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문제 정의
- 과 이후 몇 가지 생화학적 특성에 대한 연구에도 불구하고 정확히 구명된 바가 없었다. 본 연구는 전보5)에서 보고된 누에 유충의 hemagglutinin과, 본 연구에서 보고하고자 하는 정제 후의 렉틴성분과의 비교를 통해 전보14)에서 보고된 면역증강물질로서의 가능성에 대한 생화학적 뒷받침을 마련하고자 한다.
제안 방법
- 200 mM로 조제한 당 용액을 30 µl씩 취하여 U-shape microtiter plate 에서 연속 2배수 희석법으로 희석한 뒤, 각 well에 64 HU (Hemagglutination Unit)의 응집력을 나타내는 렉틴 용액을 30 µl 가하고, 그 위에 3% 토끼 적혈구 용액을 30 µl씩 가하였다.
- 적하된 단백질 단편들은 337 nm의 N2 laser조사에 의해 기화된 다음, 20 Kv injection pulse에 의해 가속되었다. 300 laser shots의 누적 peaks에 의해 각각의 단백질 단편에 대한 mass spectrum을 구하였다.
- 으로 실시하였다. 480 nm에서 흡광도를 측정하여 표준 검정 곡선으로부터 당 함량을 측정하였다. SDS-PAGE − Laemmli22)방법으로 discontinuous buffer system으로 실시하였다.
- Mass Spectrometry Analysis − 단백질 단편들은 modified porcine trypsin을 이용하여 작은 단편으로 분해하였고, 젤 조각으로부터 SDS, 유기용매, 염색시약 등의 불순물을 제거하기 위하여 50% acetonitrile로 세척하였으며, 단백질 분해반응은 0.5% trifluoroacetic acid를 5 µl 첨가함으로써 종결시켰다.
- pH의 영향 − 렉틴을 pH 2~11사이의 여러 가지 완충액으로 4시간 동안 4℃에서 투석시킨 후 렉틴 활성을 조사하였다.
- 그 위에 3%적혈구 용액 50 µl를 가하여 상온에서 30분간 방치한 뒤에 세포 응집력을 조사하였다2).
- 금속이온의 영향 − Ba(OH)2, CaCl2, FeCl2, HgCl2, MgCl2, MnCl2, ZnCl2 등과 착물 형성제인 EDTA를 0.05 mM~10 mM 로 조제한 뒤 렉틴을 50 µl씩 연속 2배수 희석법으로 희석한 well에 금속이온 용액을 50 µl씩 가하였다.
- 3 M까지 증가시켜 단백질 성분을 유출시켰고, 얻어진 각각의 분획은 280 nm에서 흡광도를 측정하고 렉틴 활성을 시험하였다. 렉틴 활성이 나타난 분획을 Sartorius ultramembrane과 Aquacid 등을 이용하여 농축하였고, 이를 Sephadex G-200 column에 통과시켜 더욱 순수하게 정제를 수행하였으며, 각 분획을 렉틴 활성실험을 통해 확인하고 농축하였다.
- 렉틴의 적혈구 응집력 시험은 U-shape microtiter plate (Falcon) 각각의 well에 생리식염수 50 µl를 첫 번 well에서부터 연속 2배수 희석한 후, 채혈한 혈액을 생리식염수로 세척하여 조제한 3% 적혈구 용액을 가한 뒤 상온에서 1시간 정도 방치시킨 후 육안 또는 현미경으로 관찰하였다.
- 온도의 영향 − 렉틴의 열 안정성을 조사하기 위해 10~90℃범위의 온도에서 30분간 가온 한 후, 즉시 얼음으로 식힌 다음 적혈구 응집 반응을 이용하여 렉틴 활성을 측정하였다.
- Sephadex G-200 column chromatography에서 활성이 나타나지 않은 분획을 대조군으로 하여 활성이 있는 분획과 함께 loading하였고, 그 결과 활성이 있는 분획에만 존재하는 4개의 band를 확인할 수 있었다. 이 4개의 band (a, b, c, d)를 추출한 뒤 mass spectrometry 분석을 이용하여 단백질 동정을 하였다. 이들 중에 두 개의 band (a, b)는 Fig.
