40℃ 48시간 에탄올발효 과정 중 일어나는 Saccharomyces cerevisiae KNU5377의 생리 변화 Physiological Changes of Saccharomyces cerevisiae KNU5377 Occurred in the Process of the 48-hour Ethanol Fermentation at 40℃원문보기
포도당 20%와 효모엑기스가 함유된 배지에서 $40^{\circ}C$에서 48시간에 걸친 에탄올발효 과정 중에 일어나는 고온성 알코올 발효 효모균주 Saccharomyces cerevisiae KNU5377의 세포 내에서 일어나는 생리적 변화를 살펴보고자 했다. 그 결과, 이 발효 효모균주는 $40^{\circ}C$ 48시간의 발효로써 11.4% alcohol을 생성하여, 고온발효인데도 불구하고 우수한 발효능을 가진 것을 확인할 수 있었다. 또한 12시간 발효과정동안 배지의 pH가 시작단계의 pH 6.0이 4.1로 내려갔으며, 이후 에탄올발효가 완성될 때까지 거의 변화하지 않고 이 값으로 유지되었다. 발효 12시간이 지나면서 세포막의 지방산의 조성은 불포화지방산인 $C_{16:1}$ (palmitoleic acid)가 포화지방산인 $C_{16:0}$ (palmitic acid)보다 1.5배나 증가하였으며, $C_{18:1}$보다는 2배 가까이 증가하여 구성되어 있었다. 48시간 배양한 세포의 2차 전기영동(2-D)을 통한 세포내 단백질의 발현정도를 proteomics분석법으로 살펴본 바, phosphoglycerate kinase가 가장 크게 발현했음을 Mass Spectrometry를 통해 알 수 있었다. 그 뒤를 이어 adenylate kinase, Cys3p, Tdh3p, translational elongation factor 등이 크게 발현된 것을 알게 되었다. 이들은 직간접적으로 해당과정에 관여하는 인자들 이어서, 고온 장시간에 걸친 에탄올발효를 하는 이 발효 효모균주의 세포에게는 생존과 에탄올발효를 위하여 해당과정 관여 인자가 중요한 역할을 하고 있다는 것을 강력히 시사하였다.
포도당 20%와 효모엑기스가 함유된 배지에서 $40^{\circ}C$에서 48시간에 걸친 에탄올발효 과정 중에 일어나는 고온성 알코올 발효 효모균주 Saccharomyces cerevisiae KNU5377의 세포 내에서 일어나는 생리적 변화를 살펴보고자 했다. 그 결과, 이 발효 효모균주는 $40^{\circ}C$ 48시간의 발효로써 11.4% alcohol을 생성하여, 고온발효인데도 불구하고 우수한 발효능을 가진 것을 확인할 수 있었다. 또한 12시간 발효과정동안 배지의 pH가 시작단계의 pH 6.0이 4.1로 내려갔으며, 이후 에탄올발효가 완성될 때까지 거의 변화하지 않고 이 값으로 유지되었다. 발효 12시간이 지나면서 세포막의 지방산의 조성은 불포화지방산인 $C_{16:1}$ (palmitoleic acid)가 포화지방산인 $C_{16:0}$ (palmitic acid)보다 1.5배나 증가하였으며, $C_{18:1}$보다는 2배 가까이 증가하여 구성되어 있었다. 48시간 배양한 세포의 2차 전기영동(2-D)을 통한 세포내 단백질의 발현정도를 proteomics분석법으로 살펴본 바, phosphoglycerate kinase가 가장 크게 발현했음을 Mass Spectrometry를 통해 알 수 있었다. 그 뒤를 이어 adenylate kinase, Cys3p, Tdh3p, translational elongation factor 등이 크게 발현된 것을 알게 되었다. 이들은 직간접적으로 해당과정에 관여하는 인자들 이어서, 고온 장시간에 걸친 에탄올발효를 하는 이 발효 효모균주의 세포에게는 생존과 에탄올발효를 위하여 해당과정 관여 인자가 중요한 역할을 하고 있다는 것을 강력히 시사하였다.
