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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 열수추출 외 뚜렷한 추출방법이 확립되지 않은 녹용 추출에 계내금 조효소를 활용할 수 있는 방안을 모색하기 위해, 물과 계내금 조효소, 계내금 정제효소 그리고 전통적인 방법으로 녹용을 추출하여 추출물의 특성을 비교함으로써 녹용 추출에 계내금 조효소를 활용할 수 있는 방안을 조사하였다.
제안 방법
- 방냉 후 500 mL 농축 플라스크에 분해액을 넣고, 증류수로 수차례 세척후 60℃ 감압 농축기에서 감압 후 증류수를 가해 다시 3회 농축하였다. 건고물을 희석 완충용액에 넣어 완전히 녹이고, 0.45 ㎛ membrane filter로 여과한 후 아미노산 분석기를 이용하여 분석하였다. 표준액은 hydroxyproline과 hydroxylysine 일정량을 sample dilution buffer(pH 2.
- 계내금 조효소가 콜라겐에 대해 높은 기질 특이성을 보인 예비실험을 바탕으로 계내금 효소액을 이용한 녹용 추출액의 콜라겐 함량을 측정하였다. 시료 0.
- 계내금 조효소를 이용한 녹용의 추출 실험방법은 65℃ 증류수에서 9시간 추출한 조건(DW), 65℃ 계내금 조효소액에서 9시간 추출한 조건(CK), 전통적인 녹용 추출방법인 121℃, 2시간 추출한 조건(TM), 정제된 계내금 protease를 용매로 65℃, 9시간 녹용을 추출한 조건(PK)으로 구분하였다. 모든 추출조건에서 용질은 녹용 분말 6 g을 사용하였으며, 용매량은 150 mL로 하였다.
- 모든 추출조건에서 용질은 녹용 분말 6 g을 사용하였으며, 용매량은 150 mL로 하였다. 다양한 조건으로 녹용을 추출한 후 가용성 고형분 함량과 녹용 추출물의 색도, 단백질 함량 등을 조사하였다.
- 본 연구에서는 계내금으로부터 추출한 조효소액의 녹용 추출 특성을 조사하기 위해 4가지 조건으로 실험한 후 추출물의 가용성 고형분, 색도, 단백질 함량, 아미노산 함량, 무기질 함량, 콜라겐 함량을 비교 분석하였다. 선행된 실험에서 얻은 녹용 최적 추출 조건인 65℃, 100 rpm에서 9시간 실험을 실시하였으며, 녹용을 증류수에서 추출한 조건(sample DW), 계내금 조효소액으로 추출한 조건(sample CK), 전통적인 열수 추출방법인 121℃에서 2시간 추출한 조건(sample TM), 계내금 정제 효소로 녹용을 추출한 조건(sample PK) 등 4가지 방법으로 진행하였다.
- 추출액을 냉각, 여과, 감압 농축시켜 증류수로 100 mL 되게 정용한 후 이중 50 mL를 취하고, 여기에 25% trichloroacetic acid(TCA) 용액을 동량 가하여 1시간 동안 냉장 보관하면서 단백질을 침전시킨 다음 원심분리(3,000 rpm, 20 min)하였다. 상등액을 감압하에서 농축 건조시킨 다음 lithium citrate buffer(pH 2.2)에 용해시키고 0.22 ㎛ membrane filter로 여과하여 아미노산 분석기(Sykam Amino Acid Analyzer)로 UV 570 nm, 440 nm조건하에서 검출하였다.
- 본 연구에서는 계내금으로부터 추출한 조효소액의 녹용 추출 특성을 조사하기 위해 4가지 조건으로 실험한 후 추출물의 가용성 고형분, 색도, 단백질 함량, 아미노산 함량, 무기질 함량, 콜라겐 함량을 비교 분석하였다. 선행된 실험에서 얻은 녹용 최적 추출 조건인 65℃, 100 rpm에서 9시간 실험을 실시하였으며, 녹용을 증류수에서 추출한 조건(sample DW), 계내금 조효소액으로 추출한 조건(sample CK), 전통적인 열수 추출방법인 121℃에서 2시간 추출한 조건(sample TM), 계내금 정제 효소로 녹용을 추출한 조건(sample PK) 등 4가지 방법으로 진행하였다.
- 분해액을 방냉시킨 후 250 mL 플라스크에 증류수로 표선을 맞추었다. 시료액 일정량을 10 mL volumetric flask에 취한 후 증류수로 표선까지 희석하여 유도결합 플라즈마 분석기(Jobin-Yvon JY38S)를 이용해 분석 하였다.
