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문제 정의
- 전통된장의 기능성 물질에 대한 연구는 주로 6개월에서 3년까지의 숙성기간을 가지고 연구하였으나 장기 숙성기간에 따른 기능성 물질의 변화에 대한 연구는 거의 이루어지지 않은 실정이다. 따라서 본 연구에서는 전통된장의 장기 숙성기간에 따른 이화학적 특성을 연구하고, 기능성 물질 특히 GABA와 isoflavone의 함량 변화를 연구함으로써 전통된장의 우수성을 규명하고자 수행하였다.
- 본 연구는 전통된장의 숙성기간에 따라 일반성분, pH, 색도, 지방산, 아미노산, γ-aminobutyric acid(GABA) 및 isoflavone의 변화에 대해 연구하였다.
제안 방법
- 5분간 원심분리한 상등액을 0.45 μm membrane filter로 여과하여 HPLC(1200 Series, Agilent Technologies)에 10 μL를 주입하여 분석하였다.
- GABA 분석은 식품공전 유리아미노산 시험법을 변형하여 사용하였다(20). 시료 10 g에 85% ethanol 200 mL를 넣어 80℃에서 균질기(tissue homogenizer AM-7, Nippon Seiki, Tokyo, Japan)를 이용하여 10,000 rpm에서 5분 동안 균질화 시킨 후 여과하여 여과액을 취한 후 남은 잔사에 85% ethanol을 가하여 균질, 여과하는 조작을 2회 반복하여 여과액을 취하였다.
- pH는 된장 10 g에 증류수 10 mL를 가하여 잘 교반한 후 pH meter(METTLER TOLEDO, Im Langacher, Switzerland)로 측정하였으며, 표면색도는 Hunter 체계를 이용한 색도측정기(CE-310, Macbeth, Minolta, Osaka, Japan)를 사용하여 측정하였다. 표준색판(L: 97.
- Carrier gas는 헬륨가스를 사용하였고, split ratio는 20:1로 하였다. 각 지방산은 동일조건에서 표준지방산(F.A.M.E. Mix C4-C24, 100 mg, Neat, Supelco, Bellefonte, PA, USA)과 retention time을 비교하여 정량하였으며 함량은 각 peak의 면적을 상대적인 백분율로 나타내었다.
- 45 μm membrane filter로 여과하여 아미노산 자동분석기(L-8800 Amino Acid Analyzer, Hitachi, Tokyo, Japan)를 이용하여 분석하였다. 그러나 함유황아미노산인 cystein(MW: 240.3)과 methionine(MW: 149.2)은 산 가수분해에 의하여 파괴되기 쉬우므로 performic acid를 가하여 산에 안정된 상태인 cysteic acid(MW: 169.2)와 methionine sulfone(MW: 181.2)으로 산화시킨 후 6 N HCl로 가수분해 한 후 아미노산 자동분석기(L-8500 Amino Acid Analyzer, Hitachi)로 분석하였다.
- 이 여액을 감압농축기를 이용하여 농축한 다음이 수용성 농축액을 diethyl ether로 3회 세척한 후 수용성 층을 진공농축한 후 0.1 N HCl을 이용하여 pH 2.2로 조절한 후 증류수를 이용하여 100 mL로 정용한 후 0.45 μm membrane filter로 여과하여 HPLC(1200 Series, Agilent Technologies)로 분석하였고, 칼럼은 ZORBOX Eclipse XDB C18(4.6 mm×150 mm, 5 um, Agilent Technologies)을 사용하였다.
- 이동상은 이동상 A(40 mM NaH2PO4, pH 7.8)와 이동상 B(acetonitrile/methanol/D.W., 45/45/10, v/v)의 비율을 100:0(1.90 min)→50:50(14.0 min)→0:100(18.0 min)→100:0(22 min)으로, 유속은 2.0 mL/min 조건으로 설정하였다.