- 혈구 응집력 시험 − 실험에 사용한 모든 적혈구는 Nowak 등의 방법16)에 따라 trypsin-glutaraldehyde로 고정하였는데 생리식염수로 세척한 4% 적혈구에 0.1% trypsin을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 PBS로 4번 세척하여 1% glutaraldehyde가 첨가된 20% 용액으로 만들었다.
대상 데이터
- 1과 같은 결과를 얻었다. 25 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.4)에 NaCl의 농도를 단계적으로 증가시켰을 때 0.05 M 분획에서 가장 강한 렉틴 활성을 나타내 0.05 M 분획물을 대상으로 다음 정제 단계의 시료로 사용하였다. Sephadex G-200 column으로 최종 정제한 결과는 Fig.
- 실험재료 − 누에나방과에 속하는 누에나방 (Bombyx mori)의 5령 유충을 경북 상주시에서 구입하여 실험재료로 사용하였다.
- 4~12% polyacrylamide gel을 이용하여 100 volt에서 2 hr 동안 running시켰고, 전기영동 후 gel은 Coomassie blue를 이용하여 염색하였다. 표준 단백질로는 10~175 kDa의 broad range를 사용하였다.
데이터처리
- Mass spectrum의 분석을 위해서 trypsin의 자가분해에 의해 생성된 peptide의 ion peak m/z (842.510,2211.1046)를 표준 peaks로 이용하였고, 분석이 완료된 mass spectrum으로부터 단백질 동정을 위하여 MASCOT program (http:// www.matrixscience.com/)을 이용하였다.
이론/모형
- SDS-PAGE − Laemmli22)방법으로 discontinuous buffer system으로 실시하였다.
- 단백질 함량 분석 − Lowry 등20)의 방법에 따라 소 혈청 알부민 (BSA)을 표준품으로 사용하였으며, 각각의 시료는 540 nm에서 흡광도를 측정하여 표준 검정 곡선으로부터 단백질 함량을 분석하였다.
- 당 특이성 − 적혈구 응집력 저해 효과는 Iglesias 등19)의 방법에 따라 여러 당류를 사용하여 실시하였다.
- 당 함량 분석 − 렉틴의 당 함량은 만노오스를 표준품으로 하여 Anthron 방법21)으로 실시하였다.
- 렉틴(BML)의 분리 및 정제 − 누에에서 분리한 렉틴 (이하 BML)은 Chung 등2)의 방법에 따라 ammonium persulfate로 추출한 후, DEAE Sephadex A-50 column을 통해 NaCl의 농도를 0.05 M, 0.1 M, 0.15 M, 0.2 M, 0.3 M까지 증가시켜 단백질 성분을 유출시켰고, 얻어진 각각의 분획은 280 nm에서 흡광도를 측정하고 렉틴 활성을 시험하였다.
성능/효과
- 또한 Glossina 내에서 발견되어진 여러 종의 hemolymph lectin 중에서 단백질성 렉틴은 50℃ 미만에서 열 안정성을 가지는 반면 당단백질인 렉틴 종류에서는 65℃ 이상에서 열 안정성을 가지는 것을 확인할 수가 있었다.3) 따라서 앞서 관찰한 BML의 높은 열 안정성은 다른 종에 비해 비교적 높은 당의 함량이 영향을 미치는 것으로 사료되어진다.
- 이러한 당 특이성은 다른 곤충류에서는 쉽게 발견할 수 없는 누에 렉틴만의 특이성으로서 다른 곤충렉틴과는 생물학적 역할에서 분명한 차이가 있음을 반영하는 것으로 체벽의 손상에도 렉틴의 증가가 나타나지 않았음을 보고하였다.3,5,6) 헤파린에 특이적인 성분은 주로 포유류 렉틴에서 많이 발견되어지는 것으로, human platelets에서 발견된 TPS나 사람의 림프구와 내피세포 (endothelial cell)에서 발견되는 PECAM1, mammalian NK cell에서 발견된 neural cell adhesion molecule등이 있다. 그리고 쥐의 뇌에서 발견된 heparin binding p30등이 있으나 타 곤충류에서는 찾아볼 수 없었던 것이며, 매우 이례적으로 하등무척추 동물인 조개류의 꼬막에서 혈림프 렉틴인 Anadarin MS가 조직 발달과정에서 그 기능을 하고 있음이 보고된 적은 있다.
