로즈마리(Rosmarinus officinalis L.) 추출물로부터 Helicobacter pylori에 대한 항균물질 분리 및 동정 Isolation and Identification of Antimicrobial Compounds against Helicobacter pylori from Rosemary (Rosmarinus officinalis L.) Extracts원문보기
로즈마리 추출물의 phenol 함량은 25.7 mg/g으로 매우 높게 나타났다. Helicobacter pylori 에 대한 항균효과를 측정한 결과, clear zone이 $100{sim}200{\mu}/disc$의 phenol 농도에서 각각 11, 12, 14 mm의 clear zone을 형성하여 추출물의 농도가 증가할수록 H. pylori 에 대한 저해효과가 농도 의존적으로 높아지는 것을 확인 할 수 있었다. Sephadex LH-20과 MCI-gel CHP-20 column을 이용하여 normal phase type인 $ethanol{\rightarrow}H_2O$와 reverse phase type인 $H_2O{\rightarrow}methanol$로 용액의 농도를 증가시키면서 용출한 결과 H. pylori에 대한 탁월한 저해활성을 나타낸 5종류(compound A~E)의 단일 물질로 분리하였다. 5가지 각각의 물질은 H. pylori에 대한 항균력이 미약하였으나, 2종류 이상의 다중 물질의 항균 시너지 효과에 의해 각각 10~16 mm의 clear zone을 형성하여 우수한 항균력을 나타내었으며, fast atom bombardment (FAB)-Mass, $^1H$-NMR, $^{13}C$-NMR과 IR spectrum을 사용하여 구조 동정한 결과 protocatechuic acid, coumaric acid, caffeic acid, chlorogenic acid 및 rosmarinic acid 인 것으로 확인되었다.
로즈마리 추출물의 phenol 함량은 25.7 mg/g으로 매우 높게 나타났다. Helicobacter pylori 에 대한 항균효과를 측정한 결과, clear zone이 $100{sim}200{\mu}/disc$의 phenol 농도에서 각각 11, 12, 14 mm의 clear zone을 형성하여 추출물의 농도가 증가할수록 H. pylori 에 대한 저해효과가 농도 의존적으로 높아지는 것을 확인 할 수 있었다. Sephadex LH-20과 MCI-gel CHP-20 column을 이용하여 normal phase type인 $ethanol{\rightarrow}H_2O$와 reverse phase type인 $H_2O{\rightarrow}methanol$로 용액의 농도를 증가시키면서 용출한 결과 H. pylori에 대한 탁월한 저해활성을 나타낸 5종류(compound A~E)의 단일 물질로 분리하였다. 5가지 각각의 물질은 H. pylori에 대한 항균력이 미약하였으나, 2종류 이상의 다중 물질의 항균 시너지 효과에 의해 각각 10~16 mm의 clear zone을 형성하여 우수한 항균력을 나타내었으며, fast atom bombardment (FAB)-Mass, $^1H$-NMR, $^{13}C$-NMR과 IR spectrum을 사용하여 구조 동정한 결과 protocatechuic acid, coumaric acid, caffeic acid, chlorogenic acid 및 rosmarinic acid 인 것으로 확인되었다.
Rosmarinus officinalis extracts had a significant antimicrobial activity against Helicobacter pyori. Total phenolic contents and inhibition zone of rosemary extracts were estimated to be 25.7 mg/g and 14 mm at $200{\mu}g/mL$ of phenolic contents, respectively. The Sephadex LH-20 and MCI-g...
