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문제 정의
- 그러나 주박의 건물기준 30% 이상인 단백질 성분의 식품첨가물로서 이용에 대한 연구는 이루어지지 않는 실정이고 또한 protease의 혼합을 하여 단백질을 가수분해한 연구는 식육에 대해서만 이루어진 실정이다(10). 따라서 본 연구에서는 상업적으로 쓰이는 효소들을 단일 혹은 혼합으로 탁주박을 처리하여 불용성 쌀 단백질을 수용성 단백질로 분리하고 이렇게 얻어진 가수분해물의 특성과 효소의 혼합에 의한 시너지효과를 연구하였다.
제안 방법
- 6은 탁주박을 효소처리 후 동결건조하여 상업적으로 사용할 수 있는 형태의 분말형태로 제작한 결과이다. SDS PAGE와 마찬가지로 단일과 혼합에서 수용성단백질 생성량이 많았던 Protease, Alcalase, Protease N, Protamex+Alcalase+Protease N을 처리한 시료의 상등액을 동결건조 하여 사진촬영을 하였다. 탁주박의 경우 효소처리 전 시료의 색과 비슷하게 진한 갈색의 형태로써 효소의 종류와는 관계없이 모두 시료 본래의 고유한 색을 나타내었다.
- 단일효소 처리로 얻어진 결과를 토대로 가장 효과가 좋은 효소인 Protamex(Pro), Alcalase(Al) 그리고 Protease N(N)을 각각 다음과 같이 2개 또는 3개의 효소를(Pro+Al, Pro+N, Al+N, Pro+Al+N) 4가지의 방법으로 혼합하여 단일처리와 같은 방법으로 최적 pH와 최적 온도에서 4시간 동안 반응한 후 20분 동안 원심분리(3000×g)하여 상등액과 침전물을 분리, 분석하였다(Fig. 1).
- Louis, MO, USA)를 사용하여 Lowry protein assay(11)를 통하여 측정하였다. 또한 침전물은 digester(MBCM12, Raypa, Spain), distiller (DNP1500, Raypa, Spain)와 titrater(Akku-drive, Hirschmann Laborgerate, Germany)를 사용하여 Semimicro-Kjeldahl (12)법으로 측정하였으며, 무게변화를 통한 불용성 단백질의 변화량을 알아보기 위해 원심분리를 하여 얻어진 침전물을 105℃의 dry oven에서 24시간 건조한 후 처음 시료의 무게와 건조된 침전물의 무게 차이를 이용하여 단백질 변화량을 계산하고 3가지 방법의 값을 비교, 분석 하였다. 이때 각각의 분석방법에 대한 계산식은 다음과 같다.
- 반응이 끝난 현탁액을 20분간 원심분리(3000×g)를 하고 이때 얻어진 상등액과 침전물, 그리고 침전물의 건조 후 무게변화를 통하여 생성된 단백질의 양을 비교하였다(Fig. 1).
- 수용성 성분이 완전히 제거된 탁주박 5g에 증류수(28.3 mL)를 첨가하여 15% 현탁액 형태로 제조하고, 1 N HCl 혹은 1 N NaOH를 사용하여 기존에 알려진 효소들의 최적 pH로 조절하고, 최적 온도에서 시료의 고형분 대비 0.1%의 효소를 첨가한 후 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 현탁액을 20분간 원심분리(3000×g)를 하고 이때 얻어진 상등액과 침전물, 그리고 침전물의 건조 후 무게변화를 통하여 생성된 단백질의 양을 비교하였다(Fig.
- 지방을 제거하기 위해 hexane을 1:1의 비율로 첨가하여 지방을 녹인 후 5분간 원심분리(12000×g)를 하고 침전된 침전물을 시료로 사용하였다. 시료는 0.4 mm의 filter로 여과한 후 amino acid analyzer(Hitachi L-8900, Tokyo, Japan)를 이용하여 분석하였다.
- 시료의 수용성 분획을 제거하기 위해 증류수로 수세를 하였고 수용성분획의 제거는 수세 횟수에 따른 무게변화를 통해 알 수 있었다. 수세 횟수에 따른 무게 변화는 Fig.
- 쌀부산물인 탁주박을 상업적으로 사용되는 8가지 protease를 최적화된 조건에서 단일 혹은 혼합 처리하여 수용성 단백질을 분리하였다. 이렇게 분리된 단백질을 Lowry, Kjeldahl 그리고 건조 방법 등 총 3가지 방법으로 분석을 한 결과 Protamex, Alcalase, Protease N이 가장 높은 분해율을 나타냈으며 이것을 이용하여 3가지 protease를 혼합하여 처리하였을 때 단일처리와 큰 차이가 없는 것을 알 수 있었다.
