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문제 정의
- Decursinol angelate에 관한 약리활성은 많이 보고되어 있지만 식물병을 일으키는 병원균에 대한 in vivo 항균활성에 대한 보고는 아직 없다. 따라서 decursinol angelate의 밀 붉은녹병에 대한 살균 활성은 본 연구에서 처음으로 보고하는 것이다.
- 따라서 decursinol angelate와 이를 포함한 당귀 추출물을 이용할 경우 밀 붉은녹병을 방제할 수 있는 새로운 살균제의 개발이 가능하리라 생각된다. 본 논문에서 decursinol angelate에 의한 밀 붉은녹병 방제 효과를 처음 보고하는 바이다.
제안 방법
- , Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다. NMR spectrum은 Bruker AMZ-500(500 MHz) NMR spectrometer(Bruker Analytische Messtechnik Gmbh, Rheinstetten, Germany)로 측정하였고, tetramethylsilane(TMS)를 internal standard로 이용하였다.
- n-Hexane 추출물은 acetone으로 용해하였고, 다른 용매 추출물들은 MeOH에 용해한 다음 250 µg/ml Tween 20 용액에 현탁한 후 식물체에 분무하여 접종 1일전 예방효과를 조사하였다.
- 이때 대조구는 5% MeOH 또는 10% acetone과 250 µg/ml의 Tween 20을 함유하는 증류수를 사용하였다. 각 식물병당 3개의 포트를 이용하였고, 활성성분 시료를 엽면에 분무 살포한 후 24시간 동안 풍건한 다음 각각의 식물 병원균을 접종하였다. 접종 3일 내지 8일 후에 병반면적율을 조사하였다(Kim 등, 2001; Choi 등, 2001).
- 각각의 실험은 3반복으로 실시하였고, 이로부터 얻은 병반면적율을 이용하여 다음과 같은 식에 따라 방제가를 계산하였다.
- In vivo 항균활성 검정. 당귀 MeOH 추출물, 유기용매 분획물 및 수화제에 대해서는 밀 붉은녹병(P. recondita)에 대하여 in vivo 항균활성을 조사하였고, 분리한 항균물질에 대하여는 항균활성 스펙트럼을 조사하기 위하여 밀 붉은녹병을 포함하여 벼 잎집무늬마름병(Rhizoctonia solani), 토마토 잿빛곰팡이병(Botrytis cinerea), 토마토 역병(Phytophthora infestans), 보리 흰가루병(Blumeria graminis f. sp. hordei) 및 고추 탄저병(Colletotrichum coccodes) 등총 6가지 식물병에 대한 in vivo 항균활성을 조사하였다. MeOH 추출물, EtOAc 분획물, BuOH 분획물 및 분리한 항균 물질은 MeOH(최종농도, 5%)로, n-hexane 분획물은 acetone(최종농도, 10%)으로, 그리고 물분획물과 수화제는 증류수로 용해 또는 희석한 후 계면활성제 Tween 20을 250 µg/ml 수준으로 포함하는 증류수에 희석하였다.
- 당귀 MeOH 추출물로부터 분리한 decursinol angelate의 in vivo 항균활성을 밀 붉은녹병을 포함하여 6가지 식물병에 대하여 방제활성 실험을 수행하였다. Decursinol angelate는 밀 붉은녹병에 대해 200 µg/ml과 400 µg/ml 수준에서 각각 43%와 73%의 방제활성을 나타냈으며, 고추 탄저병에 대해 80%와 86%로 높은 방제활성을 보였다(Table 1).
- 따라서 당귀 MeOH 추출물로부터 밀 붉은녹병에 대하여 항균활성을 갖는 물질의 분리를 시도하였다. 당귀 MeOH 추출물을 n-hexane, EtOAc 및 n-BuOH을 이용하여 단계적으로 용매 분획하여 밀 붉은녹병에 대하여 in vivo 항균활성 검정을 실시하였다. 그 결과 얻은 n-hexane 분획물 및 EtOAc 분획물이 1,000 µg/ml의 수준에서 각각 80%와 87%로 밀 붉은녹병에 대하여 높은 방제효과를 보였다(Fig.
