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문제 정의
- Kim과 Won(33)의 연구는 정상체중의 실험동물에게 고지방식이와 쇠비름 에탄올 추출물을 25∼125 mg/kg의 농도로 공급하여 혈액의 지질성분의 변화를 살펴본 결과, 혈액의 총콜레스테롤과 중성지질을 감소시키는 효과가 있음을 보고하여 본 연구와 유사한 결과를 나타내었다. 또한 본 연구는 식이에 의해 비만이 유발된 질병모델에서 혈중 콜레스테롤과 중성지질의 저하효과를 나타내어 고지혈증 증세를 개선하는 효과를 나타내었다. 따라서 쇠비름 에탄올 추출물은 고지방식이를 공급받는 정상체중을 가진 동물이거나 비만 질병동물 모두에서 고지혈증을 개선하는 효과가 있는 것으로 사료된다.
- 이와 같이 쇠비름은 생리활성물질을 함유한 식용이 가능한 야생식물로 성분연구, 해독작용, 항산화활성에 관한 연구가 주류를 이루고 있고, 정상 체중의 실험동물에게 고지방식과 함께 쇠비름 추출물을 급여하여 지방대사의 개선효과를 본 연구결과만이 보고되었으나 본 연구에서는 고지방식이로 비만이 유도된 실험동물에 쇠비름 에탄올 추출물을 고지방식이와 병행 공급한 후, 고지혈증에 미치는 영향에 대해 검증하고자 하였다. 즉, 식이에 의해 비만이 유발된 질병모델에서의 고지혈증 증세를 개선하는 효과를 검증하여 건강기능성 식품 제조용 신소재 개발의 기초자료로 제공하여 쇠비름의 이용성을 증대시키고자 하였다.
- 이와 같이 쇠비름은 생리활성물질을 함유한 식용이 가능한 야생식물로 성분연구, 해독작용, 항산화활성에 관한 연구가 주류를 이루고 있고, 정상 체중의 실험동물에게 고지방식과 함께 쇠비름 추출물을 급여하여 지방대사의 개선효과를 본 연구결과만이 보고되었으나 본 연구에서는 고지방식이로 비만이 유도된 실험동물에 쇠비름 에탄올 추출물을 고지방식이와 병행 공급한 후, 고지혈증에 미치는 영향에 대해 검증하고자 하였다. 즉, 식이에 의해 비만이 유발된 질병모델에서의 고지혈증 증세를 개선하는 효과를 검증하여 건강기능성 식품 제조용 신소재 개발의 기초자료로 제공하여 쇠비름의 이용성을 증대시키고자 하였다.
가설 설정
- 2)NS: not significant.
- 3)NS: not significant.
제안 방법
- 고지방 식이에 쇠비름 에탄올 추출물을 4주간 공급하는 동안의 혈액의 지질변화를 살펴보기 위하여 실험식이 0주와 2주 때에 마우스를 14∼16시간 절식시킨 후 안와채혈법으로 채혈하여 항응고제(heparin)가 들어 있는 튜브에 혈액을 취한 후 3,000 rpm에서 15분간 원심분리 하여 혈청을 분리하였다.
- 비만을 유도하기 위하여 모든 실험군은 beef tallow를 40% 첨가한 고지방식이를 5주간 공급하였다(Table 1). 또한 쇠비름 에탄올 추출물의 지질 저하효과를 살펴보기 위하여 고지방식이에 쇠비름 에탄올 추출물을 6주부터 9주까지 하루에 한 번씩 경구투여 하였다. 실험군은 난괴법에 의하여 고지방식이군(high fat diet group, HFD), 쇠비름 에탄올 추출물 75 mg/kg 투여군(high fat diet supplemented with 75 mg/kg P ortulaca oleracea L.
- 쇠비름 에탄올 추출물의 고지혈증 개선 효과를 알아보기 위하여 C57BL/6J mice에게 9주 동안 고지방식이를 섭취시켰다. 마지막 4주 동안은 고지방식이에 쇠비름 에탄올 저농도투여군(HFD＋POE75) 및 쇠비름 에탄올 고농도투여군(HFD＋POE125)으로 나누어 하루에 한 번씩 경구투여 하였으며 고지방식이군(HFD)은 증류수를 투여하였다. HFD＋POE 75군 및 HFD＋POE 125군의 체중변화량은 유의적인 차이를 나타나지는 않았으나 식이효율은 HFD군에 비해 유의적으로 감소하였다.