In this study, physiological changes in a thermotolerant yeast Saccharomyces cerevisiae KNU5377 cell exposed to 48-hour alcohol fermentation at $40^{\circ}C$ were investigated. After 12 hours of alcohol fermentation at $40^{\circ}C$, the $C_{16:1}$ unsaturated acid o...
In this study, physiological changes in a thermotolerant yeast Saccharomyces cerevisiae KNU5377 cell exposed to 48-hour alcohol fermentation at $40^{\circ}C$ were investigated. After 12 hours of alcohol fermentation at $40^{\circ}C$, the $C_{16:1}$ unsaturated acid of plasma membrane increased to 1.5 times more than the $C_{16:0}$ saturated fatty acid, and to about 2 times more for the $C_{18:1}$ unsaturated fatty acid. Fermentation at both $30^{\circ}C$ and $37^{\circ}C$ fermentation showed the same pattern as that done at $40^{\circ}C$. The pH of the alcohol-fermentation medium was reduced to pH 4.1 from a starting pH of 6.0 through the 12-hr fermentation and then maintained this level during the continuing fermentation. With the process of fermentation, the remaining glucose was reduced, but its amount remaining during the $40^{\circ}C$-fermentation was less reduced than those fermented at $30^{\circ}C$ and $37^{\circ}C$. In the study investigating the changing pattern of cellular proteins in the alcohol-fermenting cells, the SDS-PAGE and 2-D data indicated the most expressed dot was phosphoglycerate kinase, which is one enzyme involved in glycolysis. Why this enzyme was most expressed in the cells exposed to unfavorable conditions such as high temperature, increasing concentration of produced alcohol and long time exposure to other stress factors remains unsolved.
In this study, physiological changes in a thermotolerant yeast Saccharomyces cerevisiae KNU5377 cell exposed to 48-hour alcohol fermentation at $40^{\circ}C$ were investigated. After 12 hours of alcohol fermentation at $40^{\circ}C$, the $C_{16:1}$ unsaturated acid of plasma membrane increased to 1.5 times more than the $C_{16:0}$ saturated fatty acid, and to about 2 times more for the $C_{18:1}$ unsaturated fatty acid. Fermentation at both $30^{\circ}C$ and $37^{\circ}C$ fermentation showed the same pattern as that done at $40^{\circ}C$. The pH of the alcohol-fermentation medium was reduced to pH 4.1 from a starting pH of 6.0 through the 12-hr fermentation and then maintained this level during the continuing fermentation. With the process of fermentation, the remaining glucose was reduced, but its amount remaining during the $40^{\circ}C$-fermentation was less reduced than those fermented at $30^{\circ}C$ and $37^{\circ}C$. In the study investigating the changing pattern of cellular proteins in the alcohol-fermenting cells, the SDS-PAGE and 2-D data indicated the most expressed dot was phosphoglycerate kinase, which is one enzyme involved in glycolysis. Why this enzyme was most expressed in the cells exposed to unfavorable conditions such as high temperature, increasing concentration of produced alcohol and long time exposure to other stress factors remains unsolved.
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문제 정의
우리 연구진은 40℃에서도 에탄올을 30℃의 경우처럼 거의 정상적으로 발효할 수 있는 고온성 효모균주 Saccharomyces cerevisiae KNU5377을 자연에서 분리 동정하였다[15,16]. 고온 내성과 고온발효능을 가능하게 만드는 S. cerevisiae KNU5377의 특성인자를 밝히기 위해, 여러 가지 스트레스 환경에서 이 효모의 다양한 생리적 특성을 조사해오고 있으며[11,12,13,14], 이러한 생리적 특성을 나타내는 특정한 인자를 밝히려는 연구를 시도해오고 있다. 이 연구에서도 지금까지의 얻은 데이터를 바탕으로 하여, 이 효모균주 S.
