형광 검출기를 기반으로 한 변성 고성능 액체 크로마토그래피(DHPLC)분석법은 핵산검출에 유용하게 사용되고 있으며 또한 등온증폭 반응법은 병원성 미생물의 효과적인 검출방법으로 알려져 있다. 이 연구에서는 HBV의 조기 분석 방법으로써 사용되는 등온증폭반응법(LAMP)과 변성고성능 액체 크로마토그래피(DHPLC)의 검출한계와 특이성, 그리고 민감도를 평가하였다. 등온증폭 반응법의 검출 시간이 가장 빠른 장점을 보였으나, 변성 고성능 액체 크로마토그래피 분석법이 등온증폭반응법과 real-time PCR분석법과 비교한 결과, 10배 이상의 높은 민감도를 확인 할 수 있었다. 본 결과로서 B형 간염 바이러스의 진단을 위하여, 빠른 검출법으로써 등온증폭 반응법이 유용하게 쓰일 수 있을 것이며 변성 고성능 액체 크로마토그래피 분석법은 좀 더 낮은 병원균의 감염도 검출할 수 있어, 임상에서 유용하게 사용할 수 있을 것이다.
형광 검출기를 기반으로 한 변성 고성능 액체 크로마토그래피(DHPLC)분석법은 핵산검출에 유용하게 사용되고 있으며 또한 등온증폭 반응법은 병원성 미생물의 효과적인 검출방법으로 알려져 있다. 이 연구에서는 HBV의 조기 분석 방법으로써 사용되는 등온증폭반응법(LAMP)과 변성고성능 액체 크로마토그래피(DHPLC)의 검출한계와 특이성, 그리고 민감도를 평가하였다. 등온증폭 반응법의 검출 시간이 가장 빠른 장점을 보였으나, 변성 고성능 액체 크로마토그래피 분석법이 등온증폭반응법과 real-time PCR분석법과 비교한 결과, 10배 이상의 높은 민감도를 확인 할 수 있었다. 본 결과로서 B형 간염 바이러스의 진단을 위하여, 빠른 검출법으로써 등온증폭 반응법이 유용하게 쓰일 수 있을 것이며 변성 고성능 액체 크로마토그래피 분석법은 좀 더 낮은 병원균의 감염도 검출할 수 있어, 임상에서 유용하게 사용할 수 있을 것이다.
The denaturing high performance liquid chromatography(DHPLC) with fluorescence detector assay is very useful tool for detecting nucleic acids. Furthermore, loop-mediated isothermal amplification(LAMP) constitutes a potentially valuable tool for rapid diagnosis of pathogenic microorganisms. In this s...
The denaturing high performance liquid chromatography(DHPLC) with fluorescence detector assay is very useful tool for detecting nucleic acids. Furthermore, loop-mediated isothermal amplification(LAMP) constitutes a potentially valuable tool for rapid diagnosis of pathogenic microorganisms. In this study, we evaluated the specificity, detection limit, and sensitivity of a LAMP method and DHPLC method for rapid detection of the hepatitis b virus(HBV). As a result, the LAMP assay reported here has the advantage of rapid detection whereas, DHPLC assay has more sensitivity than other assays. These findings suggest that LAMP and DHPLC assay may be good tool for rapid diagnosis of clinical HBV infection.
The denaturing high performance liquid chromatography(DHPLC) with fluorescence detector assay is very useful tool for detecting nucleic acids. Furthermore, loop-mediated isothermal amplification(LAMP) constitutes a potentially valuable tool for rapid diagnosis of pathogenic microorganisms. In this study, we evaluated the specificity, detection limit, and sensitivity of a LAMP method and DHPLC method for rapid detection of the hepatitis b virus(HBV). As a result, the LAMP assay reported here has the advantage of rapid detection whereas, DHPLC assay has more sensitivity than other assays. These findings suggest that LAMP and DHPLC assay may be good tool for rapid diagnosis of clinical HBV infection.
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문제 정의
상기 검출 방법들이 해외에서는 임상 적용성 및 응용방법에 대한 연구가 활발이 진행되고 있지만, 현재 국내에서는 이에 대한 연구가 극히 드문 현실이다. 따라서 상기 검출 방법들이 B형 간염 바이러스의 검출에 유용하게 적용 할 수 있음을 보이고자 한다.
