파이토케미컬의 일종인 EGCG는 녹차의 카테킨 성분으로, 세포 내 신호 경로 조절을 통하여 항산화, 항암효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 hypoxia 상태인 B16F10 피부암 세포에서 HIF-$1{\alpha}$를 포함한 AMPK의 신호경로를 통하여 EGCG의 apoptosis 유도 효과를 규명하였다. AMPK는 hypoxia, 영양분 결핍, 운동, heat shock 등, 세포 내 ATP의 결핍에 의해서 활성화되며 암세포의 증식을 억제하고 apoptosis를 유도한다. 세포에서 중요한 에너지 센서로서 작용하는 AMPK가 hypoxia 상태의 암세포 내에서는 HIF-$1{\alpha}$의 전사 활성을 유도하는데, HIF-$1{\alpha}$는 hypoxia 상태에서 산소 결핍에 반응하는 첫 번째 전사 조절인자로서 암세포의 생존을 위한 세포내 산소공급과 혈관신생형성을 조절한다. Hypoxia 상태가 아닌 B16F10 세포에서와 hypoxia 상태에서의 B16F10 세포에서 EGCG에 의한 apoptosis 효과를 관찰하였다. 실험 결과, hypoxia 상태에서 EGCG는 더 강한 apoptosis를 유도하며, 혈관신생형성을 조절할 수 있는 HIF-$1{\alpha}$의 전사 활성을 억제시킨다. 이러한 관찰을 통해 EGCG가 hypoxia 상태의 피부암 세포에서 암의 성장과 신생혈관형성을 저해하는 것으로 보인다. 이와 같은 연구는 향후 식품에 첨가된 파이토케미컬을 이용하여 암을 예방하는 연구에서 있어서, 도움이 될 것으로 여겨진다.
파이토케미컬의 일종인 EGCG는 녹차의 카테킨 성분으로, 세포 내 신호 경로 조절을 통하여 항산화, 항암효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 hypoxia 상태인 B16F10 피부암 세포에서 HIF-$1{\alpha}$를 포함한 AMPK의 신호경로를 통하여 EGCG의 apoptosis 유도 효과를 규명하였다. AMPK는 hypoxia, 영양분 결핍, 운동, heat shock 등, 세포 내 ATP의 결핍에 의해서 활성화되며 암세포의 증식을 억제하고 apoptosis를 유도한다. 세포에서 중요한 에너지 센서로서 작용하는 AMPK가 hypoxia 상태의 암세포 내에서는 HIF-$1{\alpha}$의 전사 활성을 유도하는데, HIF-$1{\alpha}$는 hypoxia 상태에서 산소 결핍에 반응하는 첫 번째 전사 조절인자로서 암세포의 생존을 위한 세포내 산소공급과 혈관신생형성을 조절한다. Hypoxia 상태가 아닌 B16F10 세포에서와 hypoxia 상태에서의 B16F10 세포에서 EGCG에 의한 apoptosis 효과를 관찰하였다. 실험 결과, hypoxia 상태에서 EGCG는 더 강한 apoptosis를 유도하며, 혈관신생형성을 조절할 수 있는 HIF-$1{\alpha}$의 전사 활성을 억제시킨다. 이러한 관찰을 통해 EGCG가 hypoxia 상태의 피부암 세포에서 암의 성장과 신생혈관형성을 저해하는 것으로 보인다. 이와 같은 연구는 향후 식품에 첨가된 파이토케미컬을 이용하여 암을 예방하는 연구에서 있어서, 도움이 될 것으로 여겨진다.
EGCG, catechins in green tea, is a kind of phytochemical. Through the regulation of signal pathways, EGCG has been known to show anti-oxidant and anti-tumor effects in cells. In this study, we investigated the apoptotic effects of EGCG through AMP-activated protein kinase (AMPK) signal pathways, inc...
