인간 간암세포주 HepG2에서 NADPH oxidase 활성 억제에 의한 heme oxygenase-1 발현의 조절 Effect of NADPH Oxidase Inhibition on Heme Oxygenase-1 Expression in Human Hepatoma Cell Line HepG2원문보기
CoPP는 다양한 세포에서 HO-1의 유전자 발현과 활성을 증가시키는 강력한 유도제로 알려져 있다. HO-1는 세포 및 조직의 손상을 보호한다는 연구가 활발히 진행되고 있으나, 그 작용 기전에 대해서는 아직 잘 모르고 있다. 본 논문에서는 porphyrin 계열의 CoPP의 자극에 의해 유도되는 HO-1 유전자 발현에서 NADPH oxidase의 활성이 미치는 영향을 인간 간암세포주 HepG2에서 조사하였다. 배양 중인 HepG2 세포에서 CoPP는 HO-1의 발현을 농도의존적으로 증가시키는 것을 확인하였다. NADPH oxidase 저해제로 잘 알려져 있는 DPI를 전처리한 후 CoPP로 자극한 세포에서는 HO-1의 발현이 강력하게 억제되는 것으로 나타났다. DPI의 이런 억제 효과가 HO-1의 전사 조절인자 Nrf2의 활성에도 영향을 줄 수 있기 때문에 DPI를 전처리 한 후 CoPP 자극에 의한 Nrf2의 핵으로의 이동을 분석하였다. 그 결과, DPI는 CoPP에 의해 유도되는 Nrf2의 핵으로의 이동과 세포 내 존재하는 양을 감소시키는 것을 확인하였다. 다른 HO-1 발현 유도제로 알려져 있는 hemin에 의한 자극의 경우에도 DPI는 HepG2 세포의 HO-1의 발현을 억제하는 효과를 나타내었다. 그리고, $p47^{phox}$에 대한 siRNA를 사용하여 효과적으로 $p47^{phox}$ 유전자 발현을 knockdown 시켜서 NADPH oxidase의 활성을 억제시키는 방법을 사용하였다. 그 결과, $p47^{phox}$ silencing한 세포에 CoPP를 처리한 경우는 control siRNA를 처리한 세포와 비교할 때 HO-1 발현이 현저히 감소됨을 관찰할 수 있었다. 마지막으로, 세포 내 ROS 생성을 억제하는 GSHmee가 처리된 세포에서는 CoPP나 hemin이 Nrf2의 활성을 증가시키지 못하였고, 그 결과 HO-1의 발현을 유도하지 못하는 것을 알 수 있었는데, 이는 ROS가 CoPP나 hemin에 의한 HO-1 유전자 발현 과정에 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다. 이를 종합해 볼 때, 인간 간암세포주 HepG2에서 CoPP나 hemin의 자극에 의한 HO-1 유전자의 발현에는 NADPH oxidase의 활성이 요구된다는 것을 알 수 있고, 그 활성은 세포 내 ROS를 생성시키는 것으로 역할을 한다고 여겨진다.
CoPP는 다양한 세포에서 HO-1의 유전자 발현과 활성을 증가시키는 강력한 유도제로 알려져 있다. HO-1는 세포 및 조직의 손상을 보호한다는 연구가 활발히 진행되고 있으나, 그 작용 기전에 대해서는 아직 잘 모르고 있다. 본 논문에서는 porphyrin 계열의 CoPP의 자극에 의해 유도되는 HO-1 유전자 발현에서 NADPH oxidase의 활성이 미치는 영향을 인간 간암세포주 HepG2에서 조사하였다. 배양 중인 HepG2 세포에서 CoPP는 HO-1의 발현을 농도의존적으로 증가시키는 것을 확인하였다. NADPH oxidase 저해제로 잘 알려져 있는 DPI를 전처리한 후 CoPP로 자극한 세포에서는 HO-1의 발현이 강력하게 억제되는 것으로 나타났다. DPI의 이런 억제 효과가 HO-1의 전사 조절인자 Nrf2의 활성에도 영향을 줄 수 있기 때문에 DPI를 전처리 한 후 CoPP 자극에 의한 Nrf2의 핵으로의 이동을 분석하였다. 그 결과, DPI는 CoPP에 의해 유도되는 Nrf2의 핵으로의 이동과 세포 내 존재하는 양을 감소시키는 것을 확인하였다. 다른 HO-1 발현 유도제로 알려져 있는 hemin에 의한 자극의 경우에도 DPI는 HepG2 세포의 HO-1의 발현을 억제하는 효과를 나타내었다. 그리고, $p47^{phox}$에 대한 siRNA를 사용하여 효과적으로 $p47^{phox}$ 유전자 발현을 knockdown 시켜서 NADPH oxidase의 활성을 억제시키는 방법을 사용하였다. 그 결과, $p47^{phox}$ silencing한 세포에 CoPP를 처리한 경우는 control siRNA를 처리한 세포와 비교할 때 HO-1 발현이 현저히 감소됨을 관찰할 수 있었다. 마지막으로, 세포 내 ROS 생성을 억제하는 GSHmee가 처리된 세포에서는 CoPP나 hemin이 Nrf2의 활성을 증가시키지 못하였고, 그 결과 HO-1의 발현을 유도하지 못하는 것을 알 수 있었는데, 이는 ROS가 CoPP나 hemin에 의한 HO-1 유전자 발현 과정에 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다. 이를 종합해 볼 때, 인간 간암세포주 HepG2에서 CoPP나 hemin의 자극에 의한 HO-1 유전자의 발현에는 NADPH oxidase의 활성이 요구된다는 것을 알 수 있고, 그 활성은 세포 내 ROS를 생성시키는 것으로 역할을 한다고 여겨진다.