이 알코올발효 효모는 열에 대한 내성이 높은 균주로 밝혀졌다. 그래서 지금까지 우리 연구실에서 얻은 이러한 연구결과들을 바탕으로, 고온 알코올 발효 과정에서 KNU5377균주의 생리적 특성의 변화하는 양상을 조사하여 보았다.
cerevisiae KNU5377의 특성인자를 밝히기 위해, 여러 가지 스트레스 환경에서 이 효모의 다양한 생리적 특성을 조사해오고 있으며[11,12,13,14], 이러한 생리적 특성을 나타내는 특정한 인자를 밝히려는 연구를 시도해오고 있다. 이 연구에서도 지금까지의 얻은 데이터를 바탕으로 하여, 이 효모균주 S. cerevisiae KNU5377을 사용하여 40℃에서 장시간 에탄올을 발효할 때 발효과정중에 일어나는 세포 내의 생리적 변화를 알아보고자 이 연구를 하게 되었다.
제안 방법
2-D 전기영동을 수행하여 단백질이 비교적 많이 분포되어 있으며 변화가 눈에 띄는 부분인 pH 4-7 부분의 분석을 실시하였다. 단백질의 발현양상은 Fig.
After inoculating the pre-culture into the GY media (5%, v/v) cells were grown to ferment ethanol in the GY medium for 72 hr at each temperature of 30°C, 37°C and 40°C and the residual sugar in each culture broth was measured by refractometer.
After inoculating the pre-culture into the GY medium (5%, v/v) cells were grown to ferment ethanol in the GY medium for 72 hr at 30°C, 37°C, 40°C, respectively and the pH of each culture broth was measured.
After inoculating the pre-culture into the GY medium (5%, v/v), fermentation was carried out for 72 hr at each given temperature such as 30°C, 37°C and 40°C.
0 mg) 후 12시간 동안 active condition (50 V, 20℃) 하에서 dehydration 과정을 거친 후, 20℃에서 250 V에서 30분, 10,000 V에서 5시간, 10,000 V에서 80000 V-H로 전압을 걸어 수행하였다. First electrophoresis 과정이 끝나면 strip을 equilibration buffer I [6 M urea, 2% SDS, 0.375M Tris-HCl pH 8.8, 20% glycerol, 2% DTT]과 equilibration buffer II [6 M urea, 2% SDS, 0.375 M Tris-HCl pH8.8, 20% glycerol, 2.5% iodoacetamide]에 넣어 각각 15분간 처리한 후, 12% SDS-PAGE 상에서 전기영동을 수행하였다. 전기영동 후 CBB staining 및 destaining을 수행하였다[1,27].
KNU5377가 고온에서 어떻게 우수한 알코올발효 생성을 할 수 있는지를 알아보기 위해서 40℃에서 48시간 발효한 세포의 proteome 분석을 하였다. 기존의 유전적 배경이 잘 알려진 S288C 세포를 대조구로서 비교하였다.
KNU5377을 접종하여 12시간, 24시간, 48시간, 72시간 배양시킨 후 각각의 배양액을 원심분리 후 균체를 얻어 멸균수로 세척하였다. 약 300 mg의 균체를 teflon-lined screw cap tube에 옮긴 후 saponification solution (15% NaOH를 첨가한 50% methanol 용액) 1 ml을 가하고, 100℃에서 30분간 가열한 후, 실온에서 냉각하였다.
KNU5377의 온도와 시간에 따른 생장에 미치는 영향을 확인하기 위하여, GY 배지에 접종 후 발효과정의 생육 정도를 확인하였다(Fig. 1).
전기영동 후 CBB staining 및 destaining을 수행하였다[1,27]. S288C보다 KNU5377 균주에서 over-expression 된 spots을 cutting 및 trypsin으로 in-gel digestion 후 MALDI- TOF MS analysis를 수행하였다.
각각 30℃, 37℃, 40℃ 온도와 다양한 배양 시간에 따라 처리된 세포를 원심 집균한 후, 멸균 증류수로 3회 세척하였다.
