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문제 정의
- 본 논문에서는 홍화자 분획물이 LPS에 의해 활성화된 Raw264.7 세포주에서 염증 관련 매개 물질인 NO, PGE2의 생성과 관련 단백질 및 mRNA의 발현 양상 및 염증성 cytokine을 측정함으로서 항염증 작용에 미치는 영향을 조사하였다.
제안 방법
- 다시 tris-buffered saline and tween 20 (TBST)로 세 번 세척한 뒤 secondary antibody를 상온에서 1시간 반응 시킨 뒤 TBST로 세 번 세척하고 ECL kit(Amersham-Pharmacia)와 반응시켜 X-ray film에 노출 시켰다. LAS4000 image analyzer (Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 밴드 현상 및 정량화 하였다.
- NO의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 griess reagent를 이용하여 측정하였다. Raw 264.
- 이 중 PGE2는 염증반응, 면역반응, 그리고 angiogenesis를 촉진하는 등 암 발생에도 깊이 관여하고 있는 것으로 알려져 있다[5, 14]. Raw 264.7 세포에서 염증성 PGE2 억제효과를 ELISA kit로 측정하였다. 홍화자 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물 분획물 50 μg/ml 농도를 처리하여 PGE2의 발현을 측정하였다.
- Total RNA 2 μg과 PCR primer oligonucleotide(target 유전자와 내부표준 β-actin 유전자)를 RP-PCR mixer와 혼합하고 RT-PCR을 실시하였다.
- Well당 20 μl의 MTT용액을 첨가하여 37℃, 5% CO2 incubator (Hanbaek, Gyeonggi-do, Korea)에서 4시간 동안 반응시킨 후, microplate reader(Tecan, Mönnedorf, Switzerland)를 이용하여 540 nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포생존율울 백분율로 표시하였다.
- 단백질 20 μg을 10% polyacrylamide를 함유한 SDS-PAGE로 분리하고 PVDF membrane으로 electroblot 120 V에서 1시간을 실시하였다.
- 홍화자 분획물의 피부 염증 효과를 알아보기 위하여 염증과 관계되어진 iNOS, COX-2 단백질의 양을 측정하였다. 대식세포주(Raw264.7)를 이용하여 culture dish에 배양한 뒤 sample 처리를 한 다음 24시간 후에 PBS로 세척한 후 원심분리 하여 세포를 수집하고, RIPA buffer를 사용하여 cell lysate를 제조하였다. 세포 lysate에 함유된 단백질의 양은 Bradford 법으로 측정하였다[22].
- 홍화자 분획물의 효과를 알아보기 위하여 RT-PCR 방법을 통해 iNOS, COX-2의 mRNA 발현을 측정하였다. 대식세포주를 이용하여 culture dish에 배양한 뒤 sample 처리를 한 다음 24 hr 후에 PBS로 세척한 후, Total RNA는 DEPC처리된 saline으로 3번 세척하고 세포를 포집한 다음 trizol을 이용하여 분리하였다. Total RNA 2 μg과 PCR primer oligonucleotide(target 유전자와 내부표준 β-actin 유전자)를 RP-PCR mixer와 혼합하고 RT-PCR을 실시하였다.
- 세포에 1 μg/ml의 LPS를 처리 한 뒤 1시간 후에 0, 1, 10, 100 μg/ml의 홍화자 분획물을 처리하여 24시간 배양하였다. 배양배지를 취하여 PGE2를 측정하였다.
- 세포배양액 내의 PGE2, TNF-α, IL-1β, IL-6 생성량은 ELISA kit를 이용하여 측정하였다.
- 세포에 1 μg/ml의 LPS를 처리 한 뒤 1시간 후에 0, 1, 10, 100 μg/ml의 홍화자 분획물을 처리하여 24시간 배양하였다.
- 세포에 1 μg/ml의 LPS를 처리하고 1시간 뒤에 5, 10, 25, 50 μg/ml의 홍화자 분획물을 처리하여 24시간 배양하였다.