- 이동상은 이동상 A(D.W/methanol/acetic aicd, 88/10/2, v/v)와 이동상 B(methanol/acetic acid, 98/2, v/v)의 비율을 90:10(0 min) → 60:40(32 min) → 40:60(35 min) →90:10(50 min)으로, 유속은 1.0 mL/min 조건으로 설정하였다.
- 증발건조 되어 있는 플라스크에 시료희석 완충액을 가하여 아미노산을 용해시킨 후 0.45 μm membrane filter로 여과하여 아미노산 자동분석기(L-8800 Amino Acid Analyzer, Hitachi, Tokyo, Japan)를 이용하여 분석하였다.
대상 데이터
- 6 mm×150 mm, 5 um, Agilent Technologies)을 사용하였다. 검출기는 FLD를 사용하여 여기파장이 340 nm, 형광파장은 435 nm에서 측정하였다. 이동상은 이동상 A(40 mM NaH2PO4, pH 7.
- 본 연구에 사용한 시료는 1998년부터 강원도 횡성 서원농협에서 생산한 황색 종 대두인 황금 콩(Glycine max L.)을 재료로 하여 만든 된장으로 전년도에 생산한 대두로 다음해 2월에 된장을 만들어 전통항아리에서 발효하였다. 채취한 시료는 1, 3, 5, 7 및 10년 숙성된 된장을 제공받았으며, 숙성시킨 된장과의 비교를 위한 대조군은 2009년 생산한 대두를 재료로 하여 2010년 2월에 담근 된장을 발효를 시키지 않고 사용하였다.
- 분석에 사용된 칼럼은 Intersil ODS-3(4.6 mm×250 mm, 5 um, GL science, Tokyo, Japan)이었고, UV detector를 사용하여 260 nm에서 isoflavone을 측정하였다.
- 본 연구는 전통된장의 숙성기간에 따라 일반성분, pH, 색도, 지방산, 아미노산, γ-aminobutyric acid(GABA) 및 isoflavone의 변화에 대해 연구하였다. 실험에 사용한 전통 된장은 강원도 서원 농협에서 제조한 된장으로 숙성기간이 1, 3, 5, 7 및 10년이 경과된 된장을 사용하였으며, 대조군으로는 숙성시키지 않은 된장을 사용하였다. 일반성분 중 수분의 경우 3년째까지 일시적으로 증가하였다가 그 이후에는 감소하는 경향을 나타내었으며, pH와 색도는 숙성기간이 증가함에 따라 감소하였다.
- )을 재료로 하여 만든 된장으로 전년도에 생산한 대두로 다음해 2월에 된장을 만들어 전통항아리에서 발효하였다. 채취한 시료는 1, 3, 5, 7 및 10년 숙성된 된장을 제공받았으며, 숙성시킨 된장과의 비교를 위한 대조군은 2009년 생산한 대두를 재료로 하여 2010년 2월에 담근 된장을 발효를 시키지 않고 사용하였다. 각 재료는 동결건조 시킨 후 분말로 분쇄한 뒤 -70℃에서 보관하였다.
데이터처리
- a-eValues with different superscripts within each row were significantly different at p<0.05 vs control by ANOVA with Duncan’s multiple range test.
- a-fValues with different superscripts within each row were significantly different at p<0.05 vs control by ANOVA with Duncan’s multiple range test.
- 본 실험의 결과 값은 mean±SD(standard deviation)로 나타냈으며, 실험군 간의 비교분석은 statistical analysis system(SAS)을 이용하여 ANOVA 분석 후 p<0.05에서 Tukey's studentized range(HSD) test와 Duncan’s multiple range test를 이용하여 유의성 검증을 하였다.
- 표준색판(L: 97.97, a: -0.38, b: +1.89)으로 보정한 후, L값(lightness), a값(redness) 및 b값(yellowness)을 각 3회 이상 측정하여 평균±표준편차로 표시하였다.
이론/모형
- Isoflavone 분석은 건강기능식품공전을 참조하였다(21). 시료 10 g을 달아 250 mL 삼각플라스크에 넣고 80% 메탄올 40 mL를 넣은 후 호일을 씌우고 65℃ 항온 수욕조에서 2시간 추출한다.