- 35,36) 특히 Bombyx mori의 트랜스페린의 경우 laminarin, LPS, peptidoglycan 등 다양한 microbial 성분에 의해 정상의 경우보다 16배 이상의 증가를 나타낸다고 알려져 있다.36) 따라서 본 연구에서 BML이 Fe2+의 의존성을 나타낸다는 결과와 LPS binding에 대한 보고8)가 있는 것으로 종합하여 볼 때 트랜스페린이 BML에서 분리되지 않고 모종의 역할을 하는 물질로 추정되어진다. 또 다른 두 개의 band는 알려지지 않은 미동정 단백질로 밝혀졌다.
- 한국산 누에 유충으로부터 ammonium sulfate와 anion exchange column chromatography인 DEAE Sephadex A50, gel filtration column chromatography인 Sephadex G200를 이용하여 letin을 분리 정제하였고, 이를 BML이라고 명명하였다. BML은 사람의 적혈구에는 응집현상을 나타내지 않았고, rabbit과 chicken의 적혈구, Rat의 림프구에서 높은 응집현상을 나타냈다. pH에 대한 활성 효과는 강산과 강염기에서 억제되었고, 다른 렉틴보다 높은 열 안정성을 보였는데, 이는 17.
- 4과 같이 나타났다. Sephadex G-200 column chromatography에서 활성이 나타나지 않은 분획을 대조군으로 하여 활성이 있는 분획과 함께 loading하였고, 그 결과 활성이 있는 분획에만 존재하는 4개의 band를 확인할 수 있었다. 이 4개의 band (a, b, c, d)를 추출한 뒤 mass spectrometry 분석을 이용하여 단백질 동정을 하였다.
- BML은 사람의 적혈구에는 응집현상을 나타내지 않았고, rabbit과 chicken의 적혈구, Rat의 림프구에서 높은 응집현상을 나타냈다. pH에 대한 활성 효과는 강산과 강염기에서 억제되었고, 다른 렉틴보다 높은 열 안정성을 보였는데, 이는 17.16%의 당 함량으로 인한 열 안정성이 생성되는 것으로 보였으며, 다른 렉틴들과는 달리 BML은 90℃까지 렉틴의 활성이 관찰되었다. 금속이온 중에서 특히 Ca2+과 Fe2+, Mn2+ 의존성을 나타낸 반면, Mg2+에 의해 억제되었다.
- pH의 영향 − pH 변화에 따른 BML의 적혈구 응집력 변화는 Table II와 같다. 강산 (pH 2~4)에서는 활성이 없거나 매우 불안정한 활성을 나타내고, 약산성 (pH 5)과 강염기 (pH 10)에서는 비교적 안정함을, 중성 및 약염기 (pH 6~9)에서는 렉틴 활성이 매우 안정되었다. 이 결과에서 뽕나무 잎만 먹는 누에와는 달리 부식물이 섞인 토사와 목재 등에서 서식하는 곤충인 장수풍뎅이 (Allomyrina dichotoma) 등은 pH에 영향을 거의 받지 않는 점을 발견하였고, 이와 비교하였을 때 매우 다르다는 것을 확인할 수 있는 결과였다.
- 금속 이온의 영향 − Ba(OH)2, CaCl2, FeCl2, HgCl2, MgCl2, MnCl2, ZnCl2 등과 EDTA를 0.05 mM 농도에서부터 10 mM 까지의 범위에서 시험한 결과, BML의 활성은 금속 이온 의존성으로 특히 Ca2+, Fe2+, Mn2+에 강한 의존성을 보이는 반면 Mg2+에 억제되고, Hg2+에 용혈현상을 나타냈다.