- 탁주박에 존재하는 수용성 단백질을 제거하기 위해 탁주박 100g에 증류수 400 mL를 가하여 5분간 교반을 한 뒤 이를 20분간 원심분리(3000×g)를 하여 얻어진 침전물을 dry oven에서 24시간 동안 건조하여 무게를 측정하였다.
- 효소를 이용하여 분리한 단백질의 특성을 확인하기 위하여 단일효소를 사용한 경우 수용성 단백질을 가장 많이 생성한 Protamex, Alcalase, Protease N과 혼합효소에서 가장 효과가 좋았던 Protamex+Alcalase+Protease N을 선택하여 SDS-PAGE를 하였다(Fig. 5). 효소처리를 한 샘플에는 어떠한 밴드도 형성이 되지 않는 것을 볼 수 있었는데 이것은 탁주박에 존재하는 단백질이 15 kDa 미만의 작은 크기의 polypeptide 혹은 amino acid의 형태로 분해가 된 것을 의미한다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 탁주박은 인천탁주제조협회에서 탁주 제조 후 생성된 부산물을 수거하여 −19℃에서 냉동 보관하면서 해동하여 사용하였다.
- 시료의 수용성 분획을 제거하기 위해 증류수로 수세를 하였고 수용성분획의 제거는 수세 횟수에 따른 무게변화를 통해 알 수 있었다. 수세 횟수에 따른 무게 변화는 Fig. 2에 나타내었는데, 탁주박을 3회 이상을 수세하였을 때 그 무게 변화가 없는 것을 알 수 있었으며 이때의 횟수만큼 수세한 쌀 부산물을 취합하여 건조한 후 이후 실험의 시료로 사용하였다.
- 이 실험에 사용된 효소들은 상업적으로 널리 사용되는 Protamex(Novozyme, Bagvaerd, Denmark), Neutrase(Novozyme), Flavourzyme (Novozyme), Alcalase(Novozyme), Protease M(Amano, Nagoya, Japan), Protease N(Amano), Protease A(Amano) 그리고 Protease F(Kikkoman, Chiba, Japan)와 같이 총 8가지의 효소를 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- SAS V8.02(Statistical Analysis System)을 사용하여 분산 분석 및 Duncan 다범위 검증(Duncan’s multiple range test)을 실시하였다(13).
이론/모형
- A.O.A.C. 방법에 따라 refrigerated circulator(Isotemp 1006p, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA)를 사용하여 ether 추출을 하는 Soxhelt extraction 방법으로 조지방 함량을 계산하였다.
- A.O.A.C. 방법에 따라 시료 1g을 electric muffle furnace(LMF 1200, Carbolite/Sheffield, England)를 사용하여 550℃에서 overnight한 후 무게를 측정하여 조회분 함량을 계산하였다.
- A.O.A.C. 방법에 따라 시료 2g을 forced convection dry oven(HB-502M, Hanbaek scientific Co., Korea)을 이용하여 105℃에서 overnight한 후 무게를 측정하여 수분함량을 계산하였다.
- 단백질분석은 총 3가지의 방법으로 분석되었다. 원심분리를 하여 얻어진 상등액 중의 수용성 단백질은 TP0300-1KT Kit(Sigma, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 Lowry protein assay(11)를 통하여 측정하였다. 또한 침전물은 digester(MBCM12, Raypa, Spain), distiller (DNP1500, Raypa, Spain)와 titrater(Akku-drive, Hirschmann Laborgerate, Germany)를 사용하여 Semimicro-Kjeldahl (12)법으로 측정하였으며, 무게변화를 통한 불용성 단백질의 변화량을 알아보기 위해 원심분리를 하여 얻어진 침전물을 105℃의 dry oven에서 24시간 건조한 후 처음 시료의 무게와 건조된 침전물의 무게 차이를 이용하여 단백질 변화량을 계산하고 3가지 방법의 값을 비교, 분석 하였다.
- 효소처리 후의 시료는 SDS(Sodium dodesyl sulfate)를 포함하는 polyacrylamide gel을 이용한 Laemmli(1970)의 방법에 따라서 전기영동을 하였다. Separating gel은 10% acrylamide gel을 사용하였고, running gel은 H2O 1.
성능/효과
- Fig. 3에서 볼 수 있듯이 전체적인 패턴이 비슷한 형태를 나타내어 수용성 단백질 생성량을 비교 분석함에 있어서 Lowry protein assay, Kjeldahl protein assay 및 건조방법 등 3가지 방법 모두 수용성 단백질의 생성량을 측정하는데 적절함을 알 수 있었다. 특히 Lowry protein assay와 Kjeldahl protein assay의 값의 경우 Protamex를 처리한 시료는 88.
