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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 가공부산물인 홍게 자숙액을 고부가가치성의 천연 향미제로 개발하기 위하여 자숙액으로부터 향미소재 전구물질을 물리화학적으로 회수하여 에너지 저감화를 시도하였고 단백질 가수분해 효소를 이용하여 반응표면분석법 (Response surface methodology, RSM)으로 최적의 가수분해조건을 설정하였다.
제안 방법
- 그러나 산업적으로 적용하기에는 기질의 농도를 낮추기 위해 첨가하는 용수가 많고 가수분해시간은 장시간이기 때문에 경제성이 떨어진다고 판단되어 반경 0.0~1.0에서 능선분석(ridge analysis)을 수행하였다. 그 결과 반경 1.
- 그러나 식품에 첨가되는 향미제의 특성상 경제성뿐만이 아니라 관능적으로 소비자를 충분히 만족시킬 수 있어야 하므로 가수물에 대한 관능검사를 실시하여, 각 가수분해물의 냄새와 맛을 순위합으로 나타내었다 (Table 3). 냄새에서의 시료간의 유의적인 차이는 나타나지 않았으나 맛에서는 Alcalase® 2.
- 등전점 침전을 이용하여 Fig. 1의 방법에 따라 홍게자숙액의 침전물을 회수하였다. 즉, 다리부 (pH 8.
- 반응표면분석에서 얻어진 반응계수를 통하여 독립변수 두개간의 상관관계를 알아보기 위하여 나머지 변수를 zero level로 두고 3차원 반응표면도 나타내었다 (Fig. 3~5). Fig.
- 77%로 나타났으며, 이는 standard error를 고려했을 때 유사한 범위 수준이었다. 본 실험에서는 이점을 최대가수분해도를 나타내는 점으로 설정하였으며, 이때 조건은 반응온도 55℃, pH 7.45에서, 기질농도 21.82%, E/S비 0.50%, 가수분해시간 3.74시간이었다.
- 5, 최적온도 60℃), Flavourzyme® 500 MG와 Protamex®을 동량 혼합 (1:1, w/w)하여 사용하였다. 이때 사용한 기질은 홍게자숙액 침전물과 증류수를 동량 혼합 (1:1, w/w)한 것이었으며 E/S 비는 0.2%로 각각 1시간 간격으로 가수분해도를 측정하였다.
- 최적의 가수분해조건을 설정하기 위하여 기질의 농도 (S), 기질에 대한 효소 농도 (E/S), 가수분해 시간 (T)을 독립변수로 설정하였으며 실험영역으로는 Table 1과 같이 code화 (-2에서 +2)하였다. 이러한 독립변수들과 code를 이용하여 반응표면 실험계획을 중심합성계획에 따라 작성하였다. 즉 fractional 23 factorial design (8개), star points (6개) 및 central points (5개)로 총 19개의 실험을 무작위로 수행하였으며 종속변수는 가수 분해도 (DH, %)로 하였다.
- 이러한 독립변수들과 code를 이용하여 반응표면 실험계획을 중심합성계획에 따라 작성하였다. 즉 fractional 23 factorial design (8개), star points (6개) 및 central points (5개)로 총 19개의 실험을 무작위로 수행하였으며 종속변수는 가수 분해도 (DH, %)로 하였다. 모든 실험 결과는 SAS (Statistical Analysis System) program을 이용하여 통계분석하였으며 3차원 반응표면도를 SAS/GRAPH의 G3GRID와 G3D절차를 사용 하여 zero level에서 두 독립변수간의 상관성을 검토하였다.
- 최적의 가수분해조건을 설정하기 위하여 기질의 농도 (S), 기질에 대한 효소 농도 (E/S), 가수분해 시간 (T)을 독립변수로 설정하였으며 실험영역으로는 Table 1과 같이 code화 (-2에서 +2)하였다. 이러한 독립변수들과 code를 이용하여 반응표면 실험계획을 중심합성계획에 따라 작성하였다.
- 홍게 다리 자숙액과 몸통 자숙액을 혼합해 원심분리하고 등전점 침전을 위해 pH를 10에서 3으로 조절해서 (Fig. 1) 원심분리하였다. 침전물 I의 수율은 0.