그리고 균의 생육정도를 알아보기 위하여, GY배지에 접종 후 6시간, 12시간, 24시간 48시간, 72시간 단위로 배양액을 채취하여 spectrophotometer로써 OD 660 nm에서 측정하였고, 그 OD값은 균의 탁도로서 이용하였다. 아울러 발효과정중인 배지의 pH 변화를 알아보기 위해 균생육도 측정과 마찬가지로 접종 후 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간 단위로 배양액을 pH meter로 측정하였다.
KNU5377가 고온에서 어떻게 우수한 알코올발효 생성을 할 수 있는지를 알아보기 위해서 40℃에서 48시간 발효한 세포의 proteome 분석을 하였다. 기존의 유전적 배경이 잘 알려진 S288C 세포를 대조구로서 비교하였다.
발효과정 중 배지내의 잔당의 양을 알아보기 위해, 균생육도 측정시와 동일한 발효시간에 채취한 배양액을 원심분리하여 그 상등액을 당도계(refractometer)로 측정하였다.
발효과정 중인 사용균주 세포의 단백질 발현의 변화를 알아보기 위해 10% gel SDS-PAGE를 수행하였다. Fig.
배양한 KNU5377의 12시간, 24시간, 48시간, 72시간 단위의 배양액을 모아 원심분리기로 8,000 rpm에서 10분간 원심 분리한 후, 그 상등액 80 ml를 취하여 250 ml 삼각플라스크에 넣고 냉각관을 통해 1차 증류하였고, 이 증류액을 주정계(hydrometer)로 비중을 측정한 다음, 그 값을 Gay Lussac table로 온도 보정하여 환산하였다.
세척한 세포에 lysis buffer (50mM Tris-HCl, pH 7.5, 5% glycerol, 2% SDS, 1.0% β-mercaptoethanol, 1 mM PMSF, and protease inhibitor cocktails)를 세포양의 2배를 넣고 glass bead를 세포양과 동량 첨가한 후, 4℃에서 micromixer (TAITEC, Micromixer E-36)로 1분간 vortexing한 다음 2분간 cooling하는 과정을 5회 반복하여 파쇄하였다.
그리고 균의 생육정도를 알아보기 위하여, GY배지에 접종 후 6시간, 12시간, 24시간 48시간, 72시간 단위로 배양액을 채취하여 spectrophotometer로써 OD 660 nm에서 측정하였고, 그 OD값은 균의 탁도로서 이용하였다. 아울러 발효과정중인 배지의 pH 변화를 알아보기 위해 균생육도 측정과 마찬가지로 접종 후 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간 단위로 배양액을 pH meter로 측정하였다.
온도와 시간의 차에 따라서 발효과정 중의 배지 내에 남아있는 잔당인 포도당의 양을 측정하였다(Fig. 3). 알코올발효는 당을 사용해서 알코올을 생성하기 때문에 발효시간이 경과될수록 배지 내의 당이 소모된다.
5% iodoacetamide]에 넣어 각각 15분간 처리한 후, 12% SDS-PAGE 상에서 전기영동을 수행하였다. 전기영동 후 CBB staining 및 destaining을 수행하였다[1,27]. S288C보다 KNU5377 균주에서 over-expression 된 spots을 cutting 및 trypsin으로 in-gel digestion 후 MALDI- TOF MS analysis를 수행하였다.
대상 데이터
이 균주는 고온성 연료용 알코올 발효 효모균 주로서 여러 종류의 스트레스, 특히 알코올 발효 중에 생기는 스트레스에 대하여 다중내성을 가지고 있는 야생형균주이며 [21,22], 이 균주의 전배양에 사용된 배지로는 전형적인 Saccharomyces 영양배지인 YPD medium (Yeast extract 1%, Peptone 2% and Glucose 2%)를 사용하였고, 알코올 발효를 위해선 GY medium (Glucose 20%, Yeast extract 1%)을 사용하였다. 고온에서 알코올을 발효동안 일어나는 KNU5377의 세포 내 proteome의 분석을 위해, 유전적 배경이 잘 알려진 S. cerevisiae S288C (S288C로 약침) 효모균주를 대조용 (reference strain)으로 사용하였다.