- 당귀 조추출물의 제형. 당귀 조추출물의 항균활성을 확인하기 위하여 건조된 당귀 300 g을 최적 추출 용매로 선정된 EtOAc로 2회 추출하였다. 얻어진 추출물을 감압농축하였고, 당귀 EtOAc 추출물(2 g)을 Choi 등(2009)의 방법에 따라 수화제(Wettable powder, WP)로 제조하였다.
- 본 실험실의 선행연구를 통해 당귀 MeOH 추출물이 밀 붉은녹병에 대해서 80% 이상의 방제효과를 확인하였다(유 등, 2001). 따라서 당귀 MeOH 추출물로부터 밀 붉은녹병에 대하여 항균활성을 갖는 물질의 분리를 시도하였다. 당귀 MeOH 추출물을 n-hexane, EtOAc 및 n-BuOH을 이용하여 단계적으로 용매 분획하여 밀 붉은녹병에 대하여 in vivo 항균활성 검정을 실시하였다.
- 1). 따라서 밀 붉은녹병에 대하여 활성을 보이는 물질은 n-hexane과 EtOAc 분획물에 존재하는 것으로 나타나 두 분획물로부터 항균활성 물질의 분리 정제를 시도하였다. 활성 분획물을 silica gel column chromatography, alumina column chromatography와 preparative HPLC를 통하여 화합물 1을 순수하게 분리하였다.
- 밀 붉은녹병 방제에 활성이 뛰어난 당귀의 최적추출 용매를 선정하기 위하여 n-hexane, MC, EtOAc와 acetone로 추출한 후 방제활성을 확인하였다. 그 결과, Fig.
- 본 연구에서는 한약재로부터 항균 물질을 탐색하는 과정에서, 당귀 메탄올 추출물이 Puccinia recondita에 의해 발생하는 밀 붉은녹병에 대하여 우수한 방제효과를 나타내는 것을 확인하였다. 밀 붉은녹병에 대하여 활성을 보이는 한 개의 항균물질을 silica gel chromatography, alumina column chromatography와 C18 preparative HPLC를 통해 분리, 정제하였다. 분리한 항균물질은 EI-MS와 1H-NMR의 기기분석 결과 decursinol angelate로 동정되었다.
- 본 연구실에서는 당귀(Angelica gigas Nakai)의 methanol (MeOH) 추출물을 이용하여 in vivo 항균활성 실험을 실시하였다. 그 결과 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 역병 및 밀 붉은녹병에 대하여 방제 효과를 보이는 것을 확인하였고, 그 중 벼 도열병에 대해 높은 활성이 나타났다.
- 본 연구에서는 선행연구를 통해 당귀 MeOH 추출물을 이용하여 벼 도열병 다음으로 활성이 우수했던 밀 붉은녹병에 대해 항균활성을 가지는 물질을 분리, 정제하고 얻어진 물질을 이용하여 식물병원균에 대한 in vivo 항균활성 실험을 실시하였다.
- 기기분석. 분리한 물질의 구조를 동정하기 위하여 질량분석 및 핵자기공명분석을 실시하였다. 질량분석은 doublefocusing high-resolution(HR) mass spectrometer(JEOL JMS-DX303; JEOL Ltd.
- 이로부터 활성물질을 분리하기 위하여 용출용매 n-hexane:EtOAc(8:2-1:1, v/v)로 silica gel column chromatography(Kiesel gel 60, 70-230 mesh, 3.6 cm i.d.×80 cm; E. Merck, Darmstadt, Germany)를 실시하였다.
- 이 질량스펙트럼은 decursinol angelate와 일치하는 것으로 나타났다. 이물질의 정확한 구조 동정을 위하여 1H-NMR 스펙트럼을 얻었다. 화합물 1의 EI-MS와 1H-NMR spectrum을 Ryu 등(1990)이 보고한 decursinol angelate의 데이터와 비교한 결과 일치하는 것으로 나타남에 따라 분리한 항균물질은 decursinol angelate로 동정되었다.
- 분리한 물질의 구조를 동정하기 위하여 질량분석 및 핵자기공명분석을 실시하였다. 질량분석은 doublefocusing high-resolution(HR) mass spectrometer(JEOL JMS-DX303; JEOL Ltd., Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다. NMR spectrum은 Bruker AMZ-500(500 MHz) NMR spectrometer(Bruker Analytische Messtechnik Gmbh, Rheinstetten, Germany)로 측정하였고, tetramethylsilane(TMS)를 internal standard로 이용하였다.
