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문제 정의
- 그러나 HACCP 적용 농장의 생물학적 위해 관리에 대한 연구 자료가 전무한 실정으로 이 분야에 대한 체계적이고 다양한 기초연구가 필요할 것으로 판단된다. 따라서 본 연구는 각 축종별(한우, 젖소, 돼지, 산란계)로 HACCP 적용 농장의 분변, 원유 및 사육환경에서 병원성세균 등 분석을 통하여 HACCP 적용 농장의 병원성 미생물 관리 실태를 파악하고 이를 농장 HACCP 시스템 적용에 관한 기초 연구 자료로 사용하는 것을 목적으로 하였다.
- 본 연구는 HACCP 시스템을 운용중인 국내 농장의 병원성미생물 오염도를 조사하여 농가의 생물학적 위해관리 수준을 파악하여 농장 HACCP 시스템 연구에 대한 기초 자료로 활용할 목적으로 실시하였다.
- 본 연구는 한우, 젖소, 돼지, 산란계 HACCP 적용 농장의 분변, 원유 및 사육환경에서 병원성세균 등 분석을 통하여 HACCP 적용 농장의 생물학적 위해 관리 실태를 파악하고자 하고 이를 농장 HACCP 시스템 적용에 관한 기초 연구 자료로 사용하는 것을 목적으로 하였다. 미생물 시료는 HACCP을 적용 중인 한우, 젖소, 돼지, 산란계농장의 축사바닥분뇨, 퇴비사, 원유탱크, 집란기, 분변벨트 등에서 채취 하였으며 축산식품의 생물학적 위해인 Pathogenic E.
제안 방법
- 본 연구를 위한 검체채취 대상 및 방법은 다음과 같다. HACCP를 운용중인 한우, 젖소, 돼지, 산란계 농장을 선택하여 분변, 퇴비사, 원유, 축종별 사육환경에서 표면 샘플링을 실시하였다. 한우농가 당 분변 5건, 우사바닥 2건, 퇴비사 2건씩 총 9건을 채취하였으며, 젖소농가에서 분변 5건, 우사바닥 2건, 퇴비사 2건, 원유 2건으로 11건씩을 채취하였다.
- coli, Salmonella spp. S. aureus 등을 분석하였다.
- 각각의 증균배양액을 BS Agar 및 XLD Agar (또는 DCA, HE Agar, BS Agar) 배지에 도말한 후 36 ± 1℃에서 20~24시간 배양 결과 평판별로 의심되는 집락〔(유당 비분해(무색) 및 황화수소(H2S) 산성으로 검은색) 3개 이상을 취하여 TSI Agar 또는 LIA 사면배지에 천자하여 37 ± 1℃에서 20~24시간 배양하였다.
- 검체 채취는 무균적으로 SWAB kit를 사용하였다. 축종별로 분변과 사육환경은 반드시 사육장 내에서 채취하였고 퇴비는 퇴비를 보관하고 있는 장소에서 채취하였으며 젖소 원유의 경우, 냉각기에 보관된 상태에서 멸균된 PALCON tube에 50 ml를 채취하여 밀봉하였다.
- PCR 반응조건으로 1) 변성(1 cycle: 95℃, 5분간), 2) 결합(40 cycle: 각 45초씩 95℃, 50℃, 72℃ 온도변화), 3) 합성(1 cycle: 72℃, 10분간) 단계를 설정하였다. 그 결과는 전기영동을 통하여 확인하였다.
- 생화학성상시험은 API 20E으로 확인하여 동정하였으며, O항혈청(O157, O26, O111) kit를 이용하여 혈청학적 검사를 실시하여 혈청형을 확인하였다. 또한 병원성대장균의 5가지 병원성그룹인 enterohemorrhagic E. coli (EHEC), enterotoxigenic E. coli (ETEC), enteropathogenic E. coli (EPEC), enteroinvasive E. coli (EIEC), enteroaggregative E. coli (EAEC)는 멀티플렉스 PCR 방법을 사용하여 확인하였다. 이 PCR 방법은 Lopez-Saucedo 등(2003)이 서술한 방법을 변형하여 진행된 것으로, 먼저 주형 DNA를 추출해내기 위하여 분리한 대장균을 TSB 배지에서 37℃, 18시간 이상 배양하였다.