- 0 mL/min 조건으로 설정하였다. 시료의 유도체와를 위해서는 Agilent HPLC(Agilent Technologies)의 injection program을 사용하였다.
- 일반성분은 AOAC 법(19)에 따라 수분은 상압가열건조법, 회분은 직접 회화법, 조단백질은 semi-micro Kjeldahl법으로 측정하였으며, 조지방은 Soxhlet으로 측정하고 조섬유는 헨네베르크·스토오만개량법에 의해 측정하고 각 3회 분석하여 평균±표준편차로 표시하였다.
- 지방산은 Soxhlet법(19)으로 지방을 추출한 후 식품공전(20)을 참조하여 전처리한 후 capillary column(SP-2560, 100 m×0.2 μm×0.25 mm)을 장착한 GC(Agilent GC 7890, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)로 분석하였다.
성능/효과
- 7 mg/kg으로 대조군 시료에 비해 약 77배 증가하였다. Isoflavone 중 glycoside인 daidzin, genistin 및 glycitin은 유의적인 차이가 없었으나, aglycone 형태인 genistein과 daidzein의 경우 숙성기간이 경과될수록 증가하였다.
- 배당체 형태인 daidzin, glycitin 및 genistin은 대조군과 1, 3, 5, 7 및 10년 숙성시킨 된장에서 미량 존재하는 것으로 분석되었다. 그러나 비배당체 형태인 daidzein은 대조군에서 48.1 mg/kg이었지만 숙성기간이 증가됨에 따라 55.0, 72.4, 76.6, 96.0 그리고 10년 숙성시킨 된장에서 101.2mg/kg으로 유의적으로 증가됨을 알 수 있었다. 또한 genistein의 경우 대조군에서 42.
- 아미노산 또한 유의적인 차이는 없었으나 GABA의 전구체인 glutamic acid가 숙성기간이 증가함에 따라 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다. 대조군 시료의 경우 GABA의 함량을 분석한 결과 24.9 mg/kg이었으나, 숙성기간이 증가함에 따라 43.8, 120.6, 569.5, 930.7 그리고 10년 숙성된 된장의 경우 1,938.7 mg/kg으로 대조군 시료에 비해 약 77배 증가하였다. Isoflavone 중 glycoside인 daidzin, genistin 및 glycitin은 유의적인 차이가 없었으나, aglycone 형태인 genistein과 daidzein의 경우 숙성기간이 경과될수록 증가하였다.
- 이러한 현상은 차엽 속의 glutamic acid가 glutamate decarboxylase에 의해 탈탄산되어 GABA을 생성하는 것으로 추정되어지고 있다(27). 따라서 된장의 숙성기간에 따른 GABA 함량을 연구한 결과 숙성기간이 증가함에 따라 여러 가지 효소적 반응에 의해 GABA 함량은 증가하고, GABA의 전구체인 glutamic acid가 감소되는 것을 본 연구를 통해 확인하였다.
- 6 mg/kg으로 증가하였다. 또한 5년 숙성된 된장의 경우 569.5 mg/kg, 7년이 930.7 mg/kg 그리고 10년 숙성된 된장의 경우 1,938.7 mg/kg으로 대조군에 비해 약 77배 증가하여 숙성기간이 증가함에 따라 기능성 생리활성 물질인 GABA의 함량이 증가되었다. 이는 GABA가 다소 함유되어 있는 녹차의 GABA 생성량이 녹차엽의 아미노산 함량에 영향을 받으며, 특히 glutamic acid 함량에 비례함이 알려져 있다.
- 7%의 비율을 차지하였다. 또한 PUFA(polyunsaturated fatty acid)라 불리는 고도불포화지방산이 대조군에서 54.9%였으며, 숙성기간별로 48.1, 62.5, 62.1, 43.6 및 43.5%의 비율을 차지하였다. 고도불포화지방산 중에서는 linoleic acid가 가장 높은 비율을 차지하였다.