Rosmarinus officinalis extracts had a significant antimicrobial activity against Helicobacter pyori. Total phenolic contents and inhibition zone of rosemary extracts were estimated to be 25.7 mg/g and 14 mm at $200{\mu}g/mL$ of phenolic contents, respectively. The Sephadex LH-20 and MCI-gel CHP-20 column chromatographic separations for the phenolic extracts from R. officinalis leaves led to isolation of five acids, whose structures were determined as protocatechuic acid (A), coumaric acid (B), caffeic acid (C), chlorogenic acid (D), and rosmarinic acid (E), from interpretation of spectroscopic data including nagative fast atom bombardment (FAB)-mass, $^1H$-NMR, $^{13}C$-NMR, and IR. All isolated compounds were tested for antimicrobial activity against H. pyori. The purified single compound showed less antimicrobial activity against H. pylori than the mixed purified compounds, which generate A+B, A+E, C+D, C+E (each $200{\mu}g/disc$) excellent as large clear zone by synergy effect. These results indicate rosemary extracts are preventive agents against H. pyori.
Rosmarinus officinalis extracts had a significant antimicrobial activity against Helicobacter pyori. Total phenolic contents and inhibition zone of rosemary extracts were estimated to be 25.7 mg/g and 14 mm at $200{\mu}g/mL$ of phenolic contents, respectively. The Sephadex LH-20 and MCI-gel CHP-20 column chromatographic separations for the phenolic extracts from R. officinalis leaves led to isolation of five acids, whose structures were determined as protocatechuic acid (A), coumaric acid (B), caffeic acid (C), chlorogenic acid (D), and rosmarinic acid (E), from interpretation of spectroscopic data including nagative fast atom bombardment (FAB)-mass, $^1H$-NMR, $^{13}C$-NMR, and IR. All isolated compounds were tested for antimicrobial activity against H. pyori. The purified single compound showed less antimicrobial activity against H. pylori than the mixed purified compounds, which generate A+B, A+E, C+D, C+E (each $200{\mu}g/disc$) excellent as large clear zone by synergy effect. These results indicate rosemary extracts are preventive agents against H. pyori.
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문제 정의
따라서 본 연구는 허브식물 중 로즈마리에 대한 H. pylori 저해능을 입증하기 위해 에탄올로 추출한 후, H. pylori에 대한 항균활성을 조사하고, 그 물질을 동정하여 고부가가치의 생리 기능을 갖는 천연의 기능성 소재로의 활용하기 위한 자료를 얻고자 하였다.
가설 설정
H. pylori 억제 물질의 구조 동정.
제안 방법
Column에 의해 분리된 용출액을 silical gel TLC plate (5.0×5.0 cm)로 benzen : ethylfomate: formate (1 : 7 : 1, v/v/v)의 용매를 사용하여 전개한 다음, FeCl3/K3Fe(CN)6 발색시약을 분무한 후 70℃ 부근에서 발색 시켜 phenolic compound의 분리 정도를 확인하였다[Nakatani와 Inatani, 1984].
H. pylori 평판 최적배지 plate에서 disc 주위의 clear zone 크기를 측정하여 H. pylori 균에 대한 항균효과를 살펴보았다. Table 2와 Fig.
건조된 로즈마리 잎에 60% 에탄올 용액을 가하여 실온에서 24시간 추출한 후 원심분리(5,000 rpm, 30 min)하여 상징액과 침전물을 얻었고 같은 추출과정을 3회 반복하였다. Rotary evaporator로 농축여과한 농축액은 Sephadex LH-20 (5×45 cm, Sigma Chemical Co.
고체시료 1 mg을 감압상태(10−4~10−6 mmHg)에서 negative ion FAB-mass spectrum (Jeol JMS-PX 300, Tokyo, Japan)을 이용하여 화학적 분석법에 의해 측정하였다.
분석 시료 1 mg을 취해 48시간 감압, 건조하여 완전히 수분을 제거하고 자동원소분석기로 시료에 함유된 C 및 H의 양을 분석하였으며, O는 분자량을 기준으로 계산치에 의한 환산하였다.
IR spectrum은 할로겐화 알칼리 정제법을 이용하였다. 순수 분리된 시료 1 mg을 KBr 100 mg 분말과 잘 섞어 배합하고 압력을 가해 가압 정제를 만들어 측정하였다.
mmHg)에서 negative ion FAB-mass spectrum (Jeol JMS-PX 300, Tokyo, Japan)을 이용하여 화학적 분석법에 의해 측정하였다. 이 때 측정 용매로써는 thioglycerol을 사용하였으며, 측정 조건에서 emitter 전류는 22~28 eV이며, 이온원의 가속가압이 6~7 kV에서 질량분석을 하였다.
