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문제 정의
- 최근에 PCR을 이용하여 PPV를 검출하려는 연구가 활발히 진행되어 왔는데, 주로 conventional PCR 또는 nested PCR 방법을 이용하여 돼지에서 PPV 감염여부를 빠른 시간에 진단하고자 하는 연구였다(3, 14, 20, 21). 본 연구에서는 PPV의 정량적 분석 방법으로 real-time PCR을 활용하였으며, 확립된 PPV 정량법을 혈장분획제제 제조공정에서 크로마토그래피 세척검증에 최초로 적용하여 혈장분획제제 안전성 평가기술의 확립에 공헌하였다. 확립된 실험법의 민감도는 1.
- 화학적 처리에 큰 저항성을 나타내는 것으로 보고되고 있기 때문에 일반적으로 바이러스를 제거하거나 불활화하는 제조공정의 견고성(robustness)을 평가할 때 사용되는 바이러스이다(4, 15,17). 본 연구에서는 크로마토그래피 세척검증 시스템을 구축을 위해 모델바이러스로 PPV를 선정하여 Real-time PCR을 활용한 정량분석법을 확립하였다.
- 하지만 크로 마토그래피 세척 검증의 경우에는 크로마토그래피 resin에 바이러스가 흡착을 하기 때문에 세포배양법을 사용하여 크로마토그 래피 resin에 존재하는 바이러스의 titei를 정량할 수 없다(31). 본 연구에서는 혈장분획 제제 제조공정 에 사용되는 크로마토그래피의 세척공정에서 감염성 위해인자의 제거 및 불활화 공정의 검토 강화로 혈장분획제제의 안전성을 확보하기 위해 크로마토그래피 세척검증 시스템을 구축하였다. 이를 위해 물리·화학적 처리에 큰 저항성을 갖는 B19의 모델 바이러스인 Porcine parvovirus (PPV)를 대상으로 real-time PCR< 이용한 크로마토그래피 세척검증 시스템을 구축하고, 크로마토그래피 공정에 적용한 후 검증 시스템의 적합성을 평가하였다.
- 혈장분획제제의 안전성 보증을 위해 크로마토 그래피의 세척 공정에서 감염성 위해인자의 제거 및 불활화 공 정의 검증이 요구되고 있지만, 지금까지 확립된 검증법이 보고된 바 없다. 본 연구에서는 혈장분획제제 제조공정에 사용되는 크로 마토그래피의 세척공정에서 바이러스의 제거 및 불활화 공정의 검토 강화로 혈장분획제제의 안전성을 확보하기 위한 크로마토 그래피 세척검증 시스템을 구축하고자 하였다.
제안 방법
- PPV DNA 정량을 위한 real-time PCR 방법의 신뢰성(reliability)!- 보증하기 위해 확립된 실험법의 민감도(sensitivity), 재현성(reproducibility), 특이성(specificity) 등을 검증하였다. 민감도를 측정하기 위해 Titer가 1.
- 핵산증폭은 pre-incubatione 95℃에서 5분, denaturation은 95℃에서 30초, annealinge 52℃, 54℃, 56℃, 또는 58℃에서 30초, extention은 72℃에서 1분으로 하여 40 cycle을 수행하였다. 40 cycle PCR 후 72℃에서 5분 반응시킨 후 2% agarose gel 전기영동을 통해 PCR 반응물을 확인하였다.
- base에 보고된 PPV complete genome(NC 001718)을 기초로 Primer3 Software를 이용하여 디자인하였다 (Table 1). Corbett Research사(Australia)의 PALM-CYCLER를 이용한 일반 PCR 반응을 통해 디자인한 primer 5쌍들의 특이성을 확인하고, annealing temperature와 MgCI2 농도를 변화시켜 PCR 조건을 최적화하였다. 또한 증폭된 DNA가 목적하는 산물 인지를 확인하기 위하여 PCR product의 DNA sequencing을 실시하였다.
- 일반 PCR을 통해 확립된 PCR 조건을 기초로 SYBR® Premix Ex Tag™ (TaKaRa, Korea)을 사용하여 real-time PCR (Rotor- Gene 3000, Corbett Research) 조건을 확립하였다. Forward primer로 PPV-F1 을 reverse primer로 PPV-R2를 사용하여 PCR 반응의 annealing temperature를 최적화하였다(Fig. 2). Titer가 1.
- PPV 정량을 위해 Corbett Research사의 Rotor-Gene 3000 real-time PCR 기계를 사용하였다. PCR 반응액은 SYBR® Premix Ex Taq™ 12.5μ1, 10 pmol forward primer 0.5 ㎕, 10 pmol reverse primer 0.5 |니, template 2(il, MgCl2 3 ㎕(최종 5mM)에 멸균된 3차 증류수를 넣어 총 25 μ1가 되게 하였다. 핵산증폭은 pre-incubation은 95℃에서 10 초, denaturation은 95℃에서 5초, annealing은 20초(annealing 온도 최적화를 위해 52℃, 54℃, 56℃, 58℃에서 real-time PCR 수행), extention은 72℃에서 15초로 하여 45 cycle을 수행하였다.