- 홍게자숙액 침전물에 가수분해도가 높은 효소를 선정하기 위해 3종의 상업용 단백질분해효소를 이용하여 가수분해도를 측정하였다. Fig.
- 홍게자숙액 침전물의 가수분해를 위한 최적 효소를 선정하기 위해 Novozymes (Novozymes, Denmark)에서 제공하는 각 효소의 최적 조건에 따라 Flavourzyme® 500 MG (최적 pH 6.5~8.5, 최적온도 60℃), Protamex®(최적 pH 5.5~7.5, 최적온도 35~60℃), Alcalase® 2.4 L FG (최적 pH 7.5, 최적온도 60℃), Flavourzyme® 500 MG와 Protamex®을 동량 혼합 (1:1, w/w)하여 사용하였다.
- 홍게자숙액 침전물의 가수분해물을 창원대학교 식품영양학과에 재학중인 학부생 및 대학원생으로 구성된 12명의 패널에게 제공하여 맛과 냄새에 대한 순위를 1위부터 4위까지 매기는 선호도 검사를 실시하였다. 유의성 검증은 Basker(1988a, 1988b)에 의한 순위법 유의성 검정표를 이용하여 95%수준에서 실시하였다.
대상 데이터
- 또한 홍게자숙액 침전물의 가수분해물을 제조하기 위해 사용한 상업용 단백질 가수분해효소인 Flavourzyme® 500 MG, Protamex® 및 Alcalase® 2.4 L FG은 Novozymes (Novozymes, Denmark)의 제품으로, 바이오시스 (Biosis Co., Ltd., Korea)에서 제공받았다.
- 홍게 가공부산물은 경북 영덕 소재 홍게 가공업체인 세웅수산㈜에서 2010년 6월경에 다리부와 몸통부의 자숙액을 제공받아 3시간 이내에 이동하여 동결고 (-20℃)에 저장하여 두고 실험에 사용하였다. 또한 홍게자숙액 침전물의 가수분해물을 제조하기 위해 사용한 상업용 단백질 가수분해효소인 Flavourzyme® 500 MG, Protamex® 및 Alcalase® 2.
데이터처리
- 즉 fractional 23 factorial design (8개), star points (6개) 및 central points (5개)로 총 19개의 실험을 무작위로 수행하였으며 종속변수는 가수 분해도 (DH, %)로 하였다. 모든 실험 결과는 SAS (Statistical Analysis System) program을 이용하여 통계분석하였으며 3차원 반응표면도를 SAS/GRAPH의 G3GRID와 G3D절차를 사용 하여 zero level에서 두 독립변수간의 상관성을 검토하였다.
이론/모형
- 홍게 자숙액의 일반성분은 AOAC법 (AOAC, 1995)에 따라 수분은 상압가열건조법, 조단백은 semi-micro kjeldahl법, 조회분은 직접 회화법, 조지방은 soxhlet 추출법으로 분석하였다. pH는 pH meter (530-pH meter, Corning Pinnacle CO., Switzerland)를, 염도는 염도계 (TM-30D, Takernura Electric Works, Ltd., Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였으며 아미노 질소는 Formol법 (KSFSN. 2000)으로 분석하였다.
- 가수분해도 실험은 Boudrant and Cheftel (1976)의 방법을 변형한 Cha and Kim (1995)의 방법에 따라 가수분해된각 시료의 TCA 가용성 peptide를 1 N Folin & Ciocalteu's phenol 용액 (Sigma Co., St Louis MO, USA)으로 발색시킨 후 578 nm에서 UV/Visible spectrophotometer (Shimadzu, Tokyo, Japan)로 흡광도를 측정하였으며 대조구와의 차이를 표준곡선에서 tyrosine (μg/mL, 30℃)함량으로 환산하였다.
- 홍게자숙액 침전물의 가수분해물을 창원대학교 식품영양학과에 재학중인 학부생 및 대학원생으로 구성된 12명의 패널에게 제공하여 맛과 냄새에 대한 순위를 1위부터 4위까지 매기는 선호도 검사를 실시하였다. 유의성 검증은 Basker(1988a, 1988b)에 의한 순위법 유의성 검정표를 이용하여 95%수준에서 실시하였다.