EGCG, catechins in green tea, is a kind of phytochemical. Through the regulation of signal pathways, EGCG has been known to show anti-oxidant and anti-tumor effects in cells. In this study, we investigated the apoptotic effects of EGCG through AMP-activated protein kinase (AMPK) signal pathways, including hypoxia inducible factor-1 alpha (HIF-$1{\alpha}$). The experiments were performed in B16F10 melanoma cells in a hypoxic state. AMPK is activated by ATP consumption such as nutrient deficiency, exercise, heat shock, etc. The activated AMPK that plays an important role as an energy sensor inhibits proliferation of cancer cells, as well as inducing apoptosis. HIF-$1{\alpha}$, the primary transcriptional regulator of the response to oxygen deprivation, plays a critical role in modulating tumor growth and angiogenesis in a hypoxic state. The apoptotic effects of EGCG were studied in B16F10 cells in a hypoxic state. The results show that EGCG inhibits the transcriptional activity of HIF-$1{\alpha}$ and induces apoptosis. These observations suggest that EGCG may exert inhibitory effects of angiogenesis and control tumor cell growth in hypoxic melanoma cells.
EGCG, catechins in green tea, is a kind of phytochemical. Through the regulation of signal pathways, EGCG has been known to show anti-oxidant and anti-tumor effects in cells. In this study, we investigated the apoptotic effects of EGCG through AMP-activated protein kinase (AMPK) signal pathways, including hypoxia inducible factor-1 alpha (HIF-$1{\alpha}$). The experiments were performed in B16F10 melanoma cells in a hypoxic state. AMPK is activated by ATP consumption such as nutrient deficiency, exercise, heat shock, etc. The activated AMPK that plays an important role as an energy sensor inhibits proliferation of cancer cells, as well as inducing apoptosis. HIF-$1{\alpha}$, the primary transcriptional regulator of the response to oxygen deprivation, plays a critical role in modulating tumor growth and angiogenesis in a hypoxic state. The apoptotic effects of EGCG were studied in B16F10 cells in a hypoxic state. The results show that EGCG inhibits the transcriptional activity of HIF-$1{\alpha}$ and induces apoptosis. These observations suggest that EGCG may exert inhibitory effects of angiogenesis and control tumor cell growth in hypoxic melanoma cells.
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문제 정의
본 연구에서는 hypoxia 상태에서 B16F10 피부암 세포에 EGCG를 처리하였을 때, EGCG가 HIF-1α를 포함한 AMPK 신호경로를 경유하여 B16F10 세포의 증식을 억제하고, apoptosis를 유도하는 것을 규명하고자 하였다.
제안 방법
08% bromorphenol blue, 8% SDS)와 B16F10 세포에서 추출한 단백질을 혼합하여 표본을 제작한 후, AMPK, HIF-1α, β-actin의 1차 항체를 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)로 부터 구입하여 각각 희석한 후, 반응시켰다. 2차 항체(Cell Signaling Technology)를 희석하여 1시간 반응시킨 다음, Blue X-ray film에 나타나는 밴드로 단백질의 활성을 관찰하였다.
5× Laemmi sample buffer (loading dye; 250 mM Tris-cl (pH 6.8), 40% glycerol, 4% β-mercaptoethanol, 0.08% bromorphenol blue, 8% SDS)와 B16F10 세포에서 추출한 단백질을 혼합하여 표본을 제작한 후, AMPK, HIF-1α, β-actin의 1차 항체를 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)로 부터 구입하여 각각 희석한 후, 반응시켰다.
AMPK 저해제(inhibitor) Compound C를 10 μM, HIF-1α저해제 cycloheximide를 10 μM를 각각 CoCl2 100 μM, EGCG 80 μM와 병행 처리하여 실험을 실시하였다.
AMPK의 저해제인 Compound C와 HIF-1α 단백질 합성 저해제인 cycloheximide를 hypoxia 상태에서 EGCG와 병행 처리하여 관찰 하였다.
AnnexinV/PI staining을 하기 위해, 먼저 세포에 EGCG를 고농도(Control, 40 μM, 80 μM)로 처리하였다.
Apoptosis는 FITC-Annexin V apoptosis detection kit (BD PharmingenTM, San Diego, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. AnnexinV/PI staining을 하기 위해, 먼저 세포에 EGCG를 고농도(Control, 40 μM, 80 μM)로 처리하였다.
B16F10 세포를 6-well culture plate에서 배양한 후, hypoxic chamber를 사용하지 않고 hypoxic한 상태를 주기 위하여 CoCl2를 처리한 선행 연구를 바탕으로[1], CoCl2 100 mM를 농도별(Control, 25 μM, 50 μM, 100 μM, 200 μM)로 처리하였으며, EGCG 10 mM를 농도별(Control, 5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM)로 각각 처리하여 6시간 동안 배양하였다.