- 위와 같은 조건을 만족하는 PCR을 확립하기 위해 Primer3 Software를 이용하여 PPV 특이적인 primer 5쌍을 디자인하였다(Table 1). PCR을 통해 디자인한 primer쌍들의 민감도를 확인하였다. Titer가 1.
- PPV의 정량을 위해 감염성 있는 바이러스의 titer® 50% tissue culture infectious dose (TCIEy)로 나타내었다. 바이러스 spiking 실험시 바이러스 titer를 정확하게 측정하기 위해서 바이러스를 spiking하지 않은 음성대조 실험에서 취한 시료들이 바이러스의 정량 분석을 위해 사용되는 세포에 cytotoxicity를 나타내는지, 바이러스 정량분석에 interference를 일으키는지를 먼저 실험하였다.
- PPV의 정량을 위해 일반 PCR을 통해 확립된 PCR 조건을 기초로 SYBR® Premix Ex Taq™ (TaKaRa, Korea)을 사용하여 real-time PCR 조건을 확립하였다. PPV 정량을 위해 Corbett Research사의 Rotor-Gene 3000 real-time PCR 기계를 사용하였다.
- Real-time PCR 결과를 감염역가의 결과와 비교 검증하기 위해 감염성 있는 바이러스의 titer를 세포배양법으로 정량하였다. Q-Sepharose 크로마토그래피 세척공정에서 바이러스 제거 효율을 검증하기 위해 scale-down된 크로마토그래피 공정에 바이러스를 spiking 한 후 공정에 따라 비흡착액, 완충용액 세척 액, 활성분획, 2 M NaCl 세척액, 1 M NaOH 세척액£로 분취하였다. 또한 세척공정 중에 제거되지 않고 Q-Sepharose resin 에 부착되어 있을 수 있는 바이러스 핵산을 정량하기 위해 크로 마토그래피 컬럼의 상단, 중단, 하단에서 Q-Sepharose resin을 취하였다.
- Real-time PCR을 이용한 크로마토그래피 세척 검증의 적격성과 응용 가능성을 확인하기 위해 모델 시스템으로 혈장으로부터 thrombin 분리 . 정제를 위한 SP-Sepharose 양이온 크로마토그래 피 공정과 factor VⅢ 분리.
- SP-Sepharose와 Q-Sepharose 크로마토그래피공정은 원하는 단백질을 컬럼으로부터 분획한 후 컬럼에 부착되어 있는 타단백질을 제거하기 위해 NaCl로 세척하는 공정과, 타단백질 제거 및 멸균을 위해 NaOH로 세척하는 공 정을 포함하고 있다. SP-Sepharose 크로마토그래피 세척공정에서 바이러스 제거 효율을 검증하기 위해 scale-down된 크로마토그래 피 공정에 바이러스를 spiking 한 후 공정에 따라 비흡착액, 완 충용액 세척액, 활성분획, 1 M NaCl 세척액, 1 M NaOH 세척 액으로 분취하였다. 또한 세척 공정 중에 제거되지 않고 SP- Sepharose resin에 부착되어 있을 수 있는 바이러스 핵산을 정량 하기 위해 크로마토그래피 컬럼의 상단, 중단, 하단에서 SP- Sepharose resin을 취하였다.
- (B) Agarose gel electrophoresis of the PCR products. Specificity of the real-time PCR assay was evaluated using the optimized protocol and then the PCR products were analyzed by 2% agarose gel electrophoresis. M, 100 bp DNA ladder; 1, Porcine parvovirus; 2, Human parvovirus Bl9; 3, Bovine herpes virus; 4, Minute virus of mice; 5, Negative control.
- MPK 세포를 10% fetal bovine serum (FBS: Gibco BRL, USA)을 첨가한 Dulbecco's Mintmun Essential Medium (DMEM: Gibco BRL, USA)에 배양하였다. T-150 flask에 배양된 단층 세포에 PPV를 감염시킨 후 주기적으로 세포병변효과(cytopathic effect: CPE)를 관찰하였다. CPE가 명백하게 관찰 될 때 배양액과 세포를 수거 한 다음, 400 X g에서 7분간 원심분리하여 상층액은 따로 모으고 pellet은 재현탁하였다.
- Titer를 측정 하고자 하는 시료들과 함께 Titer가 1.5 x 106 TCID50/ml인 PPV를 순차적으로 1.5 X 105 TCID50/ml, 1.5 x 104 TCID50/ml, 1.5 x 103 TCID50/ml, 1.5 x 102 TCID50/ml, 1.5 x 101 TCID50/ml, 1.5x 10° TCID/nl로 희석한 후 real-time PCR을 수행하여 정량을 위한 표준곡선을 작성하였다. 시료속에 들어있는 PPV DNA의 양을 표준곡선에 대입하여 정량하였다.