대상 데이터
본 실험에 사용한 로즈마리는 경북 구미시에 소재하는 Herb 농원에서 재배되고 있는 로즈마리(R. officinalis)의 잎을 채취하여 50℃ dry oven에서 건조한 후 40 mesh로 분쇄한 후 4℃에서 보관하면서 시료로 사용하였다.
실험에 사용한 균주는 위, 십이지장 궤양 원인균인 H. pylori로서 ATCC 43504를 사용하였다. 균의 배양에는 최적배지(special peptone 0.
이론/모형
1H 및 13C-NMR spectrum은 FT 방법 (Pulse Fourier Transform method)을 이용하여 순수정제물 10 mg을 측정 용매 CDCl3+DMSO-D6-D2O에 5~20% (w/v) 비율로 용해시키고 Tertamethylsilane (CH3)4Si를 기준 물질로 하여 proton magnetic resonance (300 MHz) (Bruker AM-300, Osaka, Japan)로 측정하였다.
IR spectrum은 할로겐화 알칼리 정제법을 이용하였다. 순수 분리된 시료 1 mg을 KBr 100 mg 분말과 잘 섞어 배합하고 압력을 가해 가압 정제를 만들어 측정하였다.
총 페놀 화합물은 Folin-Denis 방법[Moon 등, 2007]으로 측정하였으며, 시료 1 mL에 95% ethanol 1 mL와 증류수 5 mL를 첨가하고 1 N Folin-ciocalteu reagent 0.5 mL를 넣어 잘 섞어주고, 5분간 방치한 후, Na2CO3 1 mL를 가한 후, 흡광도 725 nm에서 1시간 이내에 측정하여 gallic acid를 이용한 표준곡선으로부터 양을 환산하였다.
성능/효과
Table 2와 Fig. 1에서와 같이 100~200 µg/100 µL의 농도에서 각각 11, 12, 14 mm의 clear zone을 형성하여 높은 저해활성을 나타내었으며, 추출물의 농도가 증가할수록 clear zone이 크게 형성되어 H. pylori에 대한 저해 효과가 큰 것을 확인할 수 있었다.
각 fraction의 분획물을 모아 disc method를 이용한 H. pylori의 저해활성을 측정한 결과 fraction A, B, C, D, F에서는 clear zone이 형성되지 않았으며, fraction E에서 10 mm, fraction G에서 14 mm의 clear zone이 관찰되어(Table 3, Fig. 2) Sephadex LH20 dextrin gel과 구조적 이성체 phenol류 분리가 용이한 MCIgel (Sigma Chemical Co.)을 이용하여 normal phase type인 ethanol→H2O와 reverse phase type인 H2O→methanol로 용액의 농도를 증가시키면서 용출한 결과 5 종류(Compound A~E)의 단일 물질로 분리하였고(Fig. 3), simple phenol에 해당하는 compounds 3종류, diphenol compounds 2종류가 분리되었다.
그러나 compound A와 B, compound A와 E, compound C와 D, compound C와 E를 혼합한 경우 13, 13, 14, 13 mm의 clear zone을 관찰할 수 있었다. 본 실험의 결과로 볼 때 정제된 단일 물질에 의해 H. pylori의 저해를 일으키기 보다는 2종류 이상의 다중 물질에 의해서 H. pylori에 대해 더욱 높은 저해가 나타나 compound 물질을 2가지 이상 섞었을 때 H. pylori에 대한 항균 시너지 효과가 있는 것으로 판단되었다. 이러한 결과는 Chun 등[2005]이 Oregano 등의 spice추출물에 존재하는 simple phenol들이 단일 물질에 의한 H.