CoCl2와 EGCG를 병행 처리하였을 때 apoptosis가 유도되는지를 확인하기 위하여 FACS 실험을 실시하였다. Fig.
EGCG가 B16F10 세포의 증식을 억제하는지를 관찰하기 위해 MTT assay 실험을 수행하였다. Fig.
EGCG를 처리하지 않은 오직 hypoxia 상태에서 흑색종 피부암의 생존율을 알아보기 위하여 MTT 실험을 실시하였다. Fig.
Hypoxia 상태인 B16F10 세포에 EGCG를 처리했을 때, AMPK와 HIF-1α의 활성이 감소되는 신호경로에 대해 알아보기 위한 저해제(inhibitor) 실험을 실시하였다.
Inhibitor 실험을 하기 위해 배양된 세포에 Compound C 10 μM과 cycloheximide 10 μM를 각각 30분전 처리한 후, CoCl2 100 μM를 처리하고 나서, 30분 후에 다시 EGCG 80 μM를 처리하여 6시간 동안 배양하였다.
이러한 실험 결과는 EGCG에 의해 HIF-1α의 발현이 억제된 것으로 보인다. 결과적으로 hypoxia 상태가 아닌 암세포에서 EGCG가 apoptosis 효과를 나타낸다는 것을 확인하였고, 그런 다음에는 hypoxia 상태에서 EGCG의 apoptosis 효과를 알아보기 위하여 Western blotting 실험을 실시하였다.
그 다음에 1×105 개의 세포를 Annexin V-FITC와 prodipium iodide (PI)로 15분간 염색한 후, 2시간 정도 flow cytometry (Becton-Dickinson Biosciences, Drive Frankline Lages, NJ, USA)로 분석하였다.
또한 CoCl2 와 EGCG를 병행 처리하기 위해, media 8 ml에 CoCl2 100 μM를 희석하여 전 처리한 후, 30분 뒤에 CoCl2 100 μM과 EGCG를 농도별(Control, 80 μM)로 media에 희석하여 처리한 후 24시간 배양하였다.
배양된 세포에 CoCl2 100 μM를 30분 전처리 한 후, EGCG를 농도별(10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM)로 병행 처리하여 6시간 동안 배양하였다.
대상 데이터
AMPK 저해제인 Compound C는 CALBIOCHEM (San Diego, CA), HIF-1α 저해제인 cycloheximide는 Sigma에서 구입하여 각각 10 mM로 희석한 뒤 사용하였다.
American Type Culture Collection (ATCC, Gaithersburg, MD)로 부터 B16F10 세포주를 구입하였으며, 배양배지는 10%의 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, Gibco BRL, NY, USA), 1% streptomycin 및 penicillin (Biofluids, Rockville, MD, USA)을 RPMI 1640에 혼합하여, 37℃, 5% CO2 조건에서 confluence 70~80% 정도로 배양되었을 때 실험에 사용하였다.
Louis, MO)에서 구입하여 증류수에 녹인 뒤 100 mM stock으로 만들어 10 mM로 희석한 뒤, -20℃에 보관하여 사용하였다. EGCG는 Sigma에서 구입하여 사용하기 전에 증류수에 녹여서 10 mM stock으로 만들어 사용하였다. AMPK 저해제인 Compound C는 CALBIOCHEM (San Diego, CA), HIF-1α 저해제인 cycloheximide는 Sigma에서 구입하여 각각 10 mM로 희석한 뒤 사용하였다.
본 실험에 사용된 염화코발트(cobalt chloride, CoCl2)는 Sigma (Sigma Aldrich, St. Louis, MO)에서 구입하여 증류수에 녹인 뒤 100 mM stock으로 만들어 10 mM로 희석한 뒤, -20℃에 보관하여 사용하였다. EGCG는 Sigma에서 구입하여 사용하기 전에 증류수에 녹여서 10 mM stock으로 만들어 사용하였다.
데이터처리
각 자료는 3번 이상의 반복된 실험을 통하여 얻어진 결과로 검정하였고 p<0.05인 경우 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.