이 실험에서는 우리 연구진이 자연계 토양에서 직접 분리한 Saccharomyces cerevisiae KNU5377 (이하 KNU5377로 약칭)을 사용하였다[15]. 이 균주는 고온성 연료용 알코올 발효 효모균 주로서 여러 종류의 스트레스, 특히 알코올 발효 중에 생기는 스트레스에 대하여 다중내성을 가지고 있는 야생형균주이며 [21,22], 이 균주의 전배양에 사용된 배지로는 전형적인 Saccharomyces 영양배지인 YPD medium (Yeast extract 1%, Peptone 2% and Glucose 2%)를 사용하였고, 알코올 발효를 위해선 GY medium (Glucose 20%, Yeast extract 1%)을 사용하였다. 고온에서 알코올을 발효동안 일어나는 KNU5377의 세포 내 proteome의 분석을 위해, 유전적 배경이 잘 알려진 S.
이 실험에서는 우리 연구진이 자연계 토양에서 직접 분리한 Saccharomyces cerevisiae KNU5377 (이하 KNU5377로 약칭)을 사용하였다[15]. 이 균주는 고온성 연료용 알코올 발효 효모균 주로서 여러 종류의 스트레스, 특히 알코올 발효 중에 생기는 스트레스에 대하여 다중내성을 가지고 있는 야생형균주이며 [21,22], 이 균주의 전배양에 사용된 배지로는 전형적인 Saccharomyces 영양배지인 YPD medium (Yeast extract 1%, Peptone 2% and Glucose 2%)를 사용하였고, 알코올 발효를 위해선 GY medium (Glucose 20%, Yeast extract 1%)을 사용하였다.
이론/모형
0% β-mercaptoethanol, 1 mM PMSF, and protease inhibitor cocktails)를 세포양의 2배를 넣고 glass bead를 세포양과 동량 첨가한 후, 4℃에서 micromixer (TAITEC, Micromixer E-36)로 1분간 vortexing한 다음 2분간 cooling하는 과정을 5회 반복하여 파쇄하였다. 파쇄 후 원심분리(13,000 rpm, 4℃, 20 min)한 상등액을 Lowry assay 방법으로 단백질 정량하였고, 샘플로서 사용하여 SDS-PAGE (12%)를 실시하였다. Coomassie solution (0.
성능/효과
30°C의 경우는 일반적인 효모 생육온도이기 때문에 잘 생육하였으나, 37℃는 생육하기에 다소 높은 온도이나 30℃에 비해 생육정도가 크게 차이는 나지 않는다는 걸 알 수 있었다.
GY에서 각각 30°C, 37°C, 40°C에서 배양한 KNU5377이 생성하는 알코올 농도를 조사한 결과, 30°C와 37°C에서 배양한 경우 알코올 도수가 크게 차이가 나지 않지만, 40°C의 경우는다른 온도에 비해 알코올 생산능이 다소 낮은 것을 알았다 (Fig. 5).
그러나 30°C 및 37°C 48시간 발효결과 15% alcohol을 생성한 데 비해, 40°C 48시간 발효에서는 11.4% alcohol을 생성하여 우수한 발효능을 가진 것을 확인할 수 있었다.
알코올발효 과정 중 온도와 시간에 따른 pH의 변화는 발효초기 약 pH 6.0에서 발효 12시간에 약 pH 4.1로 급격한 감소를 보였으며, 그 후 발효시간이 경과함에 따라 약간씩 감소하는듯 보였으나 대체로 일정한 수준을 유지하였다(Fig. 2). pH의경우 온도가 높아질수록 pH가 역시 높아지는 것으로 나타났다.
