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문제 정의
- 선정된 4가지 약용식물의 추출물과 β- cyclodextrin과의 초분자체를 함유한 화장품의 안정성을 독성실험을 통하여 확인하고자 하였다. 또한 항균활성과 미생물의 성장억제력에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.
- 본 실험에서는 액체배지를 이용하여 항균활성의 결과를 시간의 경과에 따른 성장속도를 살펴봄으로써 검증하고자 하였다. 약용식물 추출물(B1), 기능성 성분 초분자 복합체(B2)를 함유한 가공 바디워시, 그리고 시판 중에 있는 바디워시(B3)를 이용하여 3종류의 그람 양성균과 효모균에 대한 성장 억제력을 비교 분석하였다(Figure 6).
- 본 연구에서는 기능성 물질들의 함량이 알려져 있는 약용 추출물을 수용성 분자 담지체인 β-cyclodextrin에 포접하여 초분자 복합체를 형성시켜, 기능성의 변화를 살펴봄과 동시에 안정성과 세척제재에 필요한 항균기능에 대하여 살펴보았다.
- 본 연구에서는 기능성 화장품 제조에 사용되는 식물에서 추출되는 많은 기능성 물질들이 상온, 수용액에서 불용성임에 착안하여, 수용성 분자 담지체와 비수용성 기능성 물질의 초분자체를 형성시켜, 수용액 내에서도 안정하게 존재하는 화장품 제재를 개발하고자 한다. 선택된 수용성 담지체는 cyclodextrin인데, 이는 인체에 무해하며, 환상의 고리구조로 인해 안쪽에 소수성의 공동을 가지고 있으며, 외부로 노출되어 있는 수산기가 친수성을 나타낸다(Figure 1).
- 선정된 4가지 약용식물의 추출물과 β- cyclodextrin과의 초분자체를 함유한 화장품의 안정성을 독성실험을 통하여 확인하고자 하였다.
제안 방법
- 각 균들을 평판배지에 도말 접종한 후, 직경 8 mm의 멸균된 paper disk (Advantec Filter Paper, Toyo Roshi Kaisha Ltd, Japan)에 2배 희석한 시료와 양성대조군으로 gentamycin을 각각 25 µL씩 흡수하게 하고 용매를 휘발시킨 후 평판배지의 표면에 밀착시켜 37 ℃에서 24 h 배양하여 나타난 clear zone의 크기를 측정하였다[4].
- 각각의 액체 배지 5 mL에 1 % 시료와 함께 625 nm에서 광학 밀도가 0.2를 나타내도록 희석한 각각의 균들을 0.5 % (25 µL)를 접종하고 37 ℃에서 배양하면서 성장속도를 625 nm에서의 탁도 변화로 측정하였다.
- 그리고 나머지 소수성 유용성분들인 limonene, menthone, fenchone, estragole, βpinene, anethole 확인하기 위해 1 H NMR 분광법을 이용 하여 확인하였다.
- 기능성 화장제재의 경우 불특정 다수 사람의 피부에 장기간 반복적으로 사용될 수 있는 것이므로 안정성 확보가 필수적이다. 따라서 MTT assay를 이용하여 약용 식물 추출물(Ex1)과 기능성 성분 초분자 복합체(Ex2) 의 HDF에 대한 독성을 확인하였다. 측정에 사용된 시료의 내역과 조성은 Table 1에 나타내었다.
- 또한 마지막으로 응집되어 얻어진 초분자 복합체를 물에 다시 분산시켜 나노 크기의 입자 형태로 얻을 수 있는 지에 대해 조사하였다. 조사 방법은 Dynamic Light Scattering (DLS)을 활용하였고, 수용액 농도는 10-4 M 정도로 하여 콜로이드 상태를 유지하도록 한 시료에 대해 조사하였다.
- 초분자 혼합체는 약용식물의 기능성 성분이 함유된 크림, 샴푸, 바디워시 그리고 헤어토닉 제재에 β-cyclodextrin을 혼합하여 제조하였다. 복합체를 함유한 샴푸및 바디워시에서 그람 양성균들과 비듬균으로 알려져 있는 효모에 대한 항균활성과 균 성장억제 효과를 확인하였다. HDF에 대한 독성실험결과에서는 사용가능한 범위에서 세포 독성이 나타나지 않음을 확인하였다.