- coli O157 agar에 직접 또는 적절히 희석 (10-2~10-3) 도말하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양 후 솔비톨을 분해하지 않는 집락 즉, SMAC에서 무색인 집락을 선별/ Fluorocult 배지 상 녹색집락, UV 조사 아래 형광을 나타내는 집락을 선별하여 각 평판당 5개 이상씩 Mac-Conkey Agar 및 EMB Agar에 획선하여 37℃에서 24시간 배양하였다. MacConkey Agar에서 lactose 분해균 및 EMB Agar에서 녹색성의 금속광택 집락에 대해 TSI로 A/A (노란색/노란색)의 형성균을 대상으로 대장균임을 확인하였다.
- 살모넬라 시험은 SWAB kit로 채취한 시료액 25 ml에 225 ml의 BPW를 첨가하여 36 ± 1℃에서 18~24시간 배양한 후 배양액을 2종류의 증균배지, 즉 10 ml의 TT broth 또는 SC broth에 1 ml를 첨가함과 동시에 10 ml의 RV broth에 0.1 ml를 첨가하여 각각 36 ± 1℃ 및 42 ± 0.5℃에서 20~24시간동안 증균 배양하였다.
- MacConkey Agar에서 lactose 분해균 및 EMB Agar에서 녹색성의 금속광택 집락에 대해 TSI로 A/A (노란색/노란색)의 형성균을 대상으로 대장균임을 확인하였다. 생화학성상시험은 API 20E으로 확인하여 동정하였으며, O항혈청(O157, O26, O111) kit를 이용하여 혈청학적 검사를 실시하여 혈청형을 확인하였다. 또한 병원성대장균의 5가지 병원성그룹인 enterohemorrhagic E.
- coli (EAEC)는 멀티플렉스 PCR 방법을 사용하여 확인하였다. 이 PCR 방법은 Lopez-Saucedo 등(2003)이 서술한 방법을 변형하여 진행된 것으로, 먼저 주형 DNA를 추출해내기 위하여 분리한 대장균을 TSB 배지에서 37℃, 18시간 이상 배양하였다. 배양액을 1차 원심분리하여 남은 pellet을 1 ml의 3차 멸균증류수로 희석하고 10분간 100℃에서 열을 가하여 재차 원심분리 15,000 rpm으로 10분간 진행하여 상층액을 분리하였다.
- 축종별로 분변과 사육환경은 반드시 사육장 내에서 채취하였고 퇴비는 퇴비를 보관하고 있는 장소에서 채취하였으며 젖소 원유의 경우, 냉각기에 보관된 상태에서 멸균된 PALCON tube에 50 ml를 채취하여 밀봉하였다. 채취된 시료는 아이스박스에 아이스팩과 동봉하고 냉장상태로 보관하여 운반한 후 냉장보관 36시간 안에 검사를 실시하였다.
- 검체 채취는 무균적으로 SWAB kit를 사용하였다. 축종별로 분변과 사육환경은 반드시 사육장 내에서 채취하였고 퇴비는 퇴비를 보관하고 있는 장소에서 채취하였으며 젖소 원유의 경우, 냉각기에 보관된 상태에서 멸균된 PALCON tube에 50 ml를 채취하여 밀봉하였다. 채취된 시료는 아이스박스에 아이스팩과 동봉하고 냉장상태로 보관하여 운반한 후 냉장보관 36시간 안에 검사를 실시하였다.