- 전통적인 녹용 추출방법인 열수추출과 계내금 조소효액, 계내금 정제 효소를 이용하여 각각 추출한 녹용 추출액의 품질 특성을 비교한 결과 다음과 같은 결과를 얻었다.
대상 데이터
- 계내금 조효소를 이용한 녹용의 추출 실험방법은 65℃ 증류수에서 9시간 추출한 조건(DW), 65℃ 계내금 조효소액에서 9시간 추출한 조건(CK), 전통적인 녹용 추출방법인 121℃, 2시간 추출한 조건(TM), 정제된 계내금 protease를 용매로 65℃, 9시간 녹용을 추출한 조건(PK)으로 구분하였다. 모든 추출조건에서 용질은 녹용 분말 6 g을 사용하였으며, 용매량은 150 mL로 하였다. 다양한 조건으로 녹용을 추출한 후 가용성 고형분 함량과 녹용 추출물의 색도, 단백질 함량 등을 조사하였다.
- 본 연구에 사용한 계내금과 녹용은 풍산제약사(경북 안동시)에서 구입하였다.
이론/모형
- 계내금 효소를 이용하여 녹용 추출물의 무기질 함량 측정은 2 g의 시료를 도가니에 넣은 후 600℃ 전기로에서 2시간 회화한 조회분량을 중량법에 따라 정량하였다(건식분해). 조회분을 250 mL 용량 플라스크에 옮기고 1：1 염산용액 10 mL를 가하여 후드 상에서 가열분해 하였다(습식분해).
- 계내금 효소의 정제는 상기에서 획득한 계내금 조효소액으로부터 김 등24)의 방법에 의해 SP-Sepharose를 이용한 open column을 이용하여 정제하였다.
성능/효과
- 1. 계내금 조효소액 처리군에서 가용성 고형분 함량과 당도가 높은 것으로 나타났으며, 유리 아미노산 함량의 경우 계내금 효소 처리시 5배 이상 높은 것으로 나타났다.
- 2. 계내금 protease를 이용하여 녹용을 추출한 경우, 계내금 효소 무처리군에 비해 무기질 함량이 3배 이상 높았으며, Ca의 경우 최고 100배 이상 함량이 높았다.
- 3. 녹용에서 추출한 콜라겐 함량은 계내금 효소 처리의 경우 다른 실험군에 비해 2배 이상 높은 것으로 나타나 계내금 protease가 녹용에서 콜라겐 성분을 추출하는데 유용한 효소인 것으로 판단된다.
- 또한 추출방법에 따른 유리 아미노산 함량 결과는 Table 3에 나타내었다. 계내금 조효소가 계내금 정제 효소에 비해 2.2배 이상 유리 아미노산 함량이 높았으며, 일반적인 녹용 추출 방법인 열수 추출방법보다는 5배 이상 높은 것으로 나타났다.
- 아미노산 중에서 histidine이 각각의 조건에서 가장 높은 함량을 나타내었고, 그 외에 glutamic acid, proline, alanine 등이 추출되었다. 계내금 조효소를 이용하여 녹용을 추출한 경우 전통적인 열수 추출방법에 비해 5배 이상 총 아미노산 함량이 높게 나타났으며, 정제 효소 보다는 2배 이상 높은 것으로 보아 계내금 조효소액이 녹용에서 아미노산 추출 능력이 뛰어난 것으로 나타났다. 그러나, 필수 아미노산의 함량을 조사한 결과 계내금 조효소 실험군과 정제 효소 실험군에서 뚜렷한 차이점이 없는 것으로 보아 계내금 정제 효소액의 경제적인 대량 생산 방법이 확립될 경우 산업화 가능성이 높은 것으로 판단된다.
- 계내금 효소가 첨가되지 않은 경우 가용성 고형분, 당도, 색도 값이 거의 나타나지 않았으나, 계내금 조효소를 이용하여 녹용을 추출한 경우 가용성 고형분, 당도 값이 각각 3.47배, 6.31배 증가하는 것으로 보아 계내금 조효소가 녹용 추출 능력이 뛰어난 것으로 나타났다(Table 1).
- 계내금 조효소를 이용하여 녹용을 추출한 경우 전통적인 열수 추출방법에 비해 5배 이상 총 아미노산 함량이 높게 나타났으며, 정제 효소 보다는 2배 이상 높은 것으로 보아 계내금 조효소액이 녹용에서 아미노산 추출 능력이 뛰어난 것으로 나타났다. 그러나, 필수 아미노산의 함량을 조사한 결과 계내금 조효소 실험군과 정제 효소 실험군에서 뚜렷한 차이점이 없는 것으로 보아 계내금 정제 효소액의 경제적인 대량 생산 방법이 확립될 경우 산업화 가능성이 높은 것으로 판단된다.