- 2)로 여과하였고, 얻어진 여액은 감압농축하여 아세톤 추출물(615 g)을 얻었다. 이 70% 에탄올 추출물을 증류수에 현탁 시킨 후 용매 극성 차를 이용해 서로 다른 용매를 첨가하여 단계적으로 분획하였다. 홍화자 추출물과 헥산을 1:1 비율로 분획 깔대기에 넣고 헥산으로 분획하였고, 헥산층을 다시 감압 농축하여 헥산 분획물 15.
- RT의 조건은 42℃에서 1시간 방치하여 cDNA를 제조하고 94℃에서 5분간 방치하여 reverse transcriptase를 불활성화 시켰다. 이어 PCR 조건은 94℃에서 30초(denaturation), 50℃에서 30초(annealing), 72℃에서 90초(extension)의 반응을 25~35회 반복하는 것을 기본으로 target cDNA 종류에 따라 최적의 조건으로 조절하였다. 증폭된 cDNA는 1.
- 이에 ELISA kit, western blot, RT-PCR의 실험에서 50 μg/ml의 농도를 벗어나지 않는 범위인 5, 10, 25, 50 μg/ml의 농도를 사용하여 실험을 진행하였다.
- 이어 PCR 조건은 94℃에서 30초(denaturation), 50℃에서 30초(annealing), 72℃에서 90초(extension)의 반응을 25~35회 반복하는 것을 기본으로 target cDNA 종류에 따라 최적의 조건으로 조절하였다. 증폭된 cDNA는 1.2% agarose gel을 사용한 전기영동으로 분리하고 ethidium bromide로 염색한 다음 LAS4000 image analyzer (Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)로 정량하였다.
- 홍화자 분획물의 피부 염증 효과를 알아보기 위하여 염증과 관계되어진 iNOS, COX-2 단백질의 양을 측정하였다. 대식세포주(Raw264.
- 홍화자 분획물의 효과를 알아보기 위하여 RT-PCR 방법을 통해 iNOS, COX-2의 mRNA 발현을 측정하였다. 대식세포주를 이용하여 culture dish에 배양한 뒤 sample 처리를 한 다음 24 hr 후에 PBS로 세척한 후, Total RNA는 DEPC처리된 saline으로 3번 세척하고 세포를 포집한 다음 trizol을 이용하여 분리하였다.
- 홍화자 분획물이 Raw 264.7 세포에서 LPS에 의해서 생성된 pro-inflammatory cytokine의 형성을 억제하는지 알아보기 위하여 TNF-α, IL-1β와 IL-6의 생성을 측정하였다.
- 홍화자 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물 분획물 50 μg/ml 농도를 처리하여 PGE2의 발현을 측정하였다.
- 홍화자 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물 분획물 50 μg/ml농도를 처리하여 TNF-α, IL-1β와 IL-6의 발현을 측정하였다.
대상 데이터
- 마우스의 대식세포주인 Raw 264.7 cell은 한국세포주은행(KCLB)에서 분양 받았으며, 세포배양을 위해 10% FBS과 1% penicillin-streptomycin을 포함하는 DMEM 배지를 사용하였다. 세포는 37℃, 5% CO2조건에서 배양하였다.
- 본 실험에 사용한 홍화자(Carthamus tinctorious seed)는 경북 영천에서 2009년 11월경 건조된 씨를 구입하여 실험재료로 사용하였다. 홍화자 5 kg을 헥산을 이용하여 먼저 탈지한 뒤, 70% 에탄올을 가하여 상온에서 1주일간 3회 추출한 다음 filter paper (Whatman No.
- 세포 배양액인 dulbeco's modifide eagle medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), streptomycin penicillin 등의 세포배양용 시약들은 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)사에서 구입하였다.
- 실험에 사용된 1차 항체인 iNOS BD bioscience (Sanjose, CA, USA) COX-2 cayman (Ann arbor, MI, USA), β-Actin과 2차 항체인 anti-rabbit Ig-G horseradish peroxidase (HRP)-conjugated antibody (Santa cruz, CA, USA)에서 구입하였다.