- 활성 분획물을 silica gel column chromatography, alumina column chromatography와 preparative HPLC를 통하여 화합물 1을 순수하게 분리하였다. 화합물 1의 구조 결정을 위하여 질량분석 및 핵자기공명분석을 실시하였다. 화합물 1은 흰색 결정체로 electron impact(EI) mode를 이용하여 질량분석을 실시한 결과 분자이온(M+)이 m/z 328에서 나타났고, 주요 fragment ion은 m/z 228, 213(base peak), 83, 55였다.
- Merck)에 가한 다음, methylene chloride(MC)로 용출하여 총 5개의 분획을 얻을 수 있었다. 활성 물질을 순수하게 정제하기 위하여 preparative HPLC를 이용하였다. 이때 preparative HPLC 조건은 다음과 같다; column: Capcell Pak C18(20×250 mm), 용출용매: 0.
- 따라서 밀 붉은녹병에 대하여 활성을 보이는 물질은 n-hexane과 EtOAc 분획물에 존재하는 것으로 나타나 두 분획물로부터 항균활성 물질의 분리 정제를 시도하였다. 활성 분획물을 silica gel column chromatography, alumina column chromatography와 preparative HPLC를 통하여 화합물 1을 순수하게 분리하였다. 화합물 1의 구조 결정을 위하여 질량분석 및 핵자기공명분석을 실시하였다.
- 활성 분획물을 다시 alumina column(Neutral 90, 70-230 mesh, 2 cm i.d.×40 cm; E. Merck)에 가한 다음, methylene chloride(MC)로 용출하여 총 5개의 분획을 얻을 수 있었다.
대상 데이터
- 대조약제로 벼 잎집무늬마름병은 validamycin(50과 5 µg/ml; Dr. Ehrenstorfer GmbH, Augsburg, Germany), 토마토 잿빛곰팡이병은 fludioxonil(50과 5 µg/ml; Dr. Ehrenstorfer GmbH), 토마토 역병은 dimethomorph(10과 2 µg/ml; Dr. Ehrenstorfer GmbH), 밀 붉은녹병은 flusilazole(10과 2 µg/ml; Dr. Ehrenstorfer GmbH), 보리 흰가루병은 benomyl(100과 1 µg/ml; Dr. Ehrenstorfer GmbH) 및 고추 탄저병은 dithianon(50과 10 µg/ml; Dr. Ehrenstorfer GmbH)을 사용하였다.
- 실험재료. 본 실험에 사용한 시료는 2009년 12월, 대구광역시 소재의 한약방에서 구입하여 실험에 사용하였으며, voucher specimen은 한국화학연구원에 보관되어 있다.
데이터처리
- The lower case letters indicate values that are not significantly different (P=0.05) from other values in their own column with the same letter, according to Duncan's multiple range test.
- 각 항목에 따라 백분율과 평균치±표준편차(SD)로 표시하였고, 통계적 유의성 검정은 일원배치 분산분석(one-way analysis of variance)을 한 후 F 값을 구하고 Duncan's multiple range test(P=0.05)를 이용하여 대조군과 각 구간의 유의성 차이를 검증하였다.
- 통계처리. 모든 자료의 처리는 PROC GLM procedure(SAS institute, Cary, NC)를 사용하여 처리하였다. 각 항목에 따라 백분율과 평균치±표준편차(SD)로 표시하였고, 통계적 유의성 검정은 일원배치 분산분석(one-way analysis of variance)을 한 후 F 값을 구하고 Duncan's multiple range test(P=0.
이론/모형
- 당귀 조추출물의 항균활성을 확인하기 위하여 건조된 당귀 300 g을 최적 추출 용매로 선정된 EtOAc로 2회 추출하였다. 얻어진 추출물을 감압농축하였고, 당귀 EtOAc 추출물(2 g)을 Choi 등(2009)의 방법에 따라 수화제(Wettable powder, WP)로 제조하였다.
성능/효과
- Decursinol angelate는 밀 붉은녹병에 대해 200 µg/ml과 400 µg/ml 수준에서 각각 43%와 73%의 방제활성을 나타냈으며, 고추 탄저병에 대해 80%와 86%로 높은 방제활성을 보였다(Table 1).