본 연구에서는, 실시간 중합효소연쇄반응법과 DHPLC 및 등온증폭반응법의 민감도와 분석 소요 시간을 확인 하기 위하여 105 copy/ml 농도의 B형 간염 바이러스 DNA를 10배위 정량 희석하여 실시간 중합효소연쇄반응법과 DHPLC분석법 및 등온증폭반응법을 비교 하였다.
제안 방법
Agarose gel 전기영동에 의한 증폭산물의 확인: 2%(w/v) agarose gel을 이용하여 Mupid-α(Advance, Japan) 전기영동장치로 multiplex-PCR 산물을 분석하였다. Agarose 2g을 삼각플라스크(250 mL)에 넣고, 0.
핵산 검출에 특화된 컬럼을 사용하여, 핵산의 존재 유무 및 DNA 염기의 치환, 결실 또는 삽입의 유무를 분석하는 목적으로 사용되고 있다. 기존 DHPLC의 핵산 검출 시에는 주로 UV 검출기를 사용하여 260 nm에서 검출하였는데, 본 논문에서는 보다 높은 민감도의 결과를 얻기 위하여 형광 검출기를 사용하여 연구를 시행하였다.
따라서 본 논문에서는 DHPLC를 이용한 검출법과 등온증폭반응법의 임상 적용 가능성을 판단 하기 위하여, 기존 임상에서 적용 하고 있는 B형 간염 바이러스의 검출방법 중 real-time PCR과 DHPLC 그리고 등온증폭반응법을 비교 분석 하였다.
대상 데이터
본 실험에서는 표준 B형 간염 바이러스로 ATCC 45020D를 사용 하였다. 임상 시료는 단국대학교 병원에서 확인된 B형 간염 환자 33명에게서 수집하여 본 실험에 사용하
시약: B형 간염 환자의 혈청에서 B형 간염 바이러스 DNA 추출에는 DNA PrimePrepTM-Genomic DNA Isolation Kit(Genet Bio, Korea)를 사용하였고, 전기영동의 agarose는 QA-AgaroseTM(Q-bio gene, USA)을 이용하였다. DHPLC의 이동상으로 0.
본 실험에서는 표준 B형 간염 바이러스로 ATCC 45020D를 사용 하였다. 임상 시료는 단국대학교 병원에서 확인된 B형 간염 환자 33명에게서 수집하여 본 실험에 사용하
였다.
이론/모형
DNA 염기서열분석법에 의한 유전자 판별: HBV B3와 HBV F3 primer set만을 이용해 얻은 DNA증폭산물을 염기서열분석법(ABI 3730XL DNA analyzer, Applied Biosystem, USA)으로 분석하여 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에서 비교 후 B형 간염 바이러스의 precore gene 만을 증폭 하였음을 확인하였다.
기기: DHPLC분석 전 PCR 반응은 GeneAmp PCR System 2700(Applied Biosystems, USA)을사용하였으며, real-time PCR 반응은 Chromo4TM(Bio-rad, USA)를 사용하였다. 등온증폭반응은 T-garadient(Biometra®, Germany)를 사용하였으며, 등온증폭반응 산물 확인은 Mupid-α(Advance, Japan)을 사용하였다.
성능/효과
DHPLC법과 등온증폭반응법의 결과(Fig. 2, 3)를 보았을 때, 임상에서 B형 간염 바이러스의 감염을 판단하는 기준치인 105 copy/ml을 충분히 검출 할 수 있는 검사 방법임을 알 수 있다. 따라서, 위 두 검출 방법이 임상에서 B형 간염바이러스의 검출에 유용하게 사용될 수 있음을 밝혔다.
현 시점에서는 B형 간염 바이러스의 감염 여부의 판별도 중요하지만, 항바이러스제 내성 B형 간염 바이러스의 검출에 관한 연구가 진행 되고 있다. B형 간염의 경우 오랜 기간 약물 치료를 받는 동안 환자의 체내에서 항바이러스제 내성 B형 간염 바이러스의 생성됨이 밝혀졌다. 따라서 차후 연구에서는 DHPLC를 이용한 항바이러스제 내성 B형 간염 바이러스의 검출법에 관한 연구를 진행 할 예정이다.
등온증폭반응법은 한 온도 조건 하에서 증폭반응이 일어나기 때문에 검출 시간이 짧은 장점(30~60분, 최대 90분)이 있으며, 특별한 장비 없이 일정 온도를 유지 할 수 있는 환경에서는 쉽게 적용이 가능하다.