- 단백질 함량 분석 − 누에 유충 700 g을 extraction한 렉틴은 4.35배 정제되었고 46.5% 회수되었고, DEAE Sephadex A-50의 0.05 M 분획에서는 14.96배 정제되었으며, 16.3% 회수되었다.
- 당 특이성 − 당에 의한 적혈구 응집력저해 현상을 조사한 결과 (Table IV), 단당류에 의한 저해 현상이 나타났다.
- 당 함량 분석 − 당 함량을 측정한 결과 crude 렉틴은 0.72%, DEAE Sephadex A-50 분획은 3.72%, Sephadex G200에 의해 정제된 BML은 17.16%의 당을 함유한 당단백질로 밝혀졌다.
- 16%의 당을 함유한 당단백질로 밝혀졌다. 당의 함량은 렉틴의 열 안정성과 관련이 있는 것으로 사료되어지는 바, 표고버섯(Lentinus edodes)21)은 8.96%의 당을 함유하고 있고 40℃까지 안정한 응집력을 가지고, 후추버섯(Lactarius piperatus)25)은 9.8%의 당을 함유하고, 55℃까지 열 안정성을, 별불가사리(Asterina pectinifera)30)에서는 8.96%에, 40℃까지 열 안정성을 가지며, ADL은 0.47%의 매우 미비한 양의 당을 함유하고 있고 40℃ 이하에서 열 안정성을 나타내는 것으로 확인 되었다. 또한 Glossina 내에서 발견되어진 여러 종의 hemolymph lectin 중에서 단백질성 렉틴은 50℃ 미만에서 열 안정성을 가지는 반면 당단백질인 렉틴 종류에서는 65℃ 이상에서 열 안정성을 가지는 것을 확인할 수가 있었다.
- 47%의 매우 미비한 양의 당을 함유하고 있고 40℃ 이하에서 열 안정성을 나타내는 것으로 확인 되었다. 또한 Glossina 내에서 발견되어진 여러 종의 hemolymph lectin 중에서 단백질성 렉틴은 50℃ 미만에서 열 안정성을 가지는 반면 당단백질인 렉틴 종류에서는 65℃ 이상에서 열 안정성을 가지는 것을 확인할 수가 있었다.3) 따라서 앞서 관찰한 BML의 높은 열 안정성은 다른 종에 비해 비교적 높은 당의 함량이 영향을 미치는 것으로 사료되어진다.
- Galactose와 glucose에 의해 비교적 약한 저해를 나타냈으나 mannose와 galacturonic acid에 보다 강한 저해를 나타냈으며 glucuronic acid에 의해 가장 강한 저해를 보였다. 또한 특이적으로 헤파린 (heparin) 저해가 강하게 나타남을 확인하였다. 이는 Suzuki and Natori의 보고5)와 동일하였으며, Kitagaki 등,33) Amanai 등6)과는 유사한 결과였다.
- 2와 같았다. 실험결과 0.1 M NaCl을 포함한 25 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.4) 분획에서 가장 강한 응집력을 나타내었고 이 분획을 BML로 명명하였다. 이는 전보14)에서 사용한 것과 동일한 시료로 면역증강 물질로 가능성을 확인했던 BML 을 대상으로 생화학적 특성을 조사하였다.
- 강산 (pH 2~4)에서는 활성이 없거나 매우 불안정한 활성을 나타내고, 약산성 (pH 5)과 강염기 (pH 10)에서는 비교적 안정함을, 중성 및 약염기 (pH 6~9)에서는 렉틴 활성이 매우 안정되었다. 이 결과에서 뽕나무 잎만 먹는 누에와는 달리 부식물이 섞인 토사와 목재 등에서 서식하는 곤충인 장수풍뎅이 (Allomyrina dichotoma) 등은 pH에 영향을 거의 받지 않는 점을 발견하였고, 이와 비교하였을 때 매우 다르다는 것을 확인할 수 있는 결과였다. 한편 완두콩 (Pisum sativum)23)은 pH 5~10에서 안정함을, 방울토마토 (Lycopersicum esculentum ver.