- 또한 세척공정 중에 제거되지 않고 Q-Sepharose resin 에 부착되어 있을 수 있는 바이러스 핵산을 정량하기 위해 크로 마토그래피 컬럼의 상단, 중단, 하단에서 Q-Sepharose resin을 취하였다. 각 분획과 Q-Sepharose resin에 존재흐}는 바이러스 핵산양을 확립된 real-time PCR을 이용하여 정량 분석하였다. Realtime PCR 결과를 감염역가의 결과와 비교 검증하기 위해 감염성 있는 바이러스의 titer를 세포배양법으로 정량하였다.
- 또한 세척 공정 중에 제거되지 않고 SP- Sepharose resin에 부착되어 있을 수 있는 바이러스 핵산을 정량 하기 위해 크로마토그래피 컬럼의 상단, 중단, 하단에서 SP- Sepharose resin을 취하였다. 각 분획과 SP-Sepharose resin에 존재하는 바이러스 핵산양을 확립된 real-time PCR을 이용하여 정량 분석하였다. Real-time PCR 결과를 감염역가의 결과와 비교 검증하기 위해 감염성 있는 바이러스의 titer를 세포배양법으로 정량하였다.
- 25 ml씩 접종하였다. 그 후 C(& 배양기에서 5% CO2, 35℃로 배양하면서 계속적으로 현미경으로 CPE를 관찰하였다.
- SP-Sepharose 크로마토그래피 세척공정에서 바이러스 제거 효율을 검증하기 위해 scale-down된 크로마토그래 피 공정에 바이러스를 spiking 한 후 공정에 따라 비흡착액, 완 충용액 세척액, 활성분획, 1 M NaCl 세척액, 1 M NaOH 세척 액으로 분취하였다. 또한 세척 공정 중에 제거되지 않고 SP- Sepharose resin에 부착되어 있을 수 있는 바이러스 핵산을 정량 하기 위해 크로마토그래피 컬럼의 상단, 중단, 하단에서 SP- Sepharose resin을 취하였다. 각 분획과 SP-Sepharose resin에 존재하는 바이러스 핵산양을 확립된 real-time PCR을 이용하여 정량 분석하였다.
- Q-Sepharose 크로마토그래피 세척공정에서 바이러스 제거 효율을 검증하기 위해 scale-down된 크로마토그래피 공정에 바이러스를 spiking 한 후 공정에 따라 비흡착액, 완충용액 세척 액, 활성분획, 2 M NaCl 세척액, 1 M NaOH 세척액£로 분취하였다. 또한 세척공정 중에 제거되지 않고 Q-Sepharose resin 에 부착되어 있을 수 있는 바이러스 핵산을 정량하기 위해 크로 마토그래피 컬럼의 상단, 중단, 하단에서 Q-Sepharose resin을 취하였다. 각 분획과 Q-Sepharose resin에 존재흐}는 바이러스 핵산양을 확립된 real-time PCR을 이용하여 정량 분석하였다.
- Corbett Research사(Australia)의 PALM-CYCLER를 이용한 일반 PCR 반응을 통해 디자인한 primer 5쌍들의 특이성을 확인하고, annealing temperature와 MgCI2 농도를 변화시켜 PCR 조건을 최적화하였다. 또한 증폭된 DNA가 목적하는 산물 인지를 확인하기 위하여 PCR product의 DNA sequencing을 실시하였다.
- 최적 MgCI2 농도를 설정하기 위해 최적화된 온도 56℃에서 MgC.를 2~8 mM까지 변화시켜 첨가해준 PPV 농도에 따른 Crossing point 값을 비교 하였다.
- PPV DNA 정량을 위한 real-time PCR 방법의 신뢰성(reliability)!- 보증하기 위해 확립된 실험법의 민감도(sensitivity), 재현성(reproducibility), 특이성(specificity) 등을 검증하였다. 민감도를 측정하기 위해 Titer가 1.5 X 106 TCIDeml인 PPV를 순차적으로 10배씩 희석한 후 real-time PCR을 수행하였다. 각 시료에 대해 real-time PCR cycle 수에 따른 fluorescence값의 증가를 관찰한 결과 민감도는 1.
- 확립된 PPV DNA 정량법의 신뢰성 (reliability)을 보증하기 위해 확립된 실험법의 민감도(sensitivity), 재현성(reproducibility), 특이성(specificity) 등을 검증하였다(16, 28). 민김도를 즉정하기 위해 Titer가 1.5 X 106 T*/mCl ID 인 PPV를 순차적으로 1.5x IO5 TCIDJ0/ml, 1* .5x10 TCID50/ml, 1.5 x IO3 TCID50/ml, 1.5 x 102 TCID50/ml, 1.5 x IO1 TCID50/fnl, 1.5 x 10° TCID0ml희석 한 후 real-time PCR을 수행하였다. 특이성 검증을 위해 DNA 바이러스인 human parvovirus Bl9, bovine herpes virus, minute virus of mice에 대한 cross-reactivity를 즉정하였다.