USA)를 사용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정은 모두 세 번 하였으며, 그에 따르는 평균값과 표준오차는 Microsoft Exel program을 이용하여 분석하였다.
통계 프로그램인 SPSS 17.0을 사용하였고 실험설계에 대한 분산분석은 ANOVA를 실시하여 검정하였다. 각 자료는 3번 이상의 반복된 실험을 통하여 얻어진 결과로 검정하였고 p<0.
이론/모형
Cells were treated with EGCG (control, 5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM) for 24 hr. Cell viability was measured by MTT assay (A). Apoptotic effects were measured by fluorescence-activated cell-sorting analysis.
이러한 apoptosis 유도 효과가 HIF-1α를 포함한 AMPK 신호경로에 의한 것인지를 규명하기 위해 Western blotting 실험을 실시하였다.
성능/효과
EGCG는 파이토케미컬의 일종으로서 항산화, 항염증 효과를 나타내고, 피부암의 성장을 억제한다고 보고되었다[10]. B16F10 세포에 EGCG를 처리했을 때, EGCG가 B16F10 세포에서 apoptosis를 유도하는지를 실험한 결과, Fig. 2A에서와 같이, EGCG 농도가 증가함에 따라 암세포의 증식이 감소하는 것을 관찰하였다. 특히 EGCG를 40 μM로 처리했을 때에는 암세포의 증식이 약 25% 감소되었고, 80 μM로 처리했을 때에는 거의 절반인 약 50%까지 암세포의 증식이 감소되었다.
Cycloheximide를 처리한 결과, HIF-1α의 발현은 감소되었지만, 반면에 p-AMPK의 발현 정도에는 변화가 없었음을 확인하였다.
Fig. 2A에서 보는 바와같이, EGCG를 농도별(None, 5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM)로 처리했을 때, 농도가 증가할수록 B16F10 세포의 증식이 억제되는 것을 확인하였다.
Fig. 3A에서 보는 바와 같이, CoCl2 100 μM을 단독 처리했을 때와, CoCl2 100 μM에 EGCG 80 μM를 병행 처리한 것을 비교했을때, 병행처리 시에 apoptosis가 더 많이 발생한 것을 확인하였다.
Hypoxia 상태인 암세포에서 EGCG의 apoptosis 유도 여부를 실험을 통하여 관찰한 결과, Fig. 3A에서와 같이 hypoxia 상태에서도 EGCG가 apoptosis를 유도할 수 있다는 것을 확인 하였다. 그런데 여기서 흥미로운 점은 Fig.
결과적으로 AMPK는 hypoxia 상태에서 HIF-1α의 upstream으로 작용하여 HIF-1α의 전사 활성을 조절하는 신호 분자이며, hypoxia 상태에서 EGCG는 AMPK의 활성을 억제하여 HIF-1α의 전사 활성을 억제하는데 관여함을 확인할 수있었다.
그 결과 Fig. 4에서 보는 바와 같이, CoCl2 100 μM에서 p-AMPK, HIF-1α의 발현은 모두 증가하였으나, CoCl2 100 μM과 EGCG 80 μM를 병행처리 하였을 때에는 감소하는 것을 관찰하였다.
그 결과, Fig. 4에서 보는 바와 같이, Compound C 처리에 따라 AMPK와 HIF-1α의 발현이 감소된 것을 확인하였다.
또한 Compound C를 병행처리 한 결과, AMPK, HIF-1α의 발현이 감소하였다.
또한 cycloheximide를 처리한 결과 HIF-1α의 발현이 감소된 반면에 AMPK의 활성은 감소되지 않음을 확인할 수 있었다.
마찬가지로 동일한 조건하에서 HIF-1α, AMPK의 활성을 알아보기 위하여 Western blotting 실험을 실시한 결과, Fig. 1B에서 나타난 바와 같이 HIF-1α, p-AMPK의 발현이 모두 증가한 것을 확인하였다.
실험 결과, Fig. 2C에 나타난 바와 같이 AMPK 의 활성은 증가한 반면, HIF-1α의 활성은 감소한 것으로 관찰되었다.