- 이외 동물성 렉틴 중에서 새우류인 대하 (Fenneropenaeus chinensis)28)는 70℃, 바나나 새우 (Fenneropenaeus merguiensis)29)는 55℃ 이하에서 안정성을 나타냈고, 별불가사리 (Asterina pectinifera)30)에서는 40℃에서 안정성을 나타냈음이 보고되었다. 이는 렉틴의 열 안정성이 종 다양성이 있음을 보여주는 결과이며, 누에는 특히 높은 온도에서 열 안정성을 나타내는 것을 알 수 있었다. 고온에서의 렉틴의 안정성에 대한 보고로는 열대성 다육식물인 호접무 (Kalanchoe crenata)31)에서도 보고되었다.
- 균류 렉틴인 표고버섯 (Lentinus edodes)21)은 누에처럼 사람에서는 응집을 나타내지 않은 반면에 mouse와 rat, 토끼 적혈구에서 응집을 나타낸다고 보고되었다. 이는 렉틴이 분리되는 생물의 종에 따라 응집시키는 혈구의 종류가 다르다는 것을 의미하며, 렉틴의 혈구 응집 특이성은 종에 따른 특이성을 나타낸다는 것을 확인하였다.
- 20~40℃에서는 매우 안정되었고, 50℃이상에서도 계속 안정 되었으나 90℃에서는 다소 감소하였다. 이와는 달리 다른 곤충렉틴을 보면 장수풍뎅이 렉틴 (ADL)은 40℃ 이하에만 활성이 안정되었고, 균류인 버섯렉틴의 경우, 표고버섯 (Lentinus edodes)21)은 40℃, 후추버섯 (Lactarius piperatus)25)은 55℃, 그리고 차가버섯 (Arimillaria luteo-virens)26)은 70℃ 이하에서 열 안정성을 나타내는 다양성을 보였으며, 식물성 렉틴의 경우 방울토마토 (Lycopersicum esculentum ver.)24)는 50℃, 완두콩 (Pisum sativum)종자23)는 60℃, 그리고 바나나 (Musa acuminata)27)는 80℃ 이하에서 열 안정성을 나타냈다. 이외 동물성 렉틴 중에서 새우류인 대하 (Fenneropenaeus chinensis)28)는 70℃, 바나나 새우 (Fenneropenaeus merguiensis)29)는 55℃ 이하에서 안정성을 나타냈고, 별불가사리 (Asterina pectinifera)30)에서는 40℃에서 안정성을 나타냈음이 보고되었다.
- 3% 회수되었다. 최종 정제된 BML에서는 39.41배 정제되었고 6.5% 회수되었다 (Table V). 이는 Suzuki and Natori에 의한 정제5)에 의해 6~10%의 회수율과 비교하였을 때 유사함을 보였고, Amanai et al.
- 혈구 응집력 시험 − BML에 대하여 사람 및 토끼 적혈구, Rat의 림프구로 렉틴 활성도를 조사한 결과 사람 적혈구에서는 용혈현상 (hemolysis)을 나타내었고, 닭과 토끼 적혈구, Rat의 림프구 등에서 응집을 나타내었다 (Table I).
후속연구
- 따라서 미동정 단백질들이 혈구 응집력을 가지는 렉틴이라고 사료되어지는 바, 약 51 kDa, 42 kDa의 분자량으로 추정되는 이 두 개의 band (c, d)는 렉틴성분의 subunit으로 간주된다. 그러나 추후 이들의 amino acid sequence 및 분자량 등을 조사하는 연구를 계속 수행하여야할 것이다.
- 당에 의한 응집 저해 효과는 heparin과 glucuronic acid에서 강한 특이성을 나타내었다. 추후 누에 렉틴의 amino acid sequence와 구조를 밝히는 작업 등, 누에의 렉틴 성분에 대한 생화학적 성질 규명에 관한 연구가 계속되어야 할 것이다.
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