- 3에 그리고 그의 조성은 Table 5에 나타내었다. 배당체 형태인 daidzin, glycitin 및 genistin은 대조군과 1, 3, 5, 7 및 10년 숙성시킨 된장에서 미량 존재하는 것으로 분석되었다. 그러나 비배당체 형태인 daidzein은 대조군에서 48.
- 고도불포화지방산 중에서는 linoleic acid가 가장 높은 비율을 차지하였다. 본 연구에서 나타나듯이 전통된장 지방산 중에서 불포화지방산이 차지하는 비율이 숙성기간과 상관없이 70% 이상을 차지하였다. 시판 전통식 된장과 가정에서 제조한 전통된장의 지방상 조성을 본 결과 linoleic acid는 각각 52.
- 전통된장의 숙성기간에 따른 일반성분의 변화를 측정한 결과는 Table 1과 같다. 수분함량은 대조군의 52.8%에 비해 숙성기간에 따라 54.6, 55.8, 48.7, 49.0 및 47.8%로 숙성기간이 3년 때까지 증가하였다가 점차 감소하는 경향을 보였다. 이는 Park 등(22)이 된장의 수분함량이 담금 직후 40%대였으나 숙성 3개월 후 50%대로 증가되었다고 보고하였고, 이는 숙성과정 중 수분의 증가가 액화 amylase 등의 효소력에 의해 수용성 물질이 증가되었기 때문이라고 하였다.
- 지방산의 경우 숙성기간에 따른 유의적인 차이는 없었으나 불포화지방산의 비율이 60% 이상을 차지하였다. 아미노산 또한 유의적인 차이는 없었으나 GABA의 전구체인 glutamic acid가 숙성기간이 증가함에 따라 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다. 대조군 시료의 경우 GABA의 함량을 분석한 결과 24.
- 77로 감소하였다. 이상의 결과를 보면 전통된장의 숙성기간이 증가함에 따라 L, a, b값 모두 급격히 감소하여 대조군 시료에 비하여 색이 짙어지는 것을 알 수가 있었다. 특히, 밝기와 황색도는 숙성기간에 따른 높은 상관관계를 보여주었는데, 효소작용에 의해 생성된 유리아미노산은 효소의 분해 작용으로 생성된 유리당과 amino-carbonyl 반응을 일으켜 이 반응의 최종산물인 melanoidin을 형성하게 된다.
- 전통된장의 숙성기간에 따른 아미노산의 함량 변화를 측정한 결과는 Table 4에 나타내었다. 총 아미노산의 함량은 대조군 시료에서 28.5%로 가장 높았으며, 숙성기간이 증가할수록 아미노산의 총 함량이 감소하였다. 이는 된장이 발효 과정을 거치면서 아미노산이 분해되며 여러 가지 맛과 향미를 내는 것으로 사료된다.
- 이는 된장이 발효 과정을 거치면서 아미노산이 분해되며 여러 가지 맛과 향미를 내는 것으로 사료된다. 특히 GABA 생성의 전구체인 glutamic acid의 함량을 살펴보면 대조군 시료가 5.5%, 숙성기간이 증가함에 따라 4.2, 3.9, 3.5, 3.8 그리고 10년 숙성된장에서 3.5%로 나타났는데 대조군과 비교해봤을 때 glutamic acid의 함량이 유의적으로 감소하였다.
- 이상의 결과를 보면 전통된장의 숙성기간이 증가함에 따라 L, a, b값 모두 급격히 감소하여 대조군 시료에 비하여 색이 짙어지는 것을 알 수가 있었다. 특히, 밝기와 황색도는 숙성기간에 따른 높은 상관관계를 보여주었는데, 효소작용에 의해 생성된 유리아미노산은 효소의 분해 작용으로 생성된 유리당과 amino-carbonyl 반응을 일으켜 이 반응의 최종산물인 melanoidin을 형성하게 된다. 된장의 색이 이들 melanoidin에 의한 것으로 알려져 있으며, 이는 공기와 접촉하거나 Fe의 존재 하에서 더욱 촉진되는 것으로 알려져 있다(23).
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