Heme oxygenase-1 (HO-1) is a stress-responsive protein that is known to regulate cellular functions such as cell proliferation, inflammation, and apoptosis. In this study, we investigated the role of NADPH oxidase on the expression of HO-1 in human liver hepatoma cell line HepG2. Diphenyleneiodonium...
Heme oxygenase-1 (HO-1) is a stress-responsive protein that is known to regulate cellular functions such as cell proliferation, inflammation, and apoptosis. In this study, we investigated the role of NADPH oxidase on the expression of HO-1 in human liver hepatoma cell line HepG2. Diphenyleneiodonium (DPI), an NADPH oxidase inhibitor, markedly inhibited HO-1 expression and the nuclear translocation of transcription factor Nrf2 in cobalt protoporphyrin (CoPP) or hemin-treated HepG2 cells. Similarly, the knockdown of $p47^{phox}$, a cytosolic factor for NADPH oxidase activity, by siRNA inhibited the CoPP-induced expression of HO-1. In addition, GSHmee, an intracellular antioxidant, blocked the expression of HO-1 in CoPP-treated cells. Based on these results, we conclude that the blockage of NADPH oxidase with DPI or $p47^{phox}$ siRNA inhibits CoPP-induced HO-1 expression in HepG2 cells, and also suggest that the expression of HO-1 in CoPP-induced HepG2 cells is associated with increase of intracellular ROS by NADPH oxidase activity.
Heme oxygenase-1 (HO-1) is a stress-responsive protein that is known to regulate cellular functions such as cell proliferation, inflammation, and apoptosis. In this study, we investigated the role of NADPH oxidase on the expression of HO-1 in human liver hepatoma cell line HepG2. Diphenyleneiodonium (DPI), an NADPH oxidase inhibitor, markedly inhibited HO-1 expression and the nuclear translocation of transcription factor Nrf2 in cobalt protoporphyrin (CoPP) or hemin-treated HepG2 cells. Similarly, the knockdown of $p47^{phox}$, a cytosolic factor for NADPH oxidase activity, by siRNA inhibited the CoPP-induced expression of HO-1. In addition, GSHmee, an intracellular antioxidant, blocked the expression of HO-1 in CoPP-treated cells. Based on these results, we conclude that the blockage of NADPH oxidase with DPI or $p47^{phox}$ siRNA inhibits CoPP-induced HO-1 expression in HepG2 cells, and also suggest that the expression of HO-1 in CoPP-induced HepG2 cells is associated with increase of intracellular ROS by NADPH oxidase activity.
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문제 정의
본 연구에서 사용한 이들 NADPH oxidase의 억제 효과는 CoPP의 자극에 의한 HO-1의 발현을 억제시켰고, 이는 CoPP에 의한 HO-1 발현의 신호전달 과정에서 NADPH oxidase 및 그 효소에 의해 생성되는 ROS가 필요하다는 것을 시사한다. 그래서, 세포 내 ROS를 감소시키는 것으로 알려진 항산화 인자 GSH의 효과를 알아보았다 [28]. GSH는 세포 내로 들어갈 수 없기 때문에 본 실험을 위해서 세포막을 투과할 수 있는 GSH의 ester form인 GSHmee를사용하였다.
본 연구에서는 인간 간암세포주인 HepG2에서 DPI 또는 p47phox에 대한 small interfering RNA (siRNA)를 사용하여 세포 내 NADPH oxidase의 활성 억제가 CoPP 등에 의해 유도되는 HO-1의 증가에 미치는 영향을 조사하였다. 또한 CoPP에의한 HO-1 유전자 발현 과정에는 NADPH oxidase에 의한 세포 내 ROS의 생성이 요구된다는 것을 보여준다.
제안 방법
HO-1 발현 과정에 NADPH oxidase의 관련성을 확증하기 위하여 siRNA를 이용하였다. NADPH oxidase는 막부착 단백질인 p91phox, p22phox와 세포질 인자인 GTPase Rac1, p67phox, p47phox로 구성되어 있으며[21], p47phox의 발현을 knockdown시켜서 NADPH oxidase의 활성을 억제시킬 수 있다[3].