- 3과 같이 당귀 EtOAc 추출물이 밀 붉은녹병에 대해서 방제효과가 가장 뛰어났고, 다른 용매들 보다 추출물의 양이 많았기 때문에 EtOAc를 선택하였다. EtOAc 추출물을 이용하여 농민들이 사용할 수 있는 제제인 수화제를 제조하여 밀 붉은녹병에 대해 250배, 500배, 1,000배로 희석배수를 달리하여 처리한 결과, 각각 83%, 67% 및 60%의 방제효과를 보였다(Fig. 4).
- 6 g을 얻었다. In vivo 항균활성 검정을 통하여 n-hexane과 EtOAc 분획물이 항균활성을 나타내는 것을 확인하였고, 두 분획물을 합쳐서 감압 농축하였다. 이로부터 활성물질을 분리하기 위하여 용출용매 n-hexane:EtOAc(8:2-1:1, v/v)로 silica gel column chromatography(Kiesel gel 60, 70-230 mesh, 3.
- 본 연구실에서는 당귀(Angelica gigas Nakai)의 methanol (MeOH) 추출물을 이용하여 in vivo 항균활성 실험을 실시하였다. 그 결과 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 역병 및 밀 붉은녹병에 대하여 방제 효과를 보이는 것을 확인하였고, 그 중 벼 도열병에 대해 높은 활성이 나타났다. 벼 도열병에 대해 활성을 나타내는 물질을 분리하기 위해 solvent partitioning과 column chromatography를 통하여 decursin의 항균물질을 분리하였고, 이 물질은 in vivo 실험에서 벼 도열병에 대하여 항균활성이 높은 것으로 나타났다.
- 그 결과 얻은 n-hexane 분획물 및 EtOAc 분획물이 1,000 µg/ml의 수준에서 각각 80%와 87%로 밀 붉은녹병에 대하여 높은 방제효과를 보였다(Fig. 1).
- 밀 붉은녹병 방제에 활성이 뛰어난 당귀의 최적추출 용매를 선정하기 위하여 n-hexane, MC, EtOAc와 acetone로 추출한 후 방제활성을 확인하였다. 그 결과, Fig. 3과 같이 당귀 EtOAc 추출물이 밀 붉은녹병에 대해서 방제효과가 가장 뛰어났고, 다른 용매들 보다 추출물의 양이 많았기 때문에 EtOAc를 선택하였다. EtOAc 추출물을 이용하여 농민들이 사용할 수 있는 제제인 수화제를 제조하여 밀 붉은녹병에 대해 250배, 500배, 1,000배로 희석배수를 달리하여 처리한 결과, 각각 83%, 67% 및 60%의 방제효과를 보였다(Fig.
- 이 물질은 시험한 6개의 식물병 중에서 밀 붉은녹병과 고추 탄저병에 대하여 우수한 항균활성을 보였다. 또한, 당귀의 에틸아세테이트 추출물의 수화제도 밀 붉은녹병에 대해 우수한 항균활성이 보였다. 따라서 decursinol angelate와 이를 포함한 당귀 추출물을 이용할 경우 밀 붉은녹병을 방제할 수 있는 새로운 살균제의 개발이 가능하리라 생각된다.
- 그 결과 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 역병 및 밀 붉은녹병에 대하여 방제 효과를 보이는 것을 확인하였고, 그 중 벼 도열병에 대해 높은 활성이 나타났다. 벼 도열병에 대해 활성을 나타내는 물질을 분리하기 위해 solvent partitioning과 column chromatography를 통하여 decursin의 항균물질을 분리하였고, 이 물질은 in vivo 실험에서 벼 도열병에 대하여 항균활성이 높은 것으로 나타났다. 반면, 밀 붉은녹병에 대한 항균활성은 500 µg/ml 수준에서도 전혀 방제활성을 나타내지 않았으며 이외 식물병에 대해서도 방제활성이 미약한 것으로 확인되었다(유 등, 2001).
- 따라서 이들을 방제하기 위하여 효과적이고 환경친화적인 살균제의 개발이 절실하다. 본 연구에서는 한약재로부터 항균 물질을 탐색하는 과정에서, 당귀 메탄올 추출물이 Puccinia recondita에 의해 발생하는 밀 붉은녹병에 대하여 우수한 방제효과를 나타내는 것을 확인하였다. 밀 붉은녹병에 대하여 활성을 보이는 한 개의 항균물질을 silica gel chromatography, alumina column chromatography와 C18 preparative HPLC를 통해 분리, 정제하였다.
