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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 경북지역 약용식물을 대한 항산화제나 기능성 소재로 이용하기 위하여 약용식물 추출물에 함유된 플라보노이드와 폴리페놀 화합물의 함량을 측정하였으며, 각 추출물의 a-a-Diphenyl-β-picrylhydrazyl(DPPH), ferric reducing antioxidant power(FRAP), superoxide anion radical 저해 등 항산화 활성효과를 측정하였다.
가설 설정
- 3)Micrommole of total Fe2 /mg of plants based on trolox as standard.
제안 방법
- FRAP assay는 Benzie와 Strain법[Benzie과 Strain, 1996]을 96well plate에 맞게 수정하여 실시하였다. 반응액은 acetate buffer (pH 3.
- NO 생성량은 24시간 후에 상층액를 모아 griess 시약으로 10분간 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도로 측정하였다. LPS만 첨가한 군에서 생성된 NO의 양을 100%로 하여 시료가 첨가된 경우 에 측정된 흡광도를 환산하여 표기하였다.
- Nitrite에 대한 nitrate로 환원된 후의 안전한 형태인 griess reagent를 사용하였으며, 6 well plate에 2×106개의 cell을 confluence가 80%일 때, PBS로 2번 washing한 후에 무혈청 배지를 사용하여 12시간 이상 배양시킨 후에 lipopolysaccharide (LPS) 1 µg/mL을 대조군을 뺀 모든 well에 다 넣어서 자극시켰다.
-
XOase에 의해 생성된 superoxide radical 저해활성 측정.
- 각 경북약용 식물 에탄올 추출물과 합성 항산화제인 ascorbic acid의 항산화 활성을 DPPH·의 소거활성을 측정하여 비교하였다(Table 3).
- DPPH 방법은 free radical을 직접적으로 소거하는 것에 의하여 항산화 활성을 평가하는 방법이며[Benzie과 Strain, 1996], FRAP 방법은 colored ferrous tropyridyl triazine complex에 의해 ferric ion이 ferrous로 전환되어지는 과정을 분석함으로서 시료 내의 총 항산화력을 측정하는 방법으로 낮은 pH에서 환원제에 의해 3가 철이 2가 철로 환원되는 원리를 기초로 고안되어진 방법이다[Kim 등, 2009]. 경북약용작물들의 에탄올 추출물에 존재하는 FRAP값은 trolox기준물질로 하여 측정하였다(Table 2). 5가지 약용작물 중 FRAP값은 홍화자 1914.
- 따라서 본 연구에서는 경북지역 약용식물을 대한 항산화제나 기능성 소재로 이용하기 위하여 약용식물 추출물에 함유된 플라보노이드와 폴리페놀 화합물의 함량을 측정하였으며, 각 추출물의 a-a-Diphenyl-β-picrylhydrazyl(DPPH), ferric reducing antioxidant power(FRAP), superoxide anion radical 저해 등 항산화 활성효과를 측정하였다. 또한 더 나아가 항염증 효과의 가능성을 지닌 소재를 발굴하고자 nitric oxide radical(NO) 저해활성 측정하였다.
- 본 실험에서는 경북 약용식물들과 trolox의 ABTS+· 소거활성을 비교 측정하여 나타내었다(Table 4.).
- 폴리페놀계 물질들은 식물체에 특수한 색깔을 부여하고 산화-환원반응에서 기질로 작용하고, 한 분자 내에 2개 이상의 phenolic hydroxyl (OH)기를 가진 방향족 화합물들을 가리키며 플라보노이드와 탄닌이 주성분으로 충치예방, 고혈압 억제, 항에이즈, 항산화, 항암 등의 다양한 생리활성을 가진다[Yoshizawa 등, 1987]. 본 실험에서는 경북약용작물들의 에탄올 추출물에 존재하는 총 폴리페놀의 함량은 tannic acid를 기준물질로, 총 플라보노이드 함량은 quercetin을 기준물질로 하여 측정하였다(Table 2). 그 결과, 5가지 경북약용작물의 총 폴리페놀 함량은 홍화자 43.