- 배양결과 형성된 집락을 혈액배지에 배양하여 용혈성 유무를 확인하며, 또 다른 집락으로 coagulase test를 확인한다. 토끼혈청(신선혈청은 5%, 건조혈청의 용액은 10%)을 가한 멸균생리식염수를 멸균한 시험관에 0.5~1 ml씩 무균적으로 분주하고 여기에 분리배지상의 집락에서 직접 또는 보통한천배지에서 순수배양 시킨 균 1백금이를 접종하여 37℃ 배양하여 3, 6, 24시간의 각 시간에 응고의 유무를 판정하여 어느 시간 후에도 응고 또는 섬유소(fibrin)가 석출된 것은 모두 coagulase 양성으로 하며 이상과 같이 확인된 것은 황색포도상구균 양성으로 판정하였다.
대상 데이터
- 한우농가 당 분변 5건, 우사바닥 2건, 퇴비사 2건씩 총 9건을 채취하였으며, 젖소농가에서 분변 5건, 우사바닥 2건, 퇴비사 2건, 원유 2건으로 11건씩을 채취하였다. 돼지농장 당 분변 5건, 돈사바닥 2건, 퇴비사 2건씩으로 총 9건을 채취하였으며, 산란계농장도 분변 5건, 계사바닥 2건과 사육환경인 분변벨트, 계사내 먼지, 집란기에서 각각 1건, 1건, 2건으로 11건씩 시료를 채취하였다. 시료 채취는 약 6개월간 진행하였으며 한우와 젖소 각각 8개 농장, 돼지 15개 농장, 산란계 5개 농장으로 36개의 농장에서 총 350개의 샘플을 채취하였다(Table 1).
- 분변과 사육환경에 광범위하게 오염되어 있으며 식품매개질환을 유발할 수 있는 병원성대장균(Pathogenic E. coli)과 살모넬라(Salmonella spp.)를 대상으로 선정하였으며, 착유우의 유방염 원인균인 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)을 검사대상 균주로 선정하였다.
- 돼지농장 당 분변 5건, 돈사바닥 2건, 퇴비사 2건씩으로 총 9건을 채취하였으며, 산란계농장도 분변 5건, 계사바닥 2건과 사육환경인 분변벨트, 계사내 먼지, 집란기에서 각각 1건, 1건, 2건으로 11건씩 시료를 채취하였다. 시료 채취는 약 6개월간 진행하였으며 한우와 젖소 각각 8개 농장, 돼지 15개 농장, 산란계 5개 농장으로 36개의 농장에서 총 350개의 샘플을 채취하였다(Table 1).
- 준비된 PCR 튜브에는 Tris-HCl (10 mM, pH 8.3), KCl (50 mM), MgCl2 (2 mM), dATP, dCTP, dGTP, and dTTP (200 μM each), Taq polymerase (0.5 U/23 ㎕) (iNtRON Biotechnology, Seoul, Korea)으로 구성된 반응액과 16개의 프라이머와 미리 분리해둔 상층액 주형 DNA 5 ㎕를 분주하였다.
- HACCP를 운용중인 한우, 젖소, 돼지, 산란계 농장을 선택하여 분변, 퇴비사, 원유, 축종별 사육환경에서 표면 샘플링을 실시하였다. 한우농가 당 분변 5건, 우사바닥 2건, 퇴비사 2건씩 총 9건을 채취하였으며, 젖소농가에서 분변 5건, 우사바닥 2건, 퇴비사 2건, 원유 2건으로 11건씩을 채취하였다. 돼지농장 당 분변 5건, 돈사바닥 2건, 퇴비사 2건씩으로 총 9건을 채취하였으며, 산란계농장도 분변 5건, 계사바닥 2건과 사육환경인 분변벨트, 계사내 먼지, 집란기에서 각각 1건, 1건, 2건으로 11건씩 시료를 채취하였다.