- 약용식물 추출물 또는 기능성성분 초분자 복합체가 함유된 바디워시 시료들의 미생물 성장에 대한 억제력은 시료를 포함한 배지에서 미생물들의 생육속도를 측정하여 나타내었다. 각각의 액체 배지 5 mL에 1 % 시료와 함께 625 nm에서 광학 밀도가 0.
- 본 실험에서는 액체배지를 이용하여 항균활성의 결과를 시간의 경과에 따른 성장속도를 살펴봄으로써 검증하고자 하였다. 약용식물 추출물(B1), 기능성 성분 초분자 복합체(B2)를 함유한 가공 바디워시, 그리고 시판 중에 있는 바디워시(B3)를 이용하여 3종류의 그람 양성균과 효모균에 대한 성장 억제력을 비교 분석하였다(Figure 6). S.
- 또한 마지막으로 응집되어 얻어진 초분자 복합체를 물에 다시 분산시켜 나노 크기의 입자 형태로 얻을 수 있는 지에 대해 조사하였다. 조사 방법은 Dynamic Light Scattering (DLS)을 활용하였고, 수용액 농도는 10-4 M 정도로 하여 콜로이드 상태를 유지하도록 한 시료에 대해 조사하였다. Figure 3의 히스토그램에서 볼 수 있듯이 pulegone 경우, 수백 나노미터 크기의 입자들이 형성됨을 확인할 수 있었고, 그 평균 사이즈는 약 550 nm 정도로 검출되었는데, 이는 β-cyclodextrin의 cavity 사이즈가 650 nm인 것을 감안하면 포접 가능한 크기이다.
- 화장품 시료의 경우, (1) 아무것도 첨가하지 않은 대조군과, (2) 식물추출물 성분만을 함유하는 화장제재군, (3) 식물추출물 성분과 β-cyclodextrin을 함유하는 화장품제재군, (4) 시판중인 화장제재군 등 4개의 처리군으로 제조하였으며, 명명은 각 시료의 영어단어 첫 자와 아라비아 숫자로 표시하였다.
대상 데이터
- 최종 초분자 복합체는 상온에서 진공으로 건조하였다. Bruker 사의 AVANCE Ⅲ 400 Micro Bay 분광기의 1H NMR 데이터를 복합체 분석에 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 세포주는 인간의 피부 섬유아세포 (HDF, human dermal fibroblast)로써 한국 세포주 은행 (Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 배지는 DMEM medium에 10 % FBS, 1 % penicillin/strepto- mycin을 첨가하여 사용하였고, 37 ℃, 5 % CO2 조건의 배양기에서 2 ～ 3일간 배양한 후 사용하였다.
- 본 연구에 사용한 홍삼(Korean red ginseng), 인진쑥(Artemisia capillaries Thunb), 회향(Foeniculum vulgare Mill), 형개(Schizonepeta tenuifolia Briq)는 금산 재래시장에서 구입하였다. 표준물질인 maltol, adenosine, anethole, estragole, fenchone은 Sigma-Aldrich (USA)사에서 구입하였고 b-pinene, menthone, pulegone, limonene은 Fluka (Switzerland)사에서 구입하였다.
- 본 연구에서는 천연식물 중에서 인체에 무해하고 다량의 기능성 성분을 함유하고 있는 4가지의 약용식물, 홍삼(Korean red ginseng), 인진쑥(Artemisia capillaries Thunb), 형개(Schizonepeta tenuifolia Briq), 회향(Foeniculum vulgare Mill)을 선택하였다. 이들은 한국에서 널리 자생하고 있으며, 기존 연구에서 maltol, adenosine, limonene, menthone, pulegone, fenchone, estragole, β-pinene, anethole과 같은 기능성 성분을 다량 함유하고 있음을 확인한 바 있다[16].
- 실험에 사용한 화장제재(크림, 샴푸, 바디워시, 헤어토닉)의 성분 조성은 Table 1에 나타내었다. 화장품 시료의 경우, (1) 아무것도 첨가하지 않은 대조군과, (2) 식물추출물 성분만을 함유하는 화장제재군, (3) 식물추출물 성분과 β-cyclodextrin을 함유하는 화장품제재군, (4) 시판중인 화장제재군 등 4개의 처리군으로 제조하였으며, 명명은 각 시료의 영어단어 첫 자와 아라비아 숫자로 표시하였다.