- 비만 질병모델에서 쇠비름 에탄올 추출물을 각각의 농도별로 경구투여 하여 실험식이가 시작되기 바로 직전 0, 2, 4주 동안 혈청의 총콜레스테롤과 중성지질 함량을 측정하였다. 0주 때의 총콜레스테롤 함량은 모든 군에서 113.
- 실험동물은 6주령의 C57BL/6J mice를 (주)대한바이오링크(충북 음성, 대한민국)에서 구입하여 1주일간 일반식이로 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 비만을 유도하기 위하여 모든 실험군은 beef tallow를 40% 첨가한 고지방식이를 5주간 공급하였다(Table 1). 또한 쇠비름 에탄올 추출물의 지질 저하효과를 살펴보기 위하여 고지방식이에 쇠비름 에탄올 추출물을 6주부터 9주까지 하루에 한 번씩 경구투여 하였다.
- 쇠비름 에탄올 추출물의 고지혈증 개선 효과를 알아보기 위하여 C57BL/6J mice에게 9주 동안 고지방식이를 섭취시켰다. 마지막 4주 동안은 고지방식이에 쇠비름 에탄올 저농도투여군(HFD＋POE75) 및 쇠비름 에탄올 고농도투여군(HFD＋POE125)으로 나누어 하루에 한 번씩 경구투여 하였으며 고지방식이군(HFD)은 증류수를 투여하였다.
- 실험동물 사육실 온도는 20±2℃,상대습도 60±5%로 유지하였고, 조명은 12시간 간격으로 조절하였다. 식이섭취량은 1주에 3회, 체중은 매주 한 번씩 측정하였다.
- 또한 쇠비름 에탄올 추출물의 지질 저하효과를 살펴보기 위하여 고지방식이에 쇠비름 에탄올 추출물을 6주부터 9주까지 하루에 한 번씩 경구투여 하였다. 실험군은 난괴법에 의하여 고지방식이군(high fat diet group, HFD), 쇠비름 에탄올 추출물 75 mg/kg 투여군(high fat diet supplemented with 75 mg/kg P ortulaca oleracea L. ethanol extract, HFD＋POE75), 쇠비름 에탄올 추출물 125 mg/kg 투여군(high fat diet supplemented with 125 mg/kg P ortulaca oleracea L. ethanol extract, HFD＋POE125)이고, 각 군당 10마리로 하여 한 cage당 3～4마리씩 분리하여 4주간 사육하였다. 실험동물 사육실 온도는 20±2℃,상대습도 60±5%로 유지하였고, 조명은 12시간 간격으로 조절하였다.
- 실험동물 사육실 온도는 20±2℃,상대습도 60±5%로 유지하였고, 조명은 12시간 간격으로 조절하였다.
- 혈청 LDL-cholesterol은 Friedewald식 {총콜레스테롤－(HDL-콜레스테롤－중성지방/5)}(35)에 의하여 계산하였다. 심혈관계질환의 위험도 판정에 이용되는 동맹격화지수(atherogenic index, AI)는 {(총 콜레스테롤－HDL-콜레스테롤)/HDL-콜레스테롤}(36)에의하여 구하였으며, 심혈관위험지수(cardiac risk factor, CRF)(36)는 총콜레스테롤을 HDL-콜레스테롤로 나누어 구하였다. 간의 지질농도는 Folch 등(37)의 방법에 따라 간조직의 10배량의 용매(chloroform : methanol＝2:1)를 가하여 반복추출하고 용매를 휘발시켜 지질을 얻었으며, 이때의 총 지질함량은 중량법으로 구하였다.
- )은 강원도 원주시 근교에서 자생하는 것을 채취하였으며, 동결 건조하여 분쇄한 후 -70℃ 냉동고에 보관하면서 사용하였다. 에탄올 추출물 제조는 분말상태인 시료 중량의 10배인 70% 에탄올을 첨가하고 80℃에서 8시간 동안 3회 추출한 후, 감압여과 장치에서 뜨거운 상태에서 여과한 후 감압농축기를 사용하여 추출용매를 제거한 후 동결건조 하여 실험에 사용하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 쇠비름(P ortulaca oleracea L.)은 강원도 원주시 근교에서 자생하는 것을 채취하였으며, 동결 건조하여 분쇄한 후 -70℃ 냉동고에 보관하면서 사용하였다. 에탄올 추출물 제조는 분말상태인 시료 중량의 10배인 70% 에탄올을 첨가하고 80℃에서 8시간 동안 3회 추출한 후, 감압여과 장치에서 뜨거운 상태에서 여과한 후 감압농축기를 사용하여 추출용매를 제거한 후 동결건조 하여 실험에 사용하였다.