데이터처리
- 각각의 증균배양액을 BS Agar 및 XLD Agar (또는 DCA, HE Agar, BS Agar) 배지에 도말한 후 36 ± 1℃에서 20~24시간 배양 결과 평판별로 의심되는 집락〔(유당 비분해(무색) 및 황화수소(H2S) 산성으로 검은색) 3개 이상을 취하여 TSI Agar 또는 LIA 사면배지에 천자하여 37 ± 1℃에서 20~24시간 배양하였다. TSI 및 LIA 검사 결과 살모넬라균으로 추정되는 균에 대해서는 API 20E 확인을 통해 최종 동정하였다.
이론/모형
- 본 연구는 국립수의과학검역원고시 제2010-2호 ‘축산물의 가공기준 및 성분규격 중 미생물 시험법에(국립수의과학검역원, 2010) 따라 실시하였다.
성능/효과
- aurues로 국내 낙농농가에서 가장 흔하게 검출되고 있다(박준규 등, 2000). HACCP 시스템이 적용되고 있는 낙농농가의 S. aurues 관리수준을 파악하기 위하여 원유탱크에서 검체를 취하여 검사한 결과 S. aurues 검출되지 않은 것으로 보아 본 시험에 선정된 농가는 HACCP 매뉴얼에 따라 원유내 S. aurues를 잘 관리하고 있는 것으로 판단된다.
- 배양 후 솔비톨을 분해하지 않는 집락 즉, SMAC에서 무색인 집락을 선별/ Fluorocult 배지 상 녹색집락, UV 조사 아래 형광을 나타내는 집락을 선별하여 각 평판당 5개 이상씩 Mac-Conkey Agar 및 EMB Agar에 획선하여 37℃에서 24시간 배양하였다. MacConkey Agar에서 lactose 분해균 및 EMB Agar에서 녹색성의 금속광택 집락에 대해 TSI로 A/A (노란색/노란색)의 형성균을 대상으로 대장균임을 확인하였다. 생화학성상시험은 API 20E으로 확인하여 동정하였으며, O항혈청(O157, O26, O111) kit를 이용하여 혈청학적 검사를 실시하여 혈청형을 확인하였다.
- HACCP 시스템을 운용중인 농장의 축종별 분뇨, 바닥, 퇴비사, 분변벨트 및 집란기의 병원성 대장균 검출결과는 Table 3과 같다. 각 농장의 축종별 대장균은 분변에서 100% 검출되었다. 바닥에서는 산란계농장에서 가장 높은 검출율을 보였으며 (100%), 한우와 돼지농장의 바닥에서는 약 30~40%의 대장균이 검출되었다.
- 5%)으로 높게 조사되었다. 돼지농장의 분뇨에서 분리한 대장균은 전체 75회 분석대비 9건(12.0%)이 장관출혈성대장균으로 조사되었으며 1건(1.3%)은 장관병원성대장균으로 조사되었다. 산란계농장에서도 한우 및 젖소와 비슷한 경향을 나타내었는데, 전체 25건의 분뇨에서 5건(20.
- 각 농장의 축종별 대장균은 분변에서 100% 검출되었다. 바닥에서는 산란계농장에서 가장 높은 검출율을 보였으며 (100%), 한우와 돼지농장의 바닥에서는 약 30~40%의 대장균이 검출되었다. 그러나 젖소농장에서는 18.
- 본 연구결과를 종합해 보면 HACCP 시스템을 운용중인 농가의 병원성세균관리 수준을 일반 축산농가와 간접 비교하였을 경우 다소 향상되는 것으로 조사되었는데 이는 HACCP 시스템 중 선행요건프로그램에 의한 것으로 판단된다.
- 이는 사육농가의 위생 상태나 사육환경 등의 차이에 의한 것으로 추정된다(황원무 등, 2004). 본 연구에서는 소, 돼지, 산란계의 분변에서는 살모넬라균이 검출되지 않았으나 주변 사육환경(바닥, 퇴비, 분변벨트)에서는 소 농장을 제외하고 돼지와 닭 농장 바닥과 퇴비사에서 각각 3건(7.5%), 2건(5.7%)씩 검출되었는데 이는 지금까지 보고된 국내외 살모넬라오염비율에 비하여 상당히 낮은 것으로 조사되었다. 살모넬라속균은 동물과 사람에 감염되어 장염, 위장염, 패혈증을 일으키는 병원성 장내세균으로 숙주가 다양하고 인수공통전염성 원인균으로 환경이나 식품오염을 통하여 식중독을 일으키므로 공중보건학상 대단히 중요시되고 있다(정영미 등, 2004).