- 그리고 정제 효소의 실험군은 Na의 함량이 다른 대조군에 비해 3.6배 ∼ 44.3배 높았다.
- 녹용의 추출 조건에 따른 품질 변화를 보기 위하여 4가지 조건으로 실험한 후 추출 전 후의 계내금 조효소 활성도와 단백질 함량, 가용성 고형분, 색도 등을 조사한 결과(Table 1), 계내금 효소가 첨가된 추출조건(CK, TM)에 비해 계내금 효소가 첨가되지 않은 추출조건(DE, TM)에서는 가용성 고형분, 당도, 색도 값이 거의 나타나지 않았으나, 계내금 조효소를 이용하여 녹용을 추출한 경우 전통적인 열수 추출방법에 비해 가용성 고형분, 당도 값이 각각 3.47배, 6.31배 증가하는 것으로 나타났다.
- 무기질 함량을 비교한 결과, 계내금 정제 효소에서 무기질 함량이 높은 것으로 나타났으나, 계내금 효소를 처리하지 않은 실험군에 비해 3배 이상 함량이 높게 나타나 계내금 protease 가 녹용에서 무기질 성분을 잘 추출하는 것으로 나타났다.
- 서로 다른 4가지 조건으로 추출한 녹용 추출물의 총 아미노산 함량을 조사한 결과(Table 2), 총 아미노산의 함량은 CK, PK, TM, DW 순으로 높았으며, 그중 필수 아미노산의 함량은 CK, PK, DW, TM 순으로 높았다. 아미노산 중에서 histidine이 각각의 조건에서 가장 높은 함량을 나타내었고, 그 외에 glutamic acid, proline, alanine 등이 추출되었다.
- 서로 다른 방법으로 녹용을 추출한 후 추출액에서 콜라겐 단백질 함량의 기준 아미노산인 hydroxyproline과 hydroxylysine 함량을 조사한 결과(Table 5), Hydroxyproline의 함량은 계내금 조효소액 추출 실험구에서 129.5 mg/dL로 가장 높았으며, 계내금 무처리와 정제효소 처리구에서 각각 32.4, 67.5 mg/dL를 보여 큰 차이는 없었다. Hydroxylysine 함량은 계내금 조효소액 처리구가 다른 처리구에 비해 가장 높았다.
- 실험 조건별로 녹용에서 추출한 무기질 함량을 분석한 결과(Table 4), 계내금 조효소액으로 추출한 경우 Ca의 함량이 다른 실험군에 비해 10.7배 ∼ 161.7배 높았다.
- 서로 다른 4가지 조건으로 추출한 녹용 추출물의 총 아미노산 함량을 조사한 결과(Table 2), 총 아미노산의 함량은 CK, PK, TM, DW 순으로 높았으며, 그중 필수 아미노산의 함량은 CK, PK, DW, TM 순으로 높았다. 아미노산 중에서 histidine이 각각의 조건에서 가장 높은 함량을 나타내었고, 그 외에 glutamic acid, proline, alanine 등이 추출되었다. 특히, 계내금 조효소를 이용하여 녹용을 추출한 경우, 전통적인 열수 추출방법에 비해 4.
- 현재 널리 사용되고 있는 수용성 콜라겐은 주로 송아지나 돼지 껍질에서 얻어지고 있는데, acid soluble의 양은 신선한 가죽 1 kg에서 12 g밖에 얻을수 없으며, 동물이 도살된 후 전 처리 과정이 복잡하여 콜라겐 추출 비용이 높으며, 신선한 콜라겐을 얻기 위해서는 100시간 이상의 많은 시간이 소요되는 단점이 있다. 이상의 결과를 볼 때 계내금에서 추출한 protease가 수용성 콜라겐의 분해 능력이 뛰어나며, 이를 이용하여 생산한 콜라겐은 추출시간과 비용을 줄일 수 있으므로 효율적인 콜라겐 생산 효소로 이용될 것으로 판단된다.
- 3배 높았다. 총 무기질 함량은 정제효소, 조효소, 전통적 추출, 열수추출 순으로 높았으며, 특히 정제효소는 조효소 실험군에 비해 2.6배 높은 총 무기질 함량을 나타내었다.
- 아미노산 중에서 histidine이 각각의 조건에서 가장 높은 함량을 나타내었고, 그 외에 glutamic acid, proline, alanine 등이 추출되었다. 특히, 계내금 조효소를 이용하여 녹용을 추출한 경우, 전통적인 열수 추출방법에 비해 4.7배, 정제 효소 보다는 2.4배 총아미노산 함량이 높게 나타났다.
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