- PPV의 정량을 위해 감염성 있는 바이러스의 titer® 50% tissue culture infectious dose (TCIEy)로 나타내었다. 바이러스 spiking 실험시 바이러스 titer를 정확하게 측정하기 위해서 바이러스를 spiking하지 않은 음성대조 실험에서 취한 시료들이 바이러스의 정량 분석을 위해 사용되는 세포에 cytotoxicity를 나타내는지, 바이러스 정량분석에 interference를 일으키는지를 먼저 실험하였다. 바이러스 spiking 실험 중 취한 시료들을 cytotoxicity 와 interference# 나타내지 않은 농도로 바이러스 배양 배지를 사용하여 희석하였다.
- 바이러스 정량 분석이 끝난 후 그 결과를 기초로 각 공정에서 바이러스 감소인수를 구하였다. 바이러스 감소인수는 바이러스가 spiking된 공정출발물질에 존재하는 바이러스 양의 log 값에서 공정진행 후에 존재하는 바이러스 양의 log 값을 뺀 log 감소인 수(reduction factor)로 정의하였다(15).
- 5x 10° TCID/nl로 희석한 후 real-time PCR을 수행하여 정량을 위한 표준곡선을 작성하였다. 시료속에 들어있는 PPV DNA의 양을 표준곡선에 대입하여 정량하였다. 표준곡 선은 PPV의 농도에 따라 real-time PCR에 의해 검출되는 Crossing point 값을 TCID50 equivalerrt/mt로 전환하여 작성하였다.
- 25 ml씩 접종하였다. 양성 대조구로 titer 를 알고 있는 바이러스를 7배수로 희석하여 24 well plate에 배 양된 세포에 0.25 ml씩 접종하였다. 음성대조구로 바이러스가 spiking되지 않은 배양배지를 0.
- 또한 크로마토그래피 세척공정에서 바이러스 제거 검증을 위한 정량 PCR의 경우 높은 민감도가 요구된다. 위와 같은 조건을 만족하는 PCR을 확립하기 위해 Primer3 Software를 이용하여 PPV 특이적인 primer 5쌍을 디자인하였다(Table 1). PCR을 통해 디자인한 primer쌍들의 민감도를 확인하였다.
- 25 ml씩 접종하였다. 음성대조구로 바이러스가 spiking되지 않은 배양배지를 0.25 ml씩 접종하였다. 그 후 C(& 배양기에서 5% CO2, 35℃로 배양하면서 계속적으로 현미경으로 CPE를 관찰하였다.
- 본 연구에서는 혈장분획 제제 제조공정 에 사용되는 크로마토그래피의 세척공정에서 감염성 위해인자의 제거 및 불활화 공정의 검토 강화로 혈장분획제제의 안전성을 확보하기 위해 크로마토그래피 세척검증 시스템을 구축하였다. 이를 위해 물리·화학적 처리에 큰 저항성을 갖는 B19의 모델 바이러스인 Porcine parvovirus (PPV)를 대상으로 real-time PCR< 이용한 크로마토그래피 세척검증 시스템을 구축하고, 크로마토그래피 공정에 적용한 후 검증 시스템의 적합성을 평가하였다.
- 일반 PCR을 통해 확립된 PCR 조건을 기초로 SYBR® Premix Ex Tag™ (TaKaRa, Korea)을 사용하여 real-time PCR (Rotor- Gene 3000, Corbett Research) 조건을 확립하였다. Forward primer로 PPV-F1 을 reverse primer로 PPV-R2를 사용하여 PCR 반응의 annealing temperature를 최적화하였다(Fig.
- PCR 조건을 최적화한 결과 annealing temperature와 MgCl2 농도는 각각 56℃와 5 mM이었다. 최적 조건에서 PCR의 민감도를 측정하였다. Titer가 1.
- 5 x 10° TCID0ml희석 한 후 real-time PCR을 수행하였다. 특이성 검증을 위해 DNA 바이러스인 human parvovirus Bl9, bovine herpes virus, minute virus of mice에 대한 cross-reactivity를 즉정하였다., 재현성 검증 을 위해 서로 다른 날에 1.
- PCR 반응을 위해 바이러스 genomic DNA 2 μ1, 5 pmol forward primer 1 μ1, 5 pm이 reverse primer 1 μl, 10X Quick PCR Premix (Genenmed, Korea) 25 gl 혼합액에 멸균된 3차 증류수 21 μ1를 첨가하여 최종부피를 50 μ1로 맞추었다. 핵산증폭은 pre-incubatione 95℃에서 5분, denaturation은 95℃에서 30초, annealinge 52℃, 54℃, 56℃, 또는 58℃에서 30초, extention은 72℃에서 1분으로 하여 40 cycle을 수행하였다. 40 cycle PCR 후 72℃에서 5분 반응시킨 후 2% agarose gel 전기영동을 통해 PCR 반응물을 확인하였다.