특히 지방산 중 C16:1과 C18:1은 막 유동성 및 외부스트레스에 대한 일차적인 방어인자로서 반응한다고 알려져 있다[31,32]. 이 실험결과에서는 발효과정 중에 6가지의 지방산에 대한 조성변화를 조사한 결과, 전배양의 경우 KNU5377 불포화지방산(C16:1)의 구성비가 높은 것을 알게 되었고, 발효과정에서는 다른 종류의 지방산의 조성은 큰 차이를 보이지 않으나 포화지방산인 C16:0의 감소 및 C16:1의 불포화 지방산의 증가가 두드러졌다. 이 결과로써 이 두 가지 지방산이 발효과정에서 세포막의 유동성을 높여서 스트레스에 대한 내성에 영향을 준 것으로 생각된다.
이러한 이유로 발효과정이 경과함에 따라 GY내의 당이 감소하였고, 고온인 40°C의 경우 30°C와 37°C에 비해 당의 소모가 천천히 감소하였다.
후속연구
이 결과를 통해 알게 된 발효과정 중 phosphoglycerate kinase의 다량 발현 및 membraneous H + - ATPase의 발현 증대의 연관 관계를 좀 더 자세히 조사할 필요가 있다. 아울러 이들의 발현과 Hsp 30의 상관관계 또한 차후 밝혀져야 될 필요성이 제기된다.
cerevisiae KNU5377은 발효과정중 스트레스에 대한 적응을 하기 위해서 phosphoglycerate kinase을 다량 발현하였고, 이러한 단백질의 다량 발현을 통해서 고온에서 해당과정을 적절하게 수행함으로써 자신의 생육 및 발효가 가능하도록 하는 것은 아닌가 하고 생각되어진다. 이 결과를 통해 알게 된 발효과정 중 phosphoglycerate kinase의 다량 발현 및 membraneous H + - ATPase의 발현 증대의 연관 관계를 좀 더 자세히 조사할 필요가 있다. 아울러 이들의 발현과 Hsp 30의 상관관계 또한 차후 밝혀져야 될 필요성이 제기된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
연료용 알코올을 생산하기 위해 해결해야 하는 2가지 문제점은 무엇인가?
연료용 알코올을 생산하기 위해서는 2가지 문제점이 우선 적으로 해결되어야 한다. 첫째는 끊임없는 태양에너지의 공급과 그로 인한 광합성작용의 결과 거의 무진장 축적되고 있는 섬유소의 고효율 당화기술의 확립이며, 둘째는 고온내성 발효 미생물의 확보이다. 현재 사용중인 당화기술로는 섬유소의 당화반응은 고온(50°C)에서 이뤄지고 있으며, 뒤이어지는 알코올반응은 자연히 이 온도에서 시작되게 되므로 당연히 고온내성 발효미생물이 필요하다.
연료용 알코올의 생산원료는 어떤 계열로 나눌 수 있는가?
연료용 알코올의 생산원료는 크게 전분계와 목질계로 나눌 수 있는데, 전분계를 이용한 에탄올 생산기술은 이미 세계적으로 잘 확립되어있다. 국가차원에서 바이오에탄올을 장려하는 미국의 경우 연료용 에탄올은 주로 옥수수를 원료로 생산되고 있으며, 브라질의 경우는 사탕수수를 원료로 생산하고 있다.
Saccharomyces cerevisiae는 몇 도 이상부터 생육이 어려워지는가?
그러나 효모 Saccharomyces cerevisiae는 일반적으로 37°C이상의 고온에선 생육이 어려우며, 온도가 증가함에 따라 알코올 내성이 감소하여 고온성 알코올 발효가 어려운 것으로 알려져 있다[9,10]. 그래서 알코올 생산은 30°C와 33°C 사이에서 발효를 하는 것이 전 세계적인 추세이지만, 아직 기질인 섬유소 또는 전분의 당화과정은 통상 고온에서 이뤄지므로 당화 후 당화액을 발효가능온도까지 식혀야 하는데, 이런 단점 보완과 발효공정의 효율을 더욱 높여 생산비의 절감 및 연료용 에탄올의 상용화를 위한 방법의 일환으로, 고온에서 발효 생산을 할 수 있는 발효미생물의 개발을 필수로 여기고 있다.
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