이 같은 apoptosis 효과가 HIF-1α을 포함한 AMPK 신호경로에 의한 것인지를 확인하기 위해 Western blotting 실험을 실시한 결과, Fig. 2C에서와 같이, AMPK의 활성은 증가되었으나, hypoxia 상태에서 발현이 증가하는 HIF-1α의 발현은 감소되었다.
3A에서 보는 바와 같이, CoCl2 100 μM을 단독 처리했을 때와, CoCl2 100 μM에 EGCG 80 μM를 병행 처리한 것을 비교했을때, 병행처리 시에 apoptosis가 더 많이 발생한 것을 확인하였다. 이 결과를 바탕으로 hypoxia 상태에서도 EGCG 처리에 의해 apoptosis가 유도되는 것을 관찰할 수 있었다. 이 같은 apoptosis 유도 효과가 HIF-1α를 포함한 AMPK 신호경로에 의한 것인지를 규명하기 위해 Western blotting 실험을 실시한 결과, Fig.
이러한 암세포의 증식 억제 효과가 apoptosis의 유도에 의한 것인지를 확인하기 위하여 FACS 실험을 통하여 관찰한 결과, Fig. 2B에서 보이는 바와 같이 EGCG를 고농도(40 μM, 80 μM) 로 처리했을 때 apoptosis가 강하게 발생하는 것을 확인하였다.
이와 같은 암세포의 증식 억제 효과가 apoptosis 유도에 의해 일어난 것인지를 알아보기 위해 FACS를 통하여 관찰한 결과, Fig. 2B에서와 같이 EGCG의 고농도(40 μM, 80 μM)에서 apoptosis가 일어나는 것을 확인하였다.
특히 EGCG를 40 μM로 처리했을 때에는 암세포의 증식이 약 25% 감소되었고, 80 μM로 처리했을 때에는 거의 절반인 약 50%까지 암세포의 증식이 감소되었다.
후속연구
결과적으로 AMPK는 hypoxia 상태에서 HIF-1α의 upstream으로 작용하여 HIF-1α의 전사 활성을 조절하는 신호 분자이며, hypoxia 상태에서 EGCG는 AMPK의 활성을 억제하여 HIF-1α의 전사 활성을 억제하는데 관여함을 확인할 수있었다. 또한 hypoxia 상태에서 EGCG는 암세포의 증식을 억제하고 직접적으로 apoptosis를 유도하는데 관여함으로써, 향후 파이토케미컬을 이용한 암 예방 연구에서 있어서 크게 기여할 것으로 여겨진다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
피부암의 종류는?
피부암은 피부의 색소를 형성하는 세포인 멜라닌 세포의 악성 종양으로, 특히 서구 사회에서 피부암 발생이 증가하고 있으며 미국의 경우에는 20년 전과 비교했을 때 발생률이 2배나 증가 하였다. 피부암의 종류에는 기저 세포암(basal cell carcinoma), 편평 세포암(squamous cell carcinoma), 악성 흑색종(malignant melanoma)이 있는데, 이 중에서 악성 흑색종은 전체 피부암의 4% 정도이지만 전체 피부암 사망자의 79%를 차지하고 있다[17]. 이와 같은 악성 흑색종은 피부암 중에서도 독성이 가장 강하며, 전 세계적으로 발생율이 급속히 늘어나고 있는 실정이다.
피부암이란?
피부암은 피부의 색소를 형성하는 세포인 멜라닌 세포의 악성 종양으로, 특히 서구 사회에서 피부암 발생이 증가하고 있으며 미국의 경우에는 20년 전과 비교했을 때 발생률이 2배나 증가 하였다. 피부암의 종류에는 기저 세포암(basal cell carcinoma), 편평 세포암(squamous cell carcinoma), 악성 흑색종(malignant melanoma)이 있는데, 이 중에서 악성 흑색종은 전체 피부암의 4% 정도이지만 전체 피부암 사망자의 79%를 차지하고 있다[17].
피부암이 발병 할 때 위험성은?
이와 같은 악성 흑색종은 피부암 중에서도 독성이 가장 강하며, 전 세계적으로 발생율이 급속히 늘어나고 있는 실정이다. 발병 시에는 임파절로 전이되어 폐, 간, 뼈에 가는 것은 물론 보통 암세포가 전이되지 않는 뇌, 심장 세포에까지 영향을 미칠 만큼 높은 전이율을 나타낸다[14].
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