- 4). 가장 분해능력이 큰 Alcalase 단독으로 처리한 것에 비하여 Alcalase와 다른 두 가지 효소들을 각각 하나씩 또는 두 개 모두를 혼합하여 단백질을 분해하여도 이들간의 유의적인 차이가 나타나지 않음을 확인할 수 있었다. 이는 탁주박의 불용성 단백질 중 분해가 가능한 부분이 Alcalase에 의해 완전히 분해가 되어 더 이상 다른 효소들에 의해 분해가 일어나지 않는 것이기 때문으로 생각된다.
- Lowry 방법의 경우 Alcalase가 가장 큰 분해 정도를 나타내었고 Protease N과 Protamex의 순으로 분해 정도가 큰 것으로 나타났다. 건조 방법의 경우 Alcalase가 가장 큰 분해 정도를 나타내었고, 그 다음 Protease N, Protease M, Protamex의 순으로 분해 정도가 나타났으며, 이 중 Protease M과 Protamex의 경우 유의적으로 차이가 없는 것으로 나타났다. Kjeldahl의 경우 Alcalase가 가장 큰 분해 정도를 나타내었고, Protamex가 두 번째로 큰 분해 정도를 나타내었으며, 나머지 37.
- 단일 효소처리를 하여 가장 높은 분해율을 나타낸 Protamex, Alcalase, Protease N 세가지 효소를 두 개씩 또는 세가지 모두를 혼합하여 탁주박의 단백질을 분해한 결과 Lowry protein assay의 경우 Alcalase와 3가지 효소를 모두 혼합한 것을 비교하였을 때 단일처리 한 것은 117.41 mg/g, 혼합의 경우 131.72 mg/g으로 나타났으며, 건조방법의 경우 단일처리 198.50 mg/g, 혼합처리 207.85 mg/g으로, Kjeldahl의 경우 단일처리 122.01 mg/g, 혼합처리 118.65 mg/g으로 모든 방법에서 단일처리에 비해 유의적인 상승 효과는 없는 것으로 나타났다(Fig. 4). 가장 분해능력이 큰 Alcalase 단독으로 처리한 것에 비하여 Alcalase와 다른 두 가지 효소들을 각각 하나씩 또는 두 개 모두를 혼합하여 단백질을 분해하여도 이들간의 유의적인 차이가 나타나지 않음을 확인할 수 있었다.
- 탁주박의 경우 효소처리 전 시료의 색과 비슷하게 진한 갈색의 형태로써 효소의 종류와는 관계없이 모두 시료 본래의 고유한 색을 나타내었다. 동결건조 후 시료에는 탁주박 특유의 막걸리 향은 더 이상 존재하지 않았으며, 식품에 protease를 처리하였을 때 가장 큰 문제점인 쓴맛은 미미하게 남아 있었다.
- 탁주박과 유사한 보리부산물인다섯 개의 효소의 경우 유의적으로 차이가 없는 것으로 나타났다. 따라서 세가지 방법 모두에서 유의적으로 분해 정도의 차이가 큰 Protamex, Alcalase, Protease N 등 3가지 단백질 분해 효소가 가장 효과가 좋음을 알 수 있었다. 또한 단백질 분해율을 알아보기 위해 실제 침전물을 비교해서 전체 양과의 차이를 계산한 Kjeldahl의 경우 Alcalase가 전체 단백질의 37.
- 즉 일단 단백질보다 사이즈가 작은 polypeptide나 amino acid로써 분해된 것을 뜻하고 실제로 섭취하였을 때는 trypsin이나 chymotrypsin의 효소적인 분해 없이도 흡수할 수 있는 식품첨가물로써 활용도가 높은 단백질로 분해 되었음을 알 수 있었다. 또한 아미노산의 경우 lysine의 함량이 적기 때문에 단백질의 유래가 탁주박에 존재하는 효모가 아닌 쌀이라는 것을 알 수 있었으며 총 아미노산의 함량은 효소 3개를 모두 혼합하였을 때 가장 높은 것을 알 수 있었다. 전체적으로 필수아미노산 8가지 중 4가지의 함량이 일반 쌀보다 높은 것을 알 수 있었는데 이것은 각 효소마다 작용하는 기질이 정해져 있고 효소의 개수가 많을수록 아미노산의 생성확률이 높아져서 총 아미노산의 함량이 효소를 모두 혼합하였을 때 가장 높아진 것으로 생각된다.