- 홍게 자숙액의 일반성분은 AOAC법 (AOAC, 1995)에 따라 수분은 상압가열건조법, 조단백은 semi-micro kjeldahl법, 조회분은 직접 회화법, 조지방은 soxhlet 추출법으로 분석하였다. pH는 pH meter (530-pH meter, Corning Pinnacle CO.
성능/효과
- 가격대비 가수분해도가 가장 높은 Alcalase® 2.4 L FG이 경제성 측면에서 가장 우수 한 것으로 나타났고 다음으로 Flavourzyme® 500 MG와 Protamex®(1:1, w/w), Protamex® 및 Flavourzyme® 500 MG 순이었다.
- 가수분해도는 35.56~62.04%의 범위로 측정되었으며, 그 결과 전체적인 모형이 유의성 (P<0.05)을 보였고 결정계수 (R2)는 0.9342로 나타났다 (Table 5).
- 0에서 능선분석(ridge analysis)을 수행하였다. 그 결과 반경 1.0의 점에서 61.90%의 가수분해도가 예측되었고 실제 이 조건으로 실험한 실측치는 58.77%로 나타났으며, 이는 standard error를 고려했을 때 유사한 범위 수준이었다. 본 실험에서는 이점을 최대가수분해도를 나타내는 점으로 설정하였으며, 이때 조건은 반응온도 55℃, pH 7.
- 2와 같이 반응 3시간까지 모든 효소들의 가수 분해도가 증가하였고 이후로는 일정수준이었다. 대조구인 홍게자숙액 침전물 자체의 자가소화효소에 의한 가수분해 효과는 5.29%에서 반응 2시간에는 14.64%까지 증가하였는데, Cha and Kim (1995)의 키조개 부산물에서 3%미만의 가수분해도를 보인 것에 비해서는 다소 높은 것으로 나타났다. 반응 3시간 째의 가수분해도는 Alcalase® 2.
- 따라서 향미제의 관능적인 우수함을 우선으로 생각하여 Alcalase® 2.4 L FG보다는 A/C값이 낮으나 맛 부문에서 우수한 결과를 나타낸 Flavourzyme® 500 MG와 Protamex®의 혼합사용을 최적의 효소로 선정하였다.
- 반응 3시간 째의 가수분해도는 Alcalase® 2.4 L FG은 60.69%, Flavourzyme® 500 MG 와 Protamex®(1:1, w/w)의 혼합사용시 57.09%, Protamex®는 55.18%, Flavourzyme® 500 MG는 52.85% 순으로 나타났다.
- 4의 기질 농도와 E/S비의 관계에서는 기질 농도가 낮고 E/S비가 높아질수록 가수분해도가 증가하는 것으로 나타났다. 예측된 반응표면에서는 E/S비가 0.4~0.6%이고 기질농도가 10~20%일 때 53.9% 이상의 가수분해도를 나타내었다.
- 042ω32 로 세 고유값 (eigenvalues)들의 부호가 모두 음수로 나타났으므로 정상점은 최대점이며 가수 분해도는 가수분해시간, E/S비, 기질의 농도 순으로 민감하게 영향을 받는 것으로 나타났다. 이러한 결과로부터 최대의 가수분해도를 얻기 위한 조건은 기질 농도 15.96%, E/S비 0.58%, 가수분해시간은 4.52시간으로 나타났다.
- 한편 위의 반응모형식을 정준형식으로 변환하면 ŷ=71.388- 1.658ω12-7.280ω22-9.042ω32 로 세 고유값 (eigenvalues)들의 부호가 모두 음수로 나타났으므로 정상점은 최대점이며 가수 분해도는 가수분해시간, E/S비, 기질의 농도 순으로 민감하게 영향을 받는 것으로 나타났다.
- 홍게자숙액의 이화학적 성분은 Table 2와 같이 다리자숙액의 수분은 95.96%, 조단백질은 2.91%, 조회분 및 조지방은 각각 2.64%와 0.29%였고 pH는 8.74, 염도는 2.83%였으며 아미노질소는 69.94 mg%였다. 반면 몸통자숙액의 염도는 1.
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