정제물질에 대한 구조 동정 결과는 Table 5와 같이 purified compound A는 백색분말로서 IR spectrum에서 수산기와 카보닐기가 확인되었고, 1H-NMR spectrum과 13C-NMR의 spectrum은 Table 5와 같이 Irwin과 Pearl[1946]의 보고와 일치하여 compound A는 protocatechuic acid로 동정하였다. Compound B는 melting point가 210~213℃, 분자량이 165이며, IR spectrum은 OH (3250 cm−1), CO(1605 cm−1)가 확인되었으며, 1H-NMR 과 13C-NMR의 spectrum 이 Table 5와 같이 Wheeler와 Covarrubias의 연구[1963]보고와 일치하여 compound B는 coumaric acid로 동정하였다.
정제한 물질 compound A, B, C, D, E 를 사용하여 H. pylori에 대한 항균효과를 알아보기 위해 disc method로 항균효과를 측정한 결과 Table 4에서와 같이 각 compound를 단일물질로 실험하였을 때, clear zone이 매우 약하게 형성되었으며, compound의 함량이 200 µg/disc일 때, compound A와 C, compound A와 D, compound B와 C, compound B와 D, compound B와 E, compound D와 E를 혼합하여 측정하였을 경우에는 H. pylori에 대한 항균력이 미약하게 나타났다.
후속연구
pylori에 대한 저해 효과가 큰 것을 확인할 수 있었다. 이 결과는 rosemary가 향신료로서의 역할 뿐만 아니라 H. pylori의 억제제로서도 산업화에 적용시킬 수 있는 우수한 source로의 활용이 가능할 것이라 판단되었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Helicobacter pylori란?
Helicobacter pylori는 소화성 궤양과 만성 전정부 위염, 위암이나 점막연관 림프조직형 위림프종 등의 원인으로 알려져 있으며[Kuhnau, 1976; Kouchi, 1992], 1994년 세계보건기구(WHO)에서는 H. pylori를 위암의 제 1군 발암 인자로 규정한 이후 H.
로즈마리란?
로즈마리(Rosmarinus officinalis L.)는 꿀풀과(Labiatae)에 속하는 상록성 다년초이며 지중해 지역이 그 원산지로 전체적인 연령층 선호도가 가장 좋은 허브로써 라벤더와 함께 널리 활용되며, 식용은 물론 약용, 미용, 향료 및 관상용 등 모든 부분에서 유용하게 이용되고 있으며, 향기가 오래 남고 머리를 맑게하여 기억을 새롭게 해 준다는 약효가 있어 장례식, 결혼식, 교회 등의 성스러운 행사에 쓰였다[Kelley 등, 1976]. 국내에서는 제주도를 비롯한 남부지역에서 월동이 가능하며 식품의 향신료나 향수의 원료로 산업적인 생산이 되고 있다.
로즈마리의 잎과 줄기 전체에 함유되어 있는 독특한 향기성분의 주성분은 무엇인가?
국내에서는 제주도를 비롯한 남부지역에서 월동이 가능하며 식품의 향신료나 향수의 원료로 산업적인 생산이 되고 있다. 잎과 줄기 전체에 독특한 향기성분이 함유되어 있는데 이는 cineol과 camphor가 주성분이며[Chung 등, 2001]이 성분들은 산화방지제로도 이용되고 있고[Cuvelier와 Richard, 1998], 이탈리아 요리에는 필수인 것으로 우스타 소스의 주성분이다[Dorman와 Deans, 2000].또한, 로즈마리는 강력한 항산화 효과[Fang 등, 2006], 골다공증 예방 효과[Hirayama 등, 1996], 항암효과[Irwin와 Pearl, 1946], anti-acquired immune deficiency syndrome (AIDS) 효과[Kelley 등, 1976] 뿐만 아니라 그람양성균에 대한 항균활성[Kil 등, 2004]을 가지며, 농도 의존적으로 혈중 알콜 농도를 감소시키는 효과 등의 여러 기능이 보고되고 있다[Kim 등, 1998].
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