- 실험동물은 6주령의 C57BL/6J mice를 (주)대한바이오링크(충북 음성, 대한민국)에서 구입하여 1주일간 일반식이로 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 비만을 유도하기 위하여 모든 실험군은 beef tallow를 40% 첨가한 고지방식이를 5주간 공급하였다(Table 1).
데이터처리
- 2)Means with the different letters are significantly different (p<0.05) by Duncan's multiple range test.
- 3)Means with the different letters are significantly different (p< 0.05) by Duncan's multiple range test.
- 4)Means with the different letters are significantly different (p<0.05) by Duncan's multiple range test.
- 실험결과는 평균 및 표준편차로 나타내었고, 쇠비름 에탄올 추출물의 지질 저하효과를 살펴보기 위해서 고지방식이군, 쇠비름 에탄올 추출물 75 mg/kg 및 125 mg/kg 경구투여군 간의 효과를 one-way ANOVA로 분석한 후 Duncan's multiple range test로 유의성 검증을 하였다.
이론/모형
- 간의 손상정도를 측정하기 위하여 아미노산 전이효소인 ALT와 AST 활성을 효소법에 의한 정량용 kit(Asan Phamaceutical Co.)을 이용하여 측정하였다.
- 심혈관계질환의 위험도 판정에 이용되는 동맹격화지수(atherogenic index, AI)는 {(총 콜레스테롤－HDL-콜레스테롤)/HDL-콜레스테롤}(36)에의하여 구하였으며, 심혈관위험지수(cardiac risk factor, CRF)(36)는 총콜레스테롤을 HDL-콜레스테롤로 나누어 구하였다. 간의 지질농도는 Folch 등(37)의 방법에 따라 간조직의 10배량의 용매(chloroform : methanol＝2:1)를 가하여 반복추출하고 용매를 휘발시켜 지질을 얻었으며, 이때의 총 지질함량은 중량법으로 구하였다. 추출한 지질의 총지질 함량은 Frings와 Dunn법(38)에 따라 분석하였으며 총콜레스테롤과 중성지질은 혈청에서의 분석과 동일한 방법으로 분석하였다.
- 간의 지질농도는 Folch 등(37)의 방법에 따라 간조직의 10배량의 용매(chloroform : methanol＝2:1)를 가하여 반복추출하고 용매를 휘발시켜 지질을 얻었으며, 이때의 총 지질함량은 중량법으로 구하였다. 추출한 지질의 총지질 함량은 Frings와 Dunn법(38)에 따라 분석하였으며 총콜레스테롤과 중성지질은 혈청에서의 분석과 동일한 방법으로 분석하였다.
- 혈중의 중성지질, 총콜레스테롤, HDL-콜레스테롤 농도는 시판되는 kit(Asan Phamaceutical Co., Seoul, Korea)를 사용하여 효소법으로 측정하였다. 혈청 LDL-cholesterol은 Friedewald식 {총콜레스테롤－(HDL-콜레스테롤－중성지방/5)}(35)에 의하여 계산하였다.
- , Seoul, Korea)를 사용하여 효소법으로 측정하였다. 혈청 LDL-cholesterol은 Friedewald식 {총콜레스테롤－(HDL-콜레스테롤－중성지방/5)}(35)에 의하여 계산하였다. 심혈관계질환의 위험도 판정에 이용되는 동맹격화지수(atherogenic index, AI)는 {(총 콜레스테롤－HDL-콜레스테롤)/HDL-콜레스테롤}(36)에의하여 구하였으며, 심혈관위험지수(cardiac risk factor, CRF)(36)는 총콜레스테롤을 HDL-콜레스테롤로 나누어 구하였다.
성능/효과
- 5주 동안 비만을 유도한 후의 체중은 모든 군에서 29.6±1.6∼30.4±1.8 g이었으며 4주 동안 고지방식이와 함께 쇠비름 에탄올 추출물을 경구투여 한 후의 체중은 32.5±1.3∼33.4±1.5 g으로 쇠비름 에탄올 추출물 섭취로 인한 체중 감소효과는 나타나지 않았다.
- HFD, HFD＋POE 75 및 HFD+POE 125군의 총콜레스테롤의 함량은 각각 2.1±0.3 mg/dL, 1.4±0.2 mg/dL 및 1.4±0.3 mg/dL로 유의적으로 감소하였으며(p<0.05) 특히 저농도로 쇠비름 에탄올 추출물 경구투여에도 HFD군에 비해 33.4%의 감소를 나타내었다.