- 본 연구에서는 기능성 물질들의 함량이 알려져 있는 약용 추출물을 수용성 분자 담지체인 β-cyclodextrin에 포접하여 초분자 복합체를 형성시켜, 기능성의 변화를 살펴봄과 동시에 안정성과 세척제재에 필요한 항균기능에 대하여 살펴보았다. 초분자 혼합체는 약용식물의 기능성 성분이 함유된 크림, 샴푸, 바디워시 그리고 헤어토닉 제재에 β-cyclodextrin을 혼합하여 제조하였다. 복합체를 함유한 샴푸및 바디워시에서 그람 양성균들과 비듬균으로 알려져 있는 효모에 대한 항균활성과 균 성장억제 효과를 확인하였다.
- 본 연구에 사용한 홍삼(Korean red ginseng), 인진쑥(Artemisia capillaries Thunb), 회향(Foeniculum vulgare Mill), 형개(Schizonepeta tenuifolia Briq)는 금산 재래시장에서 구입하였다. 표준물질인 maltol, adenosine, anethole, estragole, fenchone은 Sigma-Aldrich (USA)사에서 구입하였고 b-pinene, menthone, pulegone, limonene은 Fluka (Switzerland)사에서 구입하였다. β-cyclodextrin는 Aldrich (USA)사 제품을 이용하였다.
- 항균효과를 측정하기 위하여 그람 양성균으로 Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) (3710, KCTC), Staphylococcus aureus (S. aureus) (3881, KCTC), Streptococcus mutans (S. mutans) (3065, KCTC)와 그람 음성균으로 Acinetobacter baumannii (A. baumannii) (2771, KCTC), Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) (2471, KCTC), 그리고 비듬균으로 알려진 효모인 Malassezia furfur (7743, KCTC)를 생물자원 센터(Daejeon, Korea)에서 구입하였고, 그람 음성균인 Escherichia coli (E. coli) O157 : H7 (35150 ATCC)는 America type culture collection (USA)으로부터 분양받아 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 3 ～ 5회 반복 시행되었으며, 결과는 평균± SEM 또는 SD로 나타냈으며, 두 그룹 사이의 유의차는 unpaired Student‘s t-test에 의하여 p ± 0.05 수준에서 검정하였다.
이론/모형
- 비듬균 및 병원성균에 대한 식물추출물, 기능성성분 초분자 복합체가 함유된 바디워시 및 샴푸 시료들의 항균활성은 paper disc 법을 이용하여 측정하였다. 각 균들을 평판배지에 도말 접종한 후, 직경 8 mm의 멸균된 paper disk (Advantec Filter Paper, Toyo Roshi Kaisha Ltd, Japan)에 2배 희석한 시료와 양성대조군으로 gentamycin을 각각 25 µL씩 흡수하게 하고 용매를 휘발시킨 후 평판배지의 표면에 밀착시켜 37 ℃에서 24 h 배양하여 나타난 clear zone의 크기를 측정하였다[4].
- 수용액 상에서 응집되어 형성된 초분자 복합체의 성분과 안정성의 파악하기 위하여 열 중량 분석법(TGA)도 활용하였다. 결과 β-cyclodextrin만의 열중량 분석에서β-cyclodextrin만의 데이터와 기능성 물질들과 포접한 후의 결과가 달랐다.
- 약용식물 추출물과 약용 성분 초분자 복합체의 사람 피부 섬유아세포(HDF)에 대한 세포독성을 측정하기 위하여 MTT assay를 실시하였다. 세포주를 1 × 10⁵ cells/ mL로 96-well plate에 각각 100 µL씩 분취한 다음 24 h 동안 37 ℃, 5 % CO2 배양기에서 배양하고, 이 세포에 다양한 농도의 시료(20 µL)를 처리하였다.