HepG2 세포를 1×105 cells/ml의 농도로60-mm dish에 분주한 뒤 12시간 배양한 후, 준비한 p47phox siRNA를 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) 제품인 Lipofectamin 2000 reagent를 이용하여 제조사가 추천하는 protocol에 의거 하여 transfection 하였다.
그리고 Western blot analysis를 이용하여 분석 하였고, 세포질 및 핵 단백질 오염을 측정하기 위하여 histone 과 β-actin에 대한 항체를 각각 사용하였다.
다음으로 CoPP 자극에 의한 HO-1 유전자 발현의 DPI에 의한 억제가 HO-1의 전사인자 Nrf2에 미치는 영향을 조사하였다. 자극에 의한 HO-1의 유전자 발현의 개시는 전사인자 Nrf2의 핵으로의 이동과 더불어 세포 내 양적 증가도 수반되는 것으로 알려져 있다.
본연구에서 p47phox의 발현을 억제하기 위하여 p47phox mRNA와 간섭하는 oligonucleotides 즉, siRNA를 사용하여 NADPHoxidase의 활성을 억제시켰다.
Membrane은 항체의 비특이적인 부착을 막기 위하여 5% skim milk에 1시간 동안 두었고, 그후 필요한 일차 항체 및 horse radish peroxide (HRP)가 부착 되어 있는 2차 rabbit 항체를 반응시켰다. 부착된 면역복합체는 ECL kit를 사용하여 Fujifilm Las3000 (Fujifilm, Tokyo, Japan) 기기에서 단백질 발현을 분석하였다.
고정된 세포에 Nrf2 항체를 1시간 동안 반응시킨후 FITC가 부착되어있는 2차 rabbit 항체를 반응시켰다. 세포내 fluorescent image는 confocal microscope (Olympus, Tokyo, Japan)를 사용하여 관찰하였다.
약물을 처리한 HepG2 세포를 PBS로 세척한 후, protease inhibitor cocktail를 포함한 lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH7.4, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40)를 첨가하여 세포의 전체 단백질을 추출하였다. Bicinchoninic acid를 이용하여 정량하고, 동일한 양의 단백질을 10% SDS-polyacrylamide gel에 전기영동한 후, electroblotting apparatus (Bio-Rad, Richmond, CA, USA)를 이용하여 단백질을 nitrocellulose membrane에 이동시켰다.
약물을 처리한 세포를 PBS로 세척한 후, Fermetas (Waltham, MA, USA) 제품인 ProteoJET™ Cytoplasmic and Nuclear Protein Extraction Kit를 이용하여 제조사가 추천하는 protocol에 의거하여 세포질과 핵 단백질을 분리하였다.
대상 데이터
Enhanced chemiluminescence (ECL) Western blotting kit는 Amersham Pharmacia Biotech. (Piscataway, NJ, USA) 제품을 사용하였다.
HO-1, Nrf2, β-actin 에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) 제품을 구입하였다. Bach1과 p47phox에 대한 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA) 제품을 구입하여 사용하였다. Enhanced chemiluminescence (ECL) Western blotting kit는 Amersham Pharmacia Biotech.
그래서, 세포 내 ROS를 감소시키는 것으로 알려진 항산화 인자 GSH의 효과를 알아보았다 [28]. GSH는 세포 내로 들어갈 수 없기 때문에 본 실험을 위해서 세포막을 투과할 수 있는 GSH의 ester form인 GSHmee를사용하였다. GSHmee는 세포 내 esterase에 의해 분해되어 세포내 GSH의 양을 증가시키는 것으로 사용될 수 있다[1].
HO-1, Nrf2, β-actin 에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) 제품을 구입하였다.
세포배양에 필요한 minimum essential medium (MEM), fetal bovine serum (FBS), 항생제, trypsin-EDTA는 HyClone Laboratories Inc. (Logan, UT, USA) 제품을 구입하여 사용하였으며, HepG2 세포는 10% FBS, 100 μg/ml streptomycin/100 U/ml penicillin이 함유된 MEM 배양액에서 5% CO2 조건에서 37℃ incubator에서 배양하였다.
실험에서 사용된 인간 간암세포주 HepG2는 한국세포주은 행에서 구입하였다. 세포배양에 필요한 minimum essential medium (MEM), fetal bovine serum (FBS), 항생제, trypsin-EDTA는 HyClone Laboratories Inc.
이론/모형
배양 중인 HepG2 세포에 다양한 농도(10, 50, 100 μM)의 CoPP를 24시간 동안 처리하여, CoPP에 의한 HO-1의 발현이 농도 의존적으로 증가함을 Western blot analysis를 이용하여 확인하였다(Fig. 1A).