- 일반적으로 탁주박에는 lysine이 풍부한 효모가 다량 존재하지만 이번 시료의 경우 lysine의 함량이 적은 것으로 보아 탁주박으로 부터 분리한 단백질은 대부분 쌀로부터 유래하였다고 판단된다. 또한 필수아미노산의 경우 isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine의 함량이 일반 쌀에 비해 높았으며 총 아미노산의 경우 Protamex+ Alcalase, Protamex+Protease N, Alcalase+Protease N, Protamex +Alcalase+Protease N의 값이 각각 0.0278, 0.0266, 0.0265, 0.0370 g/g으로써 모든 효소를 혼합하였을 때 총 아미노산의 함량이 가장 높은 것을 알 수 있었고 두 개만을 혼합하였을 때는 거의 차이가 없는 것을 확인할 수 있었다.
- 쌀부산물인 탁주박을 상업적으로 사용되는 8가지 protease를 최적화된 조건에서 단일 혹은 혼합 처리하여 수용성 단백질을 분리하였다. 이렇게 분리된 단백질을 Lowry, Kjeldahl 그리고 건조 방법 등 총 3가지 방법으로 분석을 한 결과 Protamex, Alcalase, Protease N이 가장 높은 분해율을 나타냈으며 이것을 이용하여 3가지 protease를 혼합하여 처리하였을 때 단일처리와 큰 차이가 없는 것을 알 수 있었다. 효소처리를 하여 얻어진 단백질의 사이즈를 알아보기 위해 SDS PAGE를 한 결과 어떠한 밴드도 형성이 되지 않았고 이는 단백질이 마커의 최소사이즈 15 kDa보다 작은 것을 의미한다.
- 또한 아미노산의 경우 lysine의 함량이 적기 때문에 단백질의 유래가 탁주박에 존재하는 효모가 아닌 쌀이라는 것을 알 수 있었으며 총 아미노산의 함량은 효소 3개를 모두 혼합하였을 때 가장 높은 것을 알 수 있었다. 전체적으로 필수아미노산 8가지 중 4가지의 함량이 일반 쌀보다 높은 것을 알 수 있었는데 이것은 각 효소마다 작용하는 기질이 정해져 있고 효소의 개수가 많을수록 아미노산의 생성확률이 높아져서 총 아미노산의 함량이 효소를 모두 혼합하였을 때 가장 높아진 것으로 생각된다. 상대적으로 효소를 두 개 혹은 세 개로 혼합하였을 때 생성된 총 단백질 함량은 비슷하였지만 총 아미노산의 함량은 적었기 때문에 두 개의 효소를 혼합한 샘플들은 효소에 의해 아미노산으로 분해되지 못한 polypeptide가 모든 효소를 혼합한 샘플에 비해 더 많이 존재할 것으로 생각된다.
- 효소처리를 하여 얻어진 단백질의 사이즈를 알아보기 위해 SDS PAGE를 한 결과 어떠한 밴드도 형성이 되지 않았고 이는 단백질이 마커의 최소사이즈 15 kDa보다 작은 것을 의미한다. 즉 일단 단백질보다 사이즈가 작은 polypeptide나 amino acid로써 분해된 것을 뜻하고 실제로 섭취하였을 때는 trypsin이나 chymotrypsin의 효소적인 분해 없이도 흡수할 수 있는 식품첨가물로써 활용도가 높은 단백질로 분해 되었음을 알 수 있었다. 또한 아미노산의 경우 lysine의 함량이 적기 때문에 단백질의 유래가 탁주박에 존재하는 효모가 아닌 쌀이라는 것을 알 수 있었으며 총 아미노산의 함량은 효소 3개를 모두 혼합하였을 때 가장 높은 것을 알 수 있었다.
- 56%의 분해율을 나타내었다. 탁주박과 유사한 보리부산물인다섯 개의 효소의 경우 유의적으로 차이가 없는 것으로 나타났다. 따라서 세가지 방법 모두에서 유의적으로 분해 정도의 차이가 큰 Protamex, Alcalase, Protease N 등 3가지 단백질 분해 효소가 가장 효과가 좋음을 알 수 있었다.
- 탁주박의 일반성분을 Table 1에 나타내었다. 탁주박은 쌀에 비해 상대적으로 높은 조단백질 함량을 나타내었는데 이는 탁주를 제조하는 과정에서 알코올 발효에 의해 쌀전분과 같은 탄수화물은 줄어드는 반면 단백질은 상대적으로 변화가 없어 결과적으로 쌀에 비해 높은 단백질 함량을 나타낸 것으로 판단된다.
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