- 시료의 free radical 소거활성은 stable radical인 DPPH에 대한 환원력을 측정한 것으로 99% 메탄올에 각 시료를 녹여 농도별로 희석한 희석액 800 µL와 메탄올에 녹인 0.15 mM DPPH 용액 200 µL를 가하여 실온에 30분 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 즉, 각 추출물 1 mg을 증류수 1 mL에 녹이고 10배 희석한 희석액 2 mL에 2배 희석한 Folin 시약 2 mL을 첨가하고 잘 혼합한 후 3분간 방치한 후 10% Na2CO3 2 mL을 넣고 1시간 반응 시킨 후 UV/Visible spectrophotometer를 사용하여 700 nm에서 흡광도를 측 정하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다. 이 때 tannic acid를 이용한 표준곡선으로부터 총 폴리페놀 함량을 구하였다.
- 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법[Folin과 Denis, 1912]을 응용하여 측정하였다. 즉, 각 추출물 1 mg을 증류수 1 mL에 녹이고 10배 희석한 희석액 2 mL에 2배 희석한 Folin 시약 2 mL을 첨가하고 잘 혼합한 후 3분간 방치한 후 10% Na2CO3 2 mL을 넣고 1시간 반응 시킨 후 UV/Visible spectrophotometer를 사용하여 700 nm에서 흡광도를 측 정하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다. 이 때 tannic acid를 이용한 표준곡선으로부터 총 폴리페놀 함량을 구하였다.
- 이들 경북약용작물은 실온에서 70% 에탄올로 3회 반복 추출하였다. 추출액은 여과하여 rotary vacuum evaporator로 감압농축한 후 동결 건조하여 항산화 활성 검정에 사용하였다.
- 희석된 용액 990 µL에 sample 10 µL를 가하여 정확히 1분 동안 방치한 후 흡광도를 측정하였다.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용한 경북 지역에서 재배된 약용작 물 5종 홍화자(Carthamus tinctorius seed, seed), 향부자 (Cyperus rotundus, rhizome), 형개(Schizonepeta tenuifolia, leaf), 위유(Polygonatum odoratum var. pluriflorum, rhizome), 작약(Paeonia lactiflora, leaf)로 홍화자는 경북영천, 향부자는 경북고령, 형개는 경북청송, 위유와 작약은 경북의성에서 재배된 것을 사용하였다(Table 1). 이들 경북약용작물은 실온에서 70% 에탄올로 3회 반복 추출하였다.
- 항산화능과 항염증 측정 실험에 사용된 시약인 folin reagent, aluminum nitrate, postassium acetate, DPPH, 6-tri(2-pyridyl)-1,3,5-triazine (TPTZ), FeCl3 · 6H2O, 2,2- azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS), potassium persulfate, xanthine oxidase, sodium nitrite 및 griess reagent, tannic acid 등은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)에서 구입하여 사용하였으며, 세포 생존율 측정에 사용된 macrophage 세포인 Raw 264.7을 Korean Cell Line Bank (KCLB)에서 구입하여 사용하였다.
이론/모형
- ABTS radical을 이용한 항산화력 측정은 ABTS+· cation decol orization assay방법[Re 등, 1999]에 의해 시행하였다.
- XOase에 의해 생성된 superoxide radical 저해활성은 NBT (nitro-blue tetrazolium)환원법[Parejo 등, 2002]을 사용하여 검정하였다. 즉, 0.
- 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법[Folin과 Denis, 1912]을 응용하여 측정하였다. 즉, 각 추출물 1 mg을 증류수 1 mL에 녹이고 10배 희석한 희석액 2 mL에 2배 희석한 Folin 시약 2 mL을 첨가하고 잘 혼합한 후 3분간 방치한 후 10% Na2CO3 2 mL을 넣고 1시간 반응 시킨 후 UV/Visible spectrophotometer를 사용하여 700 nm에서 흡광도를 측 정하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다.
- 총 플라보노이드 함량은 Nieva Moreno 등[Nivea 등, 2000]의 방법에 의해 측정하였다. 각 시 료 100 µL를 80% ethanol 900 µL에 희석한 후 100 µL를 취하 여 10% aluminum nitrate와 1 µM postassium acetate를 함유하는 80% ethanol 4.
성능/효과
- 02 µg/mg으로 홍화자, 형개 추출물에서 높은 플라보노이드 함량을 나타냈다. 5가지 경북약용작물 중 홍화자, 형개 추출물에서 높은 폴리페놀과 플라보노이드를 함유하는 것으로 나타났다. 국내산 다른 지역의 홍화자 폴리페놀 함량을 보면 12.