- 분변검체로부터 분리된 대장균은 축종에 상관없이 모두 180건(100%)이 검출되었으나, 설사, 장염 등 치명적인 질병을 유발하는 병원성대장균으로는 53건(29.4%)로 나타났으며, 이중 대부분의 가축에게 설사를 유발시키는 병원성대장균(ETEC)은 22건(12.2%)으로 조사되었다. 특히 돼지 설사 유발 대장균인 EPEC는 돼지분변에서 1건(1.
- 8%의 대장균이 검출되어 모든 축종 중 가장 낮게 나타났다. 퇴비사나 분변벨트에서는 돼지농장과 산란농장에서 가장 높은 대장균 검출율을 나타내었으며, 다음으로 젖소농장 25%, 한우농장 18.8% 순으로 낮았으며 전체적으로 62.7%의 대장균 검출율을 나타내었다. 산란계농장 내 시설 중 집란기의 대장균 오염정도를 확인하였으나 검출되지 않았다.
- 2%)으로 조사되었다. 특히 돼지 설사 유발 대장균인 EPEC는 돼지분변에서 1건(1.3%)에서 확인되었으며, 돼지의 부종병, 송아지의 출혈성장염을 초래할 수 있는 대장균인 EHEC는 한우에서 가장 많은 검출율을 보였으나 항 혈청분석 결과 주요 출혈성대장염 원인인 혈청형 O157, O111, O26은 발견되지 않았다. 권 등(권영길 등, 2007)의 연구결과에 의하면 국내에서 사육중인 소, 돼지, 닭 분변에서의 대장균 검출율은 100%라고 보고하였는데 이러한 결과는 본 연구결과와 일치하였다.
- 각 농장에서 분리된 대장균을 병원성그룹 별로 분리한 결과는 Table 4와 같다. 한우농장의 분뇨에서 분리한 대장균 검출건수 16건 중 장관출혈성대장균이 11건(27.5%)를 차지하였으며 장관독소원성대장균은 5건(12.5%)으로 나타나 장관출혈성대장균이 상대적으로 높은 비율을 차지하였다. 반대로 젖소농장에서는 장관출혈성 대장균 5건(12.
후속연구
- 이와 함께 축산물의 안전성확보를 위하여 가축사육단계 HACCP 제도가 2006년 양돈농장(농림수산식품부, 2006)을 시작으로 도입되었으며, 비육우(농림수산식품부, 2007a)와 젖소(농림수산식품부, 2007b)는 2007년, 육계(농림수산식품부, 2008a)와 산란계(농림수산식품부, 2008b)는 2008년에 그리고 오리농장(농림수산식품부, 2009) HACCP 제도는 2009년에 순차적으로 도입되었다. 그러나 HACCP 적용 농장의 생물학적 위해 관리에 대한 연구 자료가 전무한 실정으로 이 분야에 대한 체계적이고 다양한 기초연구가 필요할 것으로 판단된다. 따라서 본 연구는 각 축종별(한우, 젖소, 돼지, 산란계)로 HACCP 적용 농장의 분변, 원유 및 사육환경에서 병원성세균 등 분석을 통하여 HACCP 적용 농장의 병원성 미생물 관리 실태를 파악하고 이를 농장 HACCP 시스템 적용에 관한 기초 연구 자료로 사용하는 것을 목적으로 하였다.
- 9%로 조사되었다. 그러나 산란계농장의 바닥과 돼지농장의 퇴비 및 분변벨트에서는 높은 대장균 검출율을 나타내어 이에 대한 철저한 소독 등 위생관리 방안이 추가되어야 할 것으로 판단된다.
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