- 5 |니, template 2(il, MgCl2 3 ㎕(최종 5mM)에 멸균된 3차 증류수를 넣어 총 25 μ1가 되게 하였다. 핵산증폭은 pre-incubation은 95℃에서 10 초, denaturation은 95℃에서 5초, annealing은 20초(annealing 온도 최적화를 위해 52℃, 54℃, 56℃, 58℃에서 real-time PCR 수행), extention은 72℃에서 15초로 하여 45 cycle을 수행하였다. 마지막 cycle 후에는 모든 반응물에 대하여 72。。부터 95℃까지 영역에서 melting curve 분석을 실시하였다.
- 확립된 PPV DNA 정량법의 신뢰성 (reliability)을 보증하기 위해 확립된 실험법의 민감도(sensitivity), 재현성(reproducibility), 특이성(specificity) 등을 검증하였다(16, 28). 민김도를 즉정하기 위해 Titer가 1.
- 확립된 PPV DNA 정량법의 재현성 검증을 위해 서로 다른 날에 PPV stock solution에서 DNA를 주줄하고 real-time PCR을 수행한 후 Crossing point 값을 비교하였다(Fig. 4). PPV log titer (logl0 TCID50/ml; x)에 대한 Crossing point 값(y) 간의 표준 회귀식은 첫째 날의 경우 y=-3.
대상 데이터
- PPV (ATCC VR 742)의 배양과 정량을 위해 Minipig Kidney (MPK) 세포(ATCC CCL 166)를 사용하였다(17). MPK 세포를 10% fetal bovine serum (FBS: Gibco BRL, USA)을 첨가한 Dulbecco's Mintmun Essential Medium (DMEM: Gibco BRL, USA)에 배양하였다.
- PPV DNA는 QIAamp® DNA Blood Mini Kit (QIAGEN, German)을 사용하여 분리하였다. PCR 반응을 위해 바이러스 genomic DNA 2 μ1, 5 pmol forward primer 1 μ1, 5 pm이 reverse primer 1 μl, 10X Quick PCR Premix (Genenmed, Korea) 25 gl 혼합액에 멸균된 3차 증류수 21 μ1를 첨가하여 최종부피를 50 μ1로 맞추었다.
- PPV 유전자를 증폭하기 위해 사용한 올리고핵산 primer 염기 서열은 NCBI data.base에 보고된 PPV complete genome(NC 001718)을 기초로 Primer3 Software를 이용하여 디자인하였다 (Table 1). Corbett Research사(Australia)의 PALM-CYCLER를 이용한 일반 PCR 반응을 통해 디자인한 primer 5쌍들의 특이성을 확인하고, annealing temperature와 MgCI2 농도를 변화시켜 PCR 조건을 최적화하였다.
- 정제를 위한 SP-Sepharose 양이온 크로마토그래 피 공정과 factor VⅢ 분리.정제를 위한 Q-Sepharose 음이온 크로마토그래피 공정을 선정하였다. SP-Sepharose와 Q-Sepharose 크로마토그래피공정은 원하는 단백질을 컬럼으로부터 분획한 후 컬럼에 부착되어 있는 타단백질을 제거하기 위해 NaCl로 세척하는 공정과, 타단백질 제거 및 멸균을 위해 NaOH로 세척하는 공 정을 포함하고 있다.
데이터처리
- 바이러스 감소인수는 바이러스가 spiking된 공정출발물질에 존재하는 바이러스 양의 log 값에서 공정진행 후에 존재하는 바이러스 양의 log 값을 뺀 log 감소인 수(reduction factor)로 정의하였다(15). 모든 실험은 독립적으로 세 번 실시하여 평균값을 구하였다.
이론/모형
- PPV의 정량을 위해 일반 PCR을 통해 확립된 PCR 조건을 기초로 SYBR® Premix Ex Taq™ (TaKaRa, Korea)을 사용하여 real-time PCR 조건을 확립하였다. PPV 정량을 위해 Corbett Research사의 Rotor-Gene 3000 real-time PCR 기계를 사용하였다. PCR 반응액은 SYBR® Premix Ex Taq™ 12.
- 각 분획과 SP-Sepharose resin에 존재하는 바이러스 핵산양을 확립된 real-time PCR을 이용하여 정량 분석하였다. Real-time PCR 결과를 감염역가의 결과와 비교 검증하기 위해 감염성 있는 바이러스의 titer를 세포배양법으로 정량하였다. Q-Sepharose 크로마토그래피 세척공정에서 바이러스 제거 효율을 검증하기 위해 scale-down된 크로마토그래피 공정에 바이러스를 spiking 한 후 공정에 따라 비흡착액, 완충용액 세척 액, 활성분획, 2 M NaCl 세척액, 1 M NaOH 세척액£로 분취하였다.
- 각 분획과 SP-Sepharose resin에 존재하는 바이러스 핵산양을 확립된 real-time PCR을 이용하여 정량 분석하였다. Real-time PCR 결과를 감염역가의 결과와 비교 검증하기 위해 감염성 있는 바이러스의 titer를 세포배양법으로 정량하였다. Q-Sepharose 크로마토그래피 세척공정에서 바이러스 제거 효율을 검증하기 위해 scale-down된 크로마토그래피 공정에 바이러스를 spiking 한 후 공정에 따라 비흡착액, 완충용액 세척 액, 활성분획, 2 M NaCl 세척액, 1 M NaOH 세척액£로 분취하였다.