2, 3)를 보았을 때, 임상에서 B형 간염 바이러스의 감염을 판단하는 기준치인 105 copy/ml을 충분히 검출 할 수 있는 검사 방법임을 알 수 있다. 따라서, 위 두 검출 방법이 임상에서 B형 간염바이러스의 검출에 유용하게 사용될 수 있음을 밝혔다.
본 연구의 결과, UV 검출기를 사용한 DHPLC 분석법과 형광 검출기를 사용한 DHPLC의 결과 사이에는 두드러진 민감도의 차이를 보이지 않았다. 또한, 등온증폭반응법의 검출 결과는 DHPLC법과 동일한 민감도를 보였다. 하지만 위 두 가지 검출 방법은 기존 임상에서 사용하고 있는 real-time PCR 방법보다 10배 정도 높은 민감도를 보였다.
본 연구의 결과, UV 검출기를 사용한 DHPLC 분석법과 형광 검출기를 사용한 DHPLC의 결과 사이에는 두드러진 민감도의 차이를 보이지 않았다. 또한, 등온증폭반응법의 검출 결과는 DHPLC법과 동일한 민감도를 보였다.
또한, 등온증폭반응법의 검출 결과는 DHPLC법과 동일한 민감도를 보였다. 하지만 위 두 가지 검출 방법은 기존 임상에서 사용하고 있는 real-time PCR 방법보다 10배 정도 높은 민감도를 보였다. DHPLC법과 등온증폭반응법의 결과(Fig.
DHPLC기기는 기존의 HPLC기기에 기초하여 핵산 분석에 특화된 분석 기기이다. 핵산 검출에 특화된 컬럼을 사용하여, 핵산의 존재 유무 및 DNA 염기의 치환, 결실 또는 삽입의 유무를 분석하는 목적으로 사용되고 있다. 기존 DHPLC의 핵산 검출 시에는 주로 UV 검출기를 사용하여 260 nm에서 검출하였는데, 본 논문에서는 보다 높은 민감도의 결과를 얻기 위하여 형광 검출기를 사용하여 연구를 시행하였다.
후속연구
B형 간염의 경우 오랜 기간 약물 치료를 받는 동안 환자의 체내에서 항바이러스제 내성 B형 간염 바이러스의 생성됨이 밝혀졌다. 따라서 차후 연구에서는 DHPLC를 이용한 항바이러스제 내성 B형 간염 바이러스의 검출법에 관한 연구를 진행 할 예정이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
real-time PCR이 nested PCR보다 널리 사용되는 이유는?
현재 임상이나 병원에서 시행 하고 있는 분자 진단 방법으로는 실시간 중합효소연쇄반응법(real-time PCR) 이나 nested PCR을 사용하고 있다. 위 두 분자 진단 방법 중에 real-time PCR이 보다 널리 사용 되고 있으며, 그 이유는 nested PCR 방법의 경우 민감도는 높으나 진단 시간이 실시간 중합효소연쇄반응법에 비하여 오래 걸린다는 단점 때문이다.
등온증폭방법의 강점은 무엇인가?
등온증폭방법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)은 2000년 Notomi에 의해알려진 증폭 방법으로 기존의 PCR법과 유사하지만 PCR이나 real-time PCR 반응 시에 DNA 변성(denaturation), 프라이머의 접합(annealing), 중합효소의 신장(extension)에 필요했던 온도 변화가 필요 없이 60 ℃의 한 온도에서 증폭반응이 가능한 검출 방법으로써 기존 검출 방법보다 검출 시간을 획기적으로 단축시킬 수 있는 검출 방법이다. 또한, 한 온도에서 반응이 진행되기 때문에 일정 온도의 유지가 가능한 오븐, 항온 수조등의 저가의 장비에서도 증폭이 가능하며, 장소에 구애받지 않게 됨에 따라 임상진단 연구소와 현장 및 기타 어느 장소에서도 B형 간염 바이러스에 대한 진단이 가능한 강점을 가지고 있다.
변성 고성능 액체크로마토그래피는 무엇인가?
변성 고성능 액체크로마토그래피(Denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC)는 DNA나 RNA와 같은 핵산 분석에 특화된 액체크로마토그래피 기기장치로써, 핵산의 정량분석이나 DNA 상의 염기의 결실, 삽입 또는 치환에 의한 돌연변이를 검출하는 목적으로 사용되고 있다. 이 방법은 PCR 증폭산물의 크기가 200-1000bp에서 95~100%에 가까운 정확도를 나타낸다.
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