성능/효과
- 측정에 사용된 시료의 내역과 조성은 Table 1에 나타내었다. Ex1과 Ex2를 0.01, 0.1, 1 mg/mL의 농도로 HDF에 처리한 결과 Ex2를 1 mg/mL의 농도로 처리한 군에서 대조군과 비교하였을 때 약 5 % 정도의 세포 사멸을 관찰할 수 있었고, 두 시료 모두 1 mg/mL 이하의 농도에서는 세포 독성의 효과가 없는 것을 확인할 수 있었다(Figure 4). 본 결과에서 기능성 화장제재를 위해 선정된 약용식물 추출물과 약용 성분 초분자 복합체가 세포무독성임이 확인되었다.
- 복합체를 함유한 샴푸및 바디워시에서 그람 양성균들과 비듬균으로 알려져 있는 효모에 대한 항균활성과 균 성장억제 효과를 확인하였다. HDF에 대한 독성실험결과에서는 사용가능한 범위에서 세포 독성이 나타나지 않음을 확인하였다. 본 연구 결과 향후 기능성 화장제재 제조 시 안정성을 확보하였다.
- 약용식물 추출물(B1), 기능성 성분 초분자 복합체(B2)를 함유한 가공 바디워시, 그리고 시판 중에 있는 바디워시(B3)를 이용하여 3종류의 그람 양성균과 효모균에 대한 성장 억제력을 비교 분석하였다(Figure 6). S. mutans를 제외한 나머지 균주에서 B1과 B2 시료에서 효과적인 미생물 성장 억제력을 관찰할 수 있었다. L.
- 결과 pulegone의 경우와 같이 limonene, menthone, fenchone, estragole, β-pinene, anethole 모두에서 β-cyclodextrin에 의한 공명신호뿐만 아니라 각 약용물질에 의한 공명신호도 관찰되었는데 이는 비수용성 약용 성분들이 β-cyclodextrin에 포접되어 초분자 복합체로 수용액 상에 존재하고 있다는 증거이다.
- mutans의 경우, 나머지 균주와 달리 B1, B2가 B3에 비해 성장억제 효과가 적었다(Figure 6C). 결과를 통해 B1, B2는 대조군(BC)에 비해 우수한 항균효과를 가지는 것을 확인할 수 있었고, 이는 식물영양소의 항균 활성 이외의 또 다른 형태의 식물영양소인 phytoncide에 의한 동반 상승작용인 것으로 사료된다. 또한, B1과 B2 시료 처리군의 미생물 성장 곡선이 유사한 것으로 확인됨으로써, 항균활성 측정 실험에서와 동일하게 초분자체의 형성 그 자체가 미생물 성장 억제에기여를 하지 않는 것으로 나타났다.
- 기존 연구에서 선택한 네 종류의 국내자생 약용식물에서 9가지의 기능성 물질을 검출하였고 본 연구에서 각 기능성 물질들이 담지체 β-cyclodextrin과 초분자체를 형성하였음을 확인하였기에, 식물추출물에 다량의 βcyclodextrin을 첨가하면 기능성 물질들과의 포접에 의한 부가기능성을 확인할 수 있다고 사료된다.
- 이로써 cyclodextrin에 의한 초분자체의 형성이 항균활성에는 크게 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다. 또한 추출물이 25 %인 S1과 S2에 비해 추출물의 함유량이 크게 적은 2 %의 시료인 B1과 B2에서 항균효과의 큰 차이점을 관찰할 수 없었으며(Figure 5, Gram+ and Yeast), L. monocytogenes와 S. mutans의 경우, 오히려 추출물 함량이 적은 B1, B2의 항균효과가 다소 좋았는데, 이는 B1과 B2에 첨가된 천연 살균 식물 영양소로 알려진 phytoncide에 의한 것으로 판단된다[20]. 본 실험에 사용한 약용식물 추출물 중에는 이러한 항균활성을 갖는 물질성분의 비중이 상대적으로 적어 나타난 결과로 판단된다.
- 결과를 통해 B1, B2는 대조군(BC)에 비해 우수한 항균효과를 가지는 것을 확인할 수 있었고, 이는 식물영양소의 항균 활성 이외의 또 다른 형태의 식물영양소인 phytoncide에 의한 동반 상승작용인 것으로 사료된다. 또한, B1과 B2 시료 처리군의 미생물 성장 곡선이 유사한 것으로 확인됨으로써, 항균활성 측정 실험에서와 동일하게 초분자체의 형성 그 자체가 미생물 성장 억제에기여를 하지 않는 것으로 나타났다. 항균활성과 시간에 따른 미생물의 성장곡선 실험으로 초분자체의 형성이 항균기능에 중요하지는 않지만, 초분자체의 형성이 항균활성에 나쁜 영향을 미치는 것도 관찰되지 않았다.