성능/효과
- 5 x 103 TCID50/ml, 1.5 x 102 TCIU/ml인 PPV를 시료로 annealing temperature를 52℃, 54℃, 56℃, 58℃ 로 변화시키며 real-time PCR을 수행하였을 때 56℃에서 Crossing point가 가장 낮게 나타나 56。1.5 x 102 TCIDs/ml인 PPV를 시료로 MgCl2 농도를 2 mM, 3 mM, 4mM, 5 mM, 6mM, 7 mM, 8 mM로 변화시켜 가며 realtime PCR을 수행하였을 때 5 mM에서 Crossing point가 가장 낮게 나타나 최적 MgCl2 농도는 5 mM임을 알 수 있었다.
- 999)3- PPV log titer와 Crossing point 값 간의 회귀성이 매우 높았다. 3개 표준곡선 기울기의 평균, 표준 편차 및 변동계수 백분율은 각각 -3.260, 0.031, -0.95%이었으며, y축 교점의 평균, 표준편차 및 변동계수 백분율은 각각 29.796, 0.396, 1.33%로 표준곡선의 재현성이 매우 우수함을 확인할 수 있었다.
- 3A). Melting curve 분석 결과 PPV DNA에 특이적인 부분과 primer dimer 등 비특이적인 부분으로 나뉘었으며, 완충용액 대조구에서는 PPV DNA에 특이적인 peak을 확인할 수 없었다(Fig. 3B). 증폭된 PCR 산물을 2% (w/v) agarose gel을 사용하여 전기영동한 결과 각 PPV 양성시료에서 예상 크기의 밴드를 확인할 수 있었지만, 완충용액 대조구에서는 PCR 산물을 확인할 수 없었다(자료 미제시).
- 비록 PPV는 NaOH 처리에 의해 사멸되었다 할지라도 PPV DNA는 파괴되지 않은 상태로 존재하기 때문에 real-time PCR로 측정한 경우 PPV DNA가 정량된 것으로 판단된다. NaOH로 크로마토그래피 시스템을 세척한 후 크로마토그래피 resin에 존재하는 PPV를 정량분석한 결과 잔존하는 PPV가 전혀 검출되지 않았다. 이러한 결과는 SP-Sepharose resin과 Q-Sepharose resin에 흡착되었던 PPV가 NaOH 세척공정에 의해 완벽하게 세척되었음을 보여준다.
- 1). PCR 산물을 sequencing한 후 blast searching (www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 한 결과 PCR 산물이 PPV 유전자임을 확인할 수 있었다(자료 미제시).
- Q-Sepharose 크로마토그래피의 경우에 각 분획에 존재하는 PPV의 titei를 감염역가시험법으로 살펴본 결과 활성분획에 가장 많이 존재하였고, 비흡착액, 완충용액 세척액, NaCI 세척액에서 도 감염성 PPV가 검출되었다. 하지만 1 M NaOH 세척액에서는 감염성 PPV가 검출되지 않았다(Table 4).
- 5A). Real-time PCR 산물을 2% agarose gel 상에서 분석한 결과 PPV 양성 대조구에서만 PCR 반응 산물이 생성되었고, 다른 바이러스와 완충용액 음성대조구에서는 PCR 반응 산물이 생성되지 않았음을 알 수 있었 다(Fig. 5B). 이와 같은 결과에서 확립된 real-time PCR 방법은 PPV에 특이적인 실험법임을 확인하였다.
- 하지만 1 M NaOH 세척액에서는 감염성 PPV가 검출되지 않았다. Real-time PCR로 PPV를 정량 분석한 결과 비흡착액, 완충용액 세척액, 활성분획에서는 감염역 가시험법으로 정량한 결과와 거의 일치하였다. 하지만 1 M NaCI 세척액과 1 M NaOH 세척액에서는 real-time PCR로 PPV 를 정량 분석한 결과가 감염역가시험법으로 측정한 결과보다 훨 씬 높게 나타났다.
- 하지만 1 M NaOH 세척액에서는 감염성 PPV가 검출되지 않았다. Real-time PCR로 PPV를 정량 분석한 결과 비흡착액, 완충용액 세척액, 활성분획에서는 감염역 가시험법으로 정량한 결과와 거의 일치하였다. 하지만 1 M NaCI 세척액과 1 M NaOH 세척액에서는 real-time PCR로 PPV 를 정량 분석한 결과가 감염역가시험법으로 측정한 결과보다 훨 씬 높게 나타났다.
- 40이었다. Real-time PCR로 측정한 초기시료에서 PPV의 총역가는 7.95 logl0 TCID50 equivalents 였으며, 활성분획에서는 6.48 logl0 TCID50 equivalents로 나타나바이러스 감소인수는 1.47이었다.