- 세포 배양액인 dulbeco's modifide eagle medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), streptomycin penicillin 등의 세포배양용 시약들은 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)사에서 구입하였다. 실험에 사용된 시약 중 sodium dodecyl sulfate (SDS), acrylamide, bis-acrylamide는 Bio-rad사(Hercules, CA, USA)에서 구입하였고, NP-40, protease inhibitor, RIPA buffer, griess reagent 등은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 1차 항체인 iNOS BD bioscience (Sanjose, CA, USA) COX-2 cayman (Ann arbor, MI, USA), β-Actin과 2차 항체인 anti-rabbit Ig-G horseradish peroxidase (HRP)-conjugated antibody (Santa cruz, CA, USA)에서 구입하였다.
데이터처리
- One-way ANOVA was used for comparisons of multiple group means followed by t-test (significant as compared to control. *p<0.05, **p<0.01).
이론/모형
- 7)를 이용하여 culture dish에 배양한 뒤 sample 처리를 한 다음 24시간 후에 PBS로 세척한 후 원심분리 하여 세포를 수집하고, RIPA buffer를 사용하여 cell lysate를 제조하였다. 세포 lysate에 함유된 단백질의 양은 Bradford 법으로 측정하였다[22]. 단백질 20 μg을 10% polyacrylamide를 함유한 SDS-PAGE로 분리하고 PVDF membrane으로 electroblot 120 V에서 1시간을 실시하였다.
- 홍화자 분획물의 세포에 대한 독성 측정은 MTT 방법으로 분석하였다[10]. Raw 264.
성능/효과
- PGE2의 경우 모두 홍화자 에틸아세테이트 분획물에서 가장 좋은 효과를 나타내었으며, 홍화자 에틸아세테이트 분획물을 각각 5, 10, 25, 50 μg/ml의 농도로 측정한 결과 농도 의존적으로 발현양이 줄어드는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 3).
- TNFα, IL-1β와 IL-6의 경우 모두 홍화자 에틸아세테이트 분획물에서 가장 좋은 효과를 나타내었으며, 홍화자 에틸아세테이트 분획물을 각각 5, 10, 25, 50 μg/ml의 농도로 측정한 결과 농도의존적으로 발현양이 줄어드는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 4).
- 따라서 본 연구에 사용된 홍화자 분획물은 5, 10, 25, 50 μg/ml의 농도에서는 세포독성이 낮음을 확인하였으며, 에틸아세테이트층의 경우 가장 높은 세포 생존율을 나타내는 것을 확인하였다.
- 이상의 결과들은 Lee t등[12]의 양마에서 분리한 kaempferol 정제물이 100 μM의 농도에서 PGE2를 40% 가까이 저해 하였으며, IL-6는 70% 가까이 저해하는 것을 확인한 논문과 비교 시 홍화자 추출물은 kampferol 정제물과 비슷한 효능을 가지는 것을 확인 할 수 있었다.
- 3). 이와 같은 결과로 홍화자 에틸아세테이트 분획물은 염증성 질환의 치료에 유의할 것으로 사료되어 진다.
- 2에 나타내었다. 특히 홍화자 에틸아세테이트 분획물이 LPS를 처리한 대조군에 비해 NO생성량이 40% 를 나타내었기 때문에 홍화자 추출물 및 분획물 중에서 가장 우수한 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
- 홍화자 부탄올, 물 분획물은 5, 10, 25, 50 μg/ml의 농도에서 높은 생존율을 나타내었으며, 헥산 및 에틸아세테이트 분획물의 경우 대조군에 비해 높은 생존율은 나타내지 않았지만 세포 독성을 나타내지는 않았다.
후속연구
- 4). 이와 같은 결과로 홍화자 에틸아세테이트 분획물이 염증성 질환의 치료에 유의할 것으로 사료되어 진다.
- 이상의 결과들은 Lee t등[12]의 양마에서 분리한 kaempferol 정제물이 100 μM의 농도에서 PGE2를 40% 가까이 저해 하였으며, IL-6는 70% 가까이 저해하는 것을 확인한 논문과 비교 시 홍화자 추출물은 kampferol 정제물과 비슷한 효능을 가지는 것을 확인 할 수 있었다. 추후 홍화자 정제물의 염증 활성을 검토하여 홍화자 추출물이 염증 예방 물질로 사용할 수 있는 가능성을 높이기 위한 정제물의 염증성 작용기전에 대한 자세한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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