- 1, 1 mg/mL의 농도로 HDF에 처리한 결과 Ex2를 1 mg/mL의 농도로 처리한 군에서 대조군과 비교하였을 때 약 5 % 정도의 세포 사멸을 관찰할 수 있었고, 두 시료 모두 1 mg/mL 이하의 농도에서는 세포 독성의 효과가 없는 것을 확인할 수 있었다(Figure 4). 본 결과에서 기능성 화장제재를 위해 선정된 약용식물 추출물과 약용 성분 초분자 복합체가 세포무독성임이 확인되었다. 따라서 향후 기능성 화장품 제조 시 안정성에 관한 과학적 근거를 확보하였다고 사료된다.
- HDF에 대한 독성실험결과에서는 사용가능한 범위에서 세포 독성이 나타나지 않음을 확인하였다. 본 연구 결과 향후 기능성 화장제재 제조 시 안정성을 확보하였다. 추후 본 연구에서 제조한 화장제재가 피부와 육모 등에 미치는 부가기능성 연구를 진행하고자 한다.
- 약용식물 추출물(S1) 및 기능성성분 초분자 복합체(S2)를 함유하여 가공한 샴푸에서 합성 항비듬 성분인 zinc phyrithione (ZPT)이 첨가된 대조군(SC)과 또 다른 합성 항비듬 성분인 climbazole를 포함한 시판 중에 있는 샴푸(S3)보다 높거나 유사한 항균활성이 관찰되었다. 약용식물 추출물 (B1) 및 기능성 성분 초분자 복합체(B2)를 함유한 바디워시에서도 상승효과를 확인하였다. 하지만 약용식물 추출물을 함유한 가공품(S1, B1)과 기능성 성분 초분자 복합체를 함유한 가공품(S2, B2)과의 큰 차이는 관찰되지 않았다.
- 항균활성의 정도는 clear zone의 직경을 측정하여 Table 3에 나타내었다. 약용식물 추출물(S1) 및 기능성성분 초분자 복합체(S2)를 함유하여 가공한 샴푸에서 합성 항비듬 성분인 zinc phyrithione (ZPT)이 첨가된 대조군(SC)과 또 다른 합성 항비듬 성분인 climbazole를 포함한 시판 중에 있는 샴푸(S3)보다 높거나 유사한 항균활성이 관찰되었다. 약용식물 추출물 (B1) 및 기능성 성분 초분자 복합체(B2)를 함유한 바디워시에서도 상승효과를 확인하였다.
- 하지만 약용식물 추출물을 함유한 가공품(S1, B1)과 기능성 성분 초분자 복합체를 함유한 가공품(S2, B2)과의 큰 차이는 관찰되지 않았다. 이로써 cyclodextrin에 의한 초분자체의 형성이 항균활성에는 크게 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다. 또한 추출물이 25 %인 S1과 S2에 비해 추출물의 함유량이 크게 적은 2 %의 시료인 B1과 B2에서 항균효과의 큰 차이점을 관찰할 수 없었으며(Figure 5, Gram+ and Yeast), L.
- 즉 기능성 물질들과 β-cyclodextrin 초분자체가 수용액상에서 β-cyclodextrin과 기능성 물질들과의 포접에 의해 나타나는 새로운 피크를 확인할 수 있었다.
- 즉 기능성물질의 녹는점이 β-cy- clodextrin과의 포접으로 기능성 물질들의 열적안정성이 증가됨을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 본 실험에 사용한 약용식물 추출물 중에는 이러한 항균활성을 갖는 물질성분의 비중이 상대적으로 적어 나타난 결과로 판단된다. 따라서 추출물을 분리 정제하여 성분들의 기능을 규명하는 연구를 통하여 항균기능을 증진시킬 수 있을 것으로 기대된다.
- 본 연구 결과 향후 기능성 화장제재 제조 시 안정성을 확보하였다. 추후 본 연구에서 제조한 화장제재가 피부와 육모 등에 미치는 부가기능성 연구를 진행하고자 한다.
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