- 37이었다. Realtime PCR로 측정한 초기시료에서 PPV의 총역가는 7.65 log10 TCID50 equivalents였으며, 활성분획에서는 5.19 logl0 TCID50 equivalents로 나타나 바이러스 감소인수는 2.46이었다.
- SP-Sepharose 크로마토그래피와 Q-Sepharose 크로마토그래피 공정에서 PPV의 분포를 감염역가시험법과 real-time PCR로 분석한 결과 PPV를 spiking한 초기시료, 비흡착액, 완충용액 세척액, 활성분획에서는 정량 결과가 거의 일치하였다. 하지만 NaCI 세척액과 NaOH 세척액에서는 real-time PCR로 PPV를 정량 분석한 결과가 세포배양법으로 측정한 결과보다 훨씬 높게 나타났다.
- PCR을 통해 디자인한 primer쌍들의 민감도를 확인하였다. Titer가 1.5 x 105 TCID50/ml, 1.5x 104 TCID50/ml인 PPV를 시료로 PCR을 수행한 결과 forward primer로 PPV-F1 을 reverse primer로 PPV-R2를 사용했을 때 가장 민감도가 우수하였다(자료 미제시). PCR 조건을 최적화한 결과 annealing temperature와 MgCl2 농도는 각각 56℃와 5 mM이었다.
- 최적 조건에서 PCR의 민감도를 측정하였다. Titer가 1.5 x 106 TClD50/ml인 PPV를 순차적으로 희석하여 PCR 한 결과 1.5 TCID50/ml까지 PCR 산물을 확인할 수 있었다 (Fig. 1). PCR 산물을 sequencing한 후 blast searching (www.
- 또한 세척공정 중에 제거되지 않고 크로마토그래피 gel에 부착되어 있을 수 있는 바이러스 핵산을 정량하기 위해 크로마토그래피 컬럼의 상단, 중 단, 하단에서 resin을 취하였다(Table 3). 각 분획에 존재하는 PPV의 titei를 감염역가시험법으로 살펴본 결과 비흡착액에 가장 많이 존재하였고, 완충용액 세척액, 활성분획, NaCl 세척액에서도 감염성 PPV가 검출되었다. 하지만 1 M NaOH 세척액에서는 감염성 PPV가 검출되지 않았다.
- 5 X 106 TCIDeml인 PPV를 순차적으로 10배씩 희석한 후 real-time PCR을 수행하였다. 각 시료에 대해 real-time PCR cycle 수에 따른 fluorescence값의 증가를 관찰한 결과 민감도는 1.5 TCID50/ml임을 확인할 수 있었다(Fig. 3A). Melting curve 분석 결과 PPV DNA에 특이적인 부분과 primer dimer 등 비특이적인 부분으로 나뉘었으며, 완충용액 대조구에서는 PPV DNA에 특이적인 peak을 확인할 수 없었다(Fig.
- 다른 DNA virus들 (human parvovirus B19, bovine herpes virus, minute virus of mice)을 대상으로 특이성을 실험한 결과 PPV의 경우에만 fluorescence값의 증가를 관찰할 수 있었고, 다른 바이러스에서는 완충용액 음성 대조군과 같이 fluorescence값 의 증가를 관찰할 수 없었다(Fig. 5A). Real-time PCR 산물을 2% agarose gel 상에서 분석한 결과 PPV 양성 대조구에서만 PCR 반응 산물이 생성되었고, 다른 바이러스와 완충용액 음성대조구에서는 PCR 반응 산물이 생성되지 않았음을 알 수 있었 다(Fig.
- 바이러스가 spiking된 공정출발물질에 존재하는 바이러스 양의 log 값에서 공정진행 후에 활성분획에 존재하는 바이러스 양의 log 값을 뺀 log 바이러스 감소인수의 경우에 real-time PCR로 분석한 결과가 감염역가시험법으로 분석한 결과와 거의 일치하였다. 이러한 결과는 본 연구를 통해 확립된 PPV real-time PCR 시험법이 크로마토그래피나 필터를 이용한 바이러스 제거와 관련된 공정의 검증 연구에 매우 유용하게 쓰일 수 있음을 시사한다.
- 5 TCIDeml이었다. 생물의약품의 품질관리 평가에 있어 민감도와 재현성은 분석의 정확성, 특이성, 검출한계 등과 함께 매우 중요한 요인으로 고려되는데, 본 연구에서 확립한 정량법은 PPV를 정량하는데 있어 민감도와 재현성 이 우수함을 확인할 수 있었다.
- 바이러스가 spiking된 공정출발물질에 존재하는 바이러스 양의 log 값에서 공정진행 후에 활성분획에 존재하는 바이러스 양의 log 값을 뺀 log 바이러스 감소인수의 경우에 real-time PCR로 분석한 결과가 감염역가시험법으로 분석한 결과와 거의 일치하였다. 이러한 결과는 본 연구를 통해 확립된 PPV real-time PCR 시험법이 크로마토그래피나 필터를 이용한 바이러스 제거와 관련된 공정의 검증 연구에 매우 유용하게 쓰일 수 있음을 시사한다.