- HFD＋POE 75 및 HFD＋POE 125군의 총지질 함량은 각각 17.8±2.8 mg/dL 및 16.7±2.7 mg/dL로 HFD(21.3±2.3 mg/dL)군에 비하여 각각 16.5% 및 21.6%의 유의적 감소를 나타내었다(p<0.05).
- 마지막 4주 동안은 고지방식이에 쇠비름 에탄올 저농도투여군(HFD＋POE75) 및 쇠비름 에탄올 고농도투여군(HFD＋POE125)으로 나누어 하루에 한 번씩 경구투여 하였으며 고지방식이군(HFD)은 증류수를 투여하였다. HFD＋POE 75군 및 HFD＋POE 125군의 체중변화량은 유의적인 차이를 나타나지는 않았으나 식이효율은 HFD군에 비해 유의적으로 감소하였다. 혈중 ALT 함량은 HFD군에 비해 HFD＋POE 125군에서 유의적으로 감소하였으나 AST 함량은 그룹 간 차이를 나타내지 않았다.
- LDL-콜레스테롤은 HFD＋POE 75군과 HFD군은 차이가 나타나지 않았으나 HFD＋POE 125군은 HFD군에 비해 18.5%의 유의적인 감소를 나타내었다(p<0.05).
- 고지방식이에 의하여 증가된 AI와 CRF는 고지방식이와 고농도의 쇠비름 에탄올 추출물 경구투여로 유의적으로 감소하였다(p<0.05).
- 그러나 실험 4주 때의 HFD군은 208.0±16.4 mg/dL, HFD＋POE 75군은 171.2±11.1 mg/dL, HFD＋POE 125군은 147.1±14.2 mg/dL로 HFD군에 비해 중성지질의 함량이 각각 17.7% 및 29.3%의 유의적인 감소를 나타내었다(p<0.05).
- 또한 본 연구는 식이에 의해 비만이 유발된 질병모델에서 혈중 콜레스테롤과 중성지질의 저하효과를 나타내어 고지혈증 증세를 개선하는 효과를 나타내었다. 따라서 쇠비름 에탄올 추출물은 고지방식이를 공급받는 정상체중을 가진 동물이거나 비만 질병동물 모두에서 고지혈증을 개선하는 효과가 있는 것으로 사료된다.
- 또한 HFD＋POE 75 및 HFD＋POE 125군의 중성지방의 함량은 28.4±3.9 mg/dL 및 27.8±2.7 mg/dL로 HFD(34.7±3.8 mg/dL)군에 비하여 각각 18.2% 및 19.9%의 유의적인 감소를 나타내었다(p<0.05).
- HDL-콜레스테롤은 쇠비름 에탄올 추출물의 투여에 따른 실험군 간의 차이를 나타내지 않았다(Table 4). 본 실험결과 고지방식이로 인하여 증가된 중성지질 함량은 쇠비름 에탄올 추출물을 병행 투여함으로써 개선되어짐을 확인할 수 있었으며, 특히 30세 이상의 성인의 고지혈증 중 고콜레스테롤지방혈증의 유병률이 11.1%, 고중성지방혈증의 유병률이 17.4%로 탄수화물 과다 섭취로 인한 고지혈증 중 중성지방혈증이 문제가 되고 있는 한국 사람의 경우(3) 쇠비름 에탄올 추출물 효과는 대한민국에서 손쉽게 구할 수 있는 자원의 이용 면에서 매우 유리하다고 사료된다. Kim과 Won(33)의 연구는 정상체중의 실험동물에게 고지방식이와 쇠비름 에탄올 추출물을 25∼125 mg/kg의 농도로 공급하여 혈액의 지질성분의 변화를 살펴본 결과, 혈액의 총콜레스테롤과 중성지질을 감소시키는 효과가 있음을 보고하여 본 연구와 유사한 결과를 나타내었다.
- 4%의 감소를 나타내었다. 본 연구결과 쇠비름 에탄올 추출물은 혈중 중성지질과 간에서의 총콜레스테롤 함량이 감소하는 경향을 나타내었다. 따라서 쇠비름 에탄올 추출물은 혈중 지질을 개선함으로써 죽상경화증의 발병에 영향을 주는 고지혈증 예방에 효과적일 것으로 사료된다.
