생성 저해능을 나타냄으로써 오동나무 잎 추출물의 항염 효능이 뛰어남을 짐작할 수 있었다.
- NO와 PGE2를 생성하는 iNOS와 COX-2의 단백질 발현양을 측정한 결과 역시 오동나무 잎 추출물이 단백질의 발현을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 위에서 확인된 오동나무 잎 추출물의 항염 효능은 염증 반응 신호 전달의 초기 단계인 IkB-α 의 분해를 억제함으로서 나타내는 것을 확인하였다. 따라서 이와 같은 오동나무잎 추출물의 항산화 효능과 항염 효능을 이용하여 피부자극 완화 소재로서의 적용 가능성을 확인하였다.
- 이는 오동나무 잎에 존재하는 catechin, epicatechin, api- genin, coumaric acid 등과 같은 물질에 의한 효능으로 사료되어진다[1]. 또한 추출물의 항염 효능을 평가한 결과 우수한 NO 생성 저해능을 확인할 수 있었으며, 또 다른 염증 유발 매개체인 PGE2의 생성도 저해함을 확인하였다. NO와 PGE2를 생성하는 iNOS와 COX-2의 단백질 발현양을 측정한 결과 역시 오동나무 잎 추출물이 단백질의 발현을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
- 사람 유래의 섬유아세포(CCD-986sk)와 쥐 유래의 대식세포(Raw 264.7)에 대한 시료의 농도 증가에 따른 세포 독성을 평가한 결과 20~100 ㎍/mL의 범위내에서 두 세포 모두 세포 생존율이 90% 이상임을 확인하였다(Figure 1). 이로써 오동나무 잎 추출물에 큰 세포 독성을 나타내는 물질이 존재하지 않음을 확인하였으며 따라서 이후 실험에서는 20~100 ㎍/mL의 범위내에서 오동나무 잎 추출물의 항염 효능 평가를 실시하였다.
- 4%의 radical 소거능을 확인하였으며, 오동나무 잎 추출물의 경우 100 ㎍/mL의 농도에서 43%의 radical 소거능을 나타내었다. 양성 대조군으로 사용되어진 quercetin의 효능과는 많은 차이를 나타내었지만 오동나무 잎 추출물 자체에도 어느 정도의 항산화 효능이 존재함을 확인할 수 있었다(Table 1).
- 오동나무에 대한 성분 연구는 오동나무 묘목으로부터 tomentoside, iridoid glycoside의 연구와 오동나무 꽃에서 sesquiterpene lactone, quinone계 화합물의 연구가 보고되었다[2, 3]. 오동나무 꽃에 존재하는 항암 성분을 연구한 논문에서 5가지 human cell line을 이용하여 오동나무 꽃의 항암 효능을 확인한 결과 4가지 암세포에 대한 항암 효능을 sulforhodamine B (SRB) bioassay를 통하여 확인하였으며 2a-hydroxy-4(15), ll (13) -eudesmadien-8β, 12-olide, chrysophan-ol, emodin, phy- scion의 화합물에서 항암 효능을 나타내었음을 확인하였다[2]. 또한 오동나무 잎에서의 flavonoid류 화합물과 phenolic acid류 화합물들을 단리하여 구조를 규명하는 연구가 2005년에 보고된 바 있다[4]
- 오동나무 잎 추출물의 superoxide anion radical 소거능을 평가한 결과 그다지 높은 소거능은 아니지만 오동나무 잎 추출물에서의 항산화 효능을 확인할 수 있었다. 이는 오동나무 잎에 존재하는 catechin, epicatechin, api- genin, coumaric acid 등과 같은 물질에 의한 효능으로 사료되어진다[1].
- LPS 처리시 세포내 NO 생성량이 급격히 증가하는것을 확인하였으며 양성 대조군으로 사용된 NMMA 처리시 NO의 생성량이 51% 감소하는 것을 확인하였다(Figure 2). 오동나무 잎 추출물의 효능을 확인한 결과 20 ㎍/mL 의 농도에서 50%의 NO 생성 저해능을 나타냄으로써 NMMA 50 과 유사한 효능을 나타내었다. 또한 50 μM/mL의 농도에서는 약 90%의 우수한 NO 생성 저해능을 나타냄으로써 오동나무 잎 추출물의 항염 효능이 뛰어남을 짐작할 수 있었다.
- 양성대조군으로서 높은 항산화능을 갖고 있는 플라보노이드 계열 물질인 quercetin을 사용하였다. 평가 결과 quercetin 10 ㎍/mL의 농도에서 62.4%의 radical 소거능을 확인하였으며, 오동나무 잎 추출물의 경우 100 ㎍/mL의 농도에서 43%의 radical 소거능을 나타내었다. 양성 대조군으로 사용되어진 quercetin의 효능과는 많은 차이를 나타내었지만 오동나무 잎 추출물 자체에도 어느 정도의 항산화 효능이 존재함을 확인할 수 있었다(Table 1).
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