- 5가지 경북약용작물의 IC50값은 작약 1979.17±3.60 µg/mL으로 작약 추출물에서 가장 높은 소거활성 을 나타냈다.
- 5가지 약용식물의 RC50 (concentration required for 50% reduction) 값은 작약 28.42± 1.24 µg/mL으로 가장 높은 소거활성을 나타냈다.
- 5가지 약용식물의 RC50값은 홍화자 626.63±1.57 µg/mL, 작약 631.22±1.17 µg/mL으로 홍화자, 작약 추출물에서 높은 소거활성을 나타냈다.
- 5가지 약용작물 중 FRAP값은 홍화자 1914.95±2.11 µM Fe2 /mg로 가장 높은 FRAP활성을 나타냈으며, 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량과 비교했을 때 5가지 약용식물 중 홍화자 추출물에서 모두 높은 함량으로 동일한 결과를 확인할 수 있었다.
- 그 결과, 5가지 경북약용작물의 총 폴리페놀 함량은 홍화자 43.92± 4.81 µg/mg, 형개 45.97±2.29 µg/mg, 작약 47.51±1.38 µg/mg 으로 홍화자, 형개, 작약 추출물에서 높은 폴리페놀 함량을 보였다.
- 그러나 국내산 약용식물에서 작약의 DPPH· RC50값은 18.8 µg/mL로 본 연구에 사용된 작약 추출물이 낮은 소거활성효과를 가지는 것 으로 확인되었다.
- 따라서 경북지역에서 재배된 홍화자가 높은 DPPH· 소거활성을 가지므로 항산화 활성이 뛰어난 것으로 나타났다.
- 또한 XOase IC50값으로 홍화자 2685.18±3.17 µg/mL, 형개 2183.51 ±7.92 µg/mL로 우수하지 않지만 저해활성을 확인하였다.
- 1 µg/mg으로 보고되었다[Miliauskas 등, 2004]. 이들 결과들과 비교해 볼 때 경북 약용작물 특히 홍화자, 형개 등은 상당히 높은 폴리페놀과 플라보노이드를 함유하고 있는 것으로 나타났다.
- 이에 따라 5가지 경북 약용식물 중 홍화자, 작약 추출물이 DPPH·와 ABTS+ · 소거활성이 높게 나타나 그 경향은 매우 유사함을 알 수 있었다.
- 총 플라보노이드 함량을 홍화자 16.49±2.55 µg/mg, 형개 17.33±2.02 µg/mg으로 홍화자, 형개 추출물에서 높은 플라보노이드 함량을 나타냈다.
- 최근 염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 NO 생성에 대한 5가지 경북 약용 작물을 100 µg/mL농도로 세포에 처리하여 생성되는 NO량을 측정한 결 과 홍화자, 향부자, 형개, 위유, 작약 추출물 중 홍화자 추출물 이 6.13±0.72 µM로 가장 낮은 NO 생성능을 나타냈다(Fig. 1).
후속연구
- 우리나라의 산야에는 이용 가능한 약용식물이 약 900여 종이 분포하는 것으로 알려져 있으며, 이중 약 50여 종이 농가에서 재배 생산되고 있다. 그 중 경북지역 약용식물인 홍화자, 향부자, 형개, 위유, 작약의 5가지 한방자원이 있으며, 이들 약용식물에서 연구의 관심이 되고 있는 기능성 성분으로는 건물기준 함량의 15-45%를 점유하는 것으로 알려진 식이섬유[Lee, 1997]와 당과 결합한 배당체의 형태로 여러 약용식물에 존재하는 flavonoid를 비롯한 polyphenol[Singleton, 1981]류 들이 있으며, 항산화의 다양한 기능성을 발견할 수 있을 것으로 기대된다.
- 이는 홍화자 추출물을 이용한 항염증 효과[Jun 등, 2011]의 연구가 뒷받침 되고있다. 그러나 홍화자 원산지가 중국지역이므로 추후 더 나아가 높은 항산화활성을 가진 경북 약용작물인 홍화자를 이용하여 심도 깊은 항염증 효과 연구가 더 실행되어야 한다고 사료된다.
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