- 본 연구에서는 HFD군의 ALT 함량은 26.3±0.9 IU/L였으나 HFD＋POE 125군에서는 25.2±0.5 IU/L로 유의적으로 감소하였으나(p<0.05) AST 함량은 모든 군에서 유의적인 차이를 나타내지 않았다.
- 실험 4주 때에는 HFD군은 150.5±13.5 mg/dL, HFD＋POE 125군은 128.5±16.2 mg/dL로 HFD군에 비해 14.7%의 유의적인 감소를 나타내었다(p<0.05).
- 혈중 ALT 함량은 HFD군에 비해 HFD＋POE 125군에서 유의적으로 감소하였으나 AST 함량은 그룹 간 차이를 나타내지 않았다. 실험식이 4주 때에 혈청 중 총콜레스테롤, 중성지질 및 LDL-콜레스테롤 함량은 쇠비름 에탄올 추출물 경구투여로 유의적으로 감소하였으나 HDL-콜레스테롤 함량은 유의적 차이를 나타내지 않았다. 심순환기 질환의 위험성을 나타내는 지표로 알려진 동맥경화지수와 심혈관위험지수는 고농도의 쇠비름 에탄올 추출물 경구투여로 HFD군에 비해 유의적으로 감소하였다.
- 실험식이가 종결되는 4주 때는 심장채혈법으로 최대한 많은 혈액을 채혈하였고 원심분리 하여 분리된 혈청은 분석 전까지 -70°C에서 냉동 보관하였다.
- HFD＋POE 75군 및 HFD＋POE 125군의 체중변화량은 유의적인 차이를 나타나지는 않았으나 식이효율은 HFD군에 비해 유의적으로 감소하였다. 혈중 ALT 함량은 HFD군에 비해 HFD＋POE 125군에서 유의적으로 감소하였으나 AST 함량은 그룹 간 차이를 나타내지 않았다. 실험식이 4주 때에 혈청 중 총콜레스테롤, 중성지질 및 LDL-콜레스테롤 함량은 쇠비름 에탄올 추출물 경구투여로 유의적으로 감소하였으나 HDL-콜레스테롤 함량은 유의적 차이를 나타내지 않았다.
후속연구
- Park 등(42)은 C57BL/6J mice에게 고지방식이와 스테비아잎 물추출물을 병행 투여하여 혈중 및 간에서의 지질 저하효과를 확인 후 지질대사 관련된 PPARα, ACC, CPT-1 및 ACS mRNA 발현 수준을 확인하여 지질 저하 기전을 확인하였다. 따라서 본 연구결과 쇠비름 에탄올 추출물은 혈중 및 간장에서의 지질 저하효과를 확인하였으므로 앞으로는 지질합성 및 분해에 관련된 효소의 mRNA와 protein 발현 수준을 확인하여기전을 밝히고자 실험을 계획 중이다.
- Kim과 Won(33)은 고지방식이에 쇠비름 에탄올 추출물을 투여함으로써 동맥경화지수가 감소되었다고 보고하여 본 연구결과와 유사하였다. 따라서 심순환기 질환의 주요 위험인자인 AI 및 CRF가 감소되어진 것으로 보아 쇠비름 에탄올 추출물은 고지혈증을 감소시키는 효과가 있으므로 결국 심순환기 질환의 발병률도 감소시키는 효과도 기대할 수 있다고 사료된다.
- 심순환기 질환의 위험성을 나타내는 지표로 알려진 동맥경화지수와 심혈관위험지수는 고농도의 쇠비름 에탄올 추출물 경구투여로 HFD군에 비해 유의적으로 감소하였다. 이상의 결과 고지방식이에 쇠비름 에탄올 추출물 경구투여로 혈중 및 간장 중의 총콜레스테롤 및 LDL-콜레스테롤, 중성지질이 저하되었는데 이는 쇠비름 에탄올 추출물이 고지혈증 개선 효과가 있는 것으로 사료되나 쇠비름 에탄올 추출물의 어떤 성분에 의한 지질 저하효과를 나타내는지와 어떠한 기전에 의해 지질 저하효과를 나타내는지 보다 자세한 연구가 요구된다.
- 콜레스테롤과 중성지방 모두 투여 후 2주까지는 감소효과가 없다가 4주째에 감소하는 효과가 보이고 있는 것으로 나타나 투여 효과가 있는 critical period에 대한 확인을 위해 좀 더 세분화된 주 간격(3, 4, 5, 6주 아니면 6주의 기간 추가 등)에 대한 추가적인 연구가 필요하다고 사료된다.
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