HO-1의 활성을 유도시키는 강력한 유도제들이 많이 알려져 있는데, 특히 porphyrin 계열의 CoPP와 hemin 등이 많이 사용된다. 본 연구에서 사용한 NADPH oxidase의 활성을 저해하기 위하여 DPI를 사용하였다[17]. 배양 중인 HepG2 세포에 다양한 농도(10, 50, 100 μM)의 CoPP를 24시간 동안 처리하여, CoPP에 의한 HO-1의 발현이 농도 의존적으로 증가함을 Western blot analysis를 이용하여 확인하였다(Fig.
성능/효과
DPI를 농도별 (1, 10, 50 μM)로 1시간 전처리 된 HepG2 세포에 CoPP를 처리한 경우에는 HO-1의 단백질 양이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 1B).
그 결과, p47phox silencing한 세포에 CoPP 를 처리한 경우는 control siRNA를 처리한 세포와 비교할 때 전사인자 Nrf2 및 HO-1 발현을 현저히 감소시키는 것으로 나타났다(Fig. 3).
핵으로 이동한 Nrf2은 Maf와 결합하여 전사억제 인자로 알려져 있는 Bach1을 밀어내고 HO-1 유전자의 ARE 부착 부위에 결합하여 유전자 발현을 개시하는 것으로 보고되고 있다[9]. 본 연구에서 HepG2 세포에 CoPP를 처리하였을 때 역시 비슷한 결과를 볼 수 있었는데, Nrf2의 핵으로의 이동과 Bach1의 세포질에서의 증가와 함께 HO-1의 증가를 관찰할 수 있었다(Fig. 2). 그러나, DPI의 전처리는 CoPP에 의해 유도되는 Bach1의 세포질로의 이동과 Nrf2의 핵으로의 이동을 완전히 억제시켰다.
silencing에 의한 NADPH oxidase 활성의 억제는 적당한 자극에 의해 NADPH oxidase에 의한 세포내 ROS의 생성을 저해시키게 된다. 본 연구에서 사용한 이들 NADPH oxidase의 억제 효과는 CoPP의 자극에 의한 HO-1의 발현을 억제시켰고, 이는 CoPP에 의한 HO-1 발현의 신호전달 과정에서 NADPH oxidase 및 그 효소에 의해 생성되는 ROS가 필요하다는 것을 시사한다. 그래서, 세포 내 ROS를 감소시키는 것으로 알려진 항산화 인자 GSH의 효과를 알아보았다 [28].
GSHmee는 세포 내 esterase에 의해 분해되어 세포내 GSH의 양을 증가시키는 것으로 사용될 수 있다[1]. 흥미롭게도, GSHmee가 처리된 세포에서는 CoPP나 hemin이 Nrf2의 활성을 증가시키지 못하였고, 그 결과 HO-1의 발현을 유도하지 못하는 것을 알 수 있었다(Fig. 4). 이 결과는 세포내 ROS가 CoPP나 hemin에 의한 HO-1 유전자 발현 과정에 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
HO-1의 발현은 무엇에 의해 조절되는가?
HO-1은 다양한 종류의 세포에서 염증성cytokines [6], 저산소 상태[11], ultraviolet radiation [30], metal [24] 등에 의해 유도된다. HO-1의 발현은 전사조절인자 NF-E2-realated factor-2 (Nrf2)에 의해 조절되며, mitogen-activated protein kinases (MAPKs)에 의해서도 조절되는 것으로 알려져 있다[20,29]. Nrf2는 redox status에 민감한 전사인자(redox-sensitive transcription factor)로써 다양한 항산화 효소의 유전자 발현에 관여한다.
HO-1은 어떤 것에 의해 유도되는가?
HO-1과 그 대사산물은 항염증 및 항세포사멸에 관련된 유전자 발현과 효소의 활성에 영향을 주는 중요한 항산화 효소로 알려져 있다[8,26]. HO-1은 다양한 종류의 세포에서 염증성cytokines [6], 저산소 상태[11], ultraviolet radiation [30], metal [24] 등에 의해 유도된다. HO-1의 발현은 전사조절인자 NF-E2-realated factor-2 (Nrf2)에 의해 조절되며, mitogen-activated protein kinases (MAPKs)에 의해서도 조절되는 것으로 알려져 있다[20,29].
heme oxygenase-1과 대사산물은 어떤 역할을 하는 항산화 효소로 알려져있는가?
HO-1과 그 대사산물은 항염증 및 항세포사멸에 관련된 유전자 발현과 효소의 활성에 영향을 주는 중요한 항산화 효소로 알려져 있다[8,26]. HO-1은 다양한 종류의 세포에서 염증성cytokines [6], 저산소 상태[11], ultraviolet radiation [30], metal [24] 등에 의해 유도된다.
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