- 이러한 결과는 SP-Sepharose resin과 Q-Sepharose resin에 흡착되었던 PPV가 NaOH 세척공정에 의해 완벽하게 세척되었음을 보여준다. 이와 같은 결과에서 SP-Sepharose 크로마토그래피와 Q- Sepharose 크로마토그래피의 경우 NaOH 세척공정이 바이러스 불활화 및 세척에 매우 효과적인 공정임을 확인할 수 있었다.
- 5B). 이와 같은 결과에서 확립된 real-time PCR 방법은 PPV에 특이적인 실험법임을 확인하였다.
- Real-time PCR로 PPV 를 정량 분석한 결과 비흡착액, 완충용액 세척액, 활성분획에서 는 감염역가시험법으로 정량한 결과와 거의 일치하였다. 하지만 2 M NaCI 세척액에서는 real-time PCR로 PPV를 정량 분석한 결과가 감염역가시험법으로 측정한 결과보다 훨씬 높게 나타났으며, 1 M NaOH 세척액의 경우 감염역가시험법으로 측정했을 때는 감염성 PPV가 검출되지 않았지만, real-time PCR로 측정했을 때는 4.98 log10 TCID5O equivalents로 측정이 되었다. 감염역 가시험의 경우 PPV를 spiking한 초기시료에서 PPV의 총역가가 7.
- SP-Sepharose 크로마토그래피와 Q-Sepharose 크로마토그래피 공정에서 PPV의 분포를 감염역가시험법과 real-time PCR로 분석한 결과 PPV를 spiking한 초기시료, 비흡착액, 완충용액 세척액, 활성분획에서는 정량 결과가 거의 일치하였다. 하지만 NaCI 세척액과 NaOH 세척액에서는 real-time PCR로 PPV를 정량 분석한 결과가 세포배양법으로 측정한 결과보다 훨씬 높게 나타났다. NaOH 세척액의 경우 세포배양법으로 측정했을 때는 감염성 PPV가 검출되지 않았지만, real-time PCR로 측정했을 때는 각각 4.
- 혈장분획제제 안전성 평가의 모델에서 real-time PCR을 활용한 PPV 정량 검출 방법은 크로마토그래피 공정에서 미량의 바이러스를 실시간에 정량화 할 수 있음으로써 혈장분획제제 제조공정 에서 바이러스 제거 검증 실험시 감염역가시험과 함께 적용할 수 있는 유용한 평가기술일 뿐만 아니라, 감염역가시험으로는 분석할 수 없는 크로마토그래피 세척공정에서의 바이러스 안전성 검증에 활용할 수 있는 적절한 방법임이 확인되었다. 본 연구의 결과는 정부의 의약품 관리정책의 일환으로 혈장분획제제 생산 공정의 세척검증에 대한 지침안을 작성하는데 기초 근거자료로 활용할 수 있을 것이다.
- 본 연구에서는 PPV의 정량적 분석 방법으로 real-time PCR을 활용하였으며, 확립된 PPV 정량법을 혈장분획제제 제조공정에서 크로마토그래피 세척검증에 최초로 적용하여 혈장분획제제 안전성 평가기술의 확립에 공헌하였다. 확립된 실험법의 민감도는 1.5 TCIDeml이었다. 생물의약품의 품질관리 평가에 있어 민감도와 재현성은 분석의 정확성, 특이성, 검출한계 등과 함께 매우 중요한 요인으로 고려되는데, 본 연구에서 확립한 정량법은 PPV를 정량하는데 있어 민감도와 재현성 이 우수함을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 본 연구의 결과는 정부의 의약품 관리정책의 일환으로 혈장분획제제 생산 공정의 세척검증에 대한 지침안을 작성하는데 기초 근거자료로 활용할 수 있을 것이다. 또한 확립된 크로마토그래피 검증 시스템을 생산 공정에 적용하여 혈장분획제제의 위해 바이러스로부터의 안전성 증진에 공헌할 수 있을 것이다.
- 혈장분획제제 안전성 평가의 모델에서 real-time PCR을 활용한 PPV 정량 검출 방법은 크로마토그래피 공정에서 미량의 바이러스를 실시간에 정량화 할 수 있음으로써 혈장분획제제 제조공정 에서 바이러스 제거 검증 실험시 감염역가시험과 함께 적용할 수 있는 유용한 평가기술일 뿐만 아니라, 감염역가시험으로는 분석할 수 없는 크로마토그래피 세척공정에서의 바이러스 안전성 검증에 활용할 수 있는 적절한 방법임이 확인되었다. 본 연구의 결과는 정부의 의약품 관리정책의 일환으로 혈장분획제제 생산 공정의 세척검증에 대한 지침안을 작성하는데 기초 근거자료로 활용할 수 있을 것이다. 또한 확립된 크로마토그래피 검증 시스템을 생산 공정에 적용하여 혈장분획제제의 위해 바이러스로부터의 안전성 증진에 공헌할 수 있을 것이다.
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