- 밀 붉은녹병에 대하여 활성을 보이는 한 개의 항균물질을 silica gel chromatography, alumina column chromatography와 C18 preparative HPLC를 통해 분리, 정제하였다. 분리한 항균물질은 EI-MS와 1H-NMR의 기기분석 결과 decursinol angelate로 동정되었다. 이 물질은 시험한 6개의 식물병 중에서 밀 붉은녹병과 고추 탄저병에 대하여 우수한 항균활성을 보였다.
- Decursinol angelate는 밀 붉은녹병에 대해 200 µg/ml과 400 µg/ml 수준에서 각각 43%와 73%의 방제활성을 나타냈으며, 고추 탄저병에 대해 80%와 86%로 높은 방제활성을 보였다(Table 1). 이 결과는 Fig. 2에서 나타낸 것과 같이 병원균만 접종된 무처리구는 고추 탄저병의 전형적인 병징을 나타낸 반면, decursinol angelate를 처리한 후 병원균을 접종한 실험군은 decursinol angelate의 처리농도에 병징이 현저히 감소하였으며, 처리한 식물체에 약해를 나타내지 않음을 확인하였다.
- 반면, 밀 붉은녹병에 대한 항균활성은 500 µg/ml 수준에서도 전혀 방제활성을 나타내지 않았으며 이외 식물병에 대해서도 방제활성이 미약한 것으로 확인되었다(유 등, 2001). 이 결과는 당귀 MeOH 추출물에 함유되어 있는 벼 도열병 방제물질은 decursin이며, 이외 다른 식물 병원균에 항균활성을 가지는 물질은 decursin이 아닌 다른 항균물질이 함유되어 있음을 나타내었다.
- 분리한 항균물질은 EI-MS와 1H-NMR의 기기분석 결과 decursinol angelate로 동정되었다. 이 물질은 시험한 6개의 식물병 중에서 밀 붉은녹병과 고추 탄저병에 대하여 우수한 항균활성을 보였다. 또한, 당귀의 에틸아세테이트 추출물의 수화제도 밀 붉은녹병에 대해 우수한 항균활성이 보였다.
- 이물질의 정확한 구조 동정을 위하여 1H-NMR 스펙트럼을 얻었다. 화합물 1의 EI-MS와 1H-NMR spectrum을 Ryu 등(1990)이 보고한 decursinol angelate의 데이터와 비교한 결과 일치하는 것으로 나타남에 따라 분리한 항균물질은 decursinol angelate로 동정되었다.
후속연구
- 또한, 당귀의 에틸아세테이트 추출물의 수화제도 밀 붉은녹병에 대해 우수한 항균활성이 보였다. 따라서 decursinol angelate와 이를 포함한 당귀 추출물을 이용할 경우 밀 붉은녹병을 방제할 수 있는 새로운 살균제의 개발이 가능하리라 생각된다. 본 논문에서 decursinol angelate에 의한 밀 붉은녹병 방제 효과를 처음 보고하는 바이다.
- 또한 당귀에 함유되어 있는 decursinol angelate의 약리 효과는 꾸준히 보고되고 있는 실정이다. 따라서 decursinol angelate을 포함하고 있는 당귀 추출물은 인체에 무해하면서도 친환경적으로 밀 붉은녹병, 들깨 녹병, 잔디 녹병 등의 녹병을 방제하는데 크게 기여할 것으로 예상된다. 추후 제품으로 개발하기 위해서는 추출물의 가격에 대한 평가, 최적 제제 개발, 포장에서의 다양한 식물병에 대한 약효 검점 및 안전성시험 등이 진행되어야 한다.
- 그러나 유 등(2001)에 의해서 보고된 바에 의하면 decursin은 밀 붉은녹병에 대해서 전혀 방제효과를 나타내지 않았다. 따라서 이 결과를 바탕으로 밀 붉은녹병을 방제하는데 decursinol angelate의 angeloylic acid기와 밀접한 관계가 있을 것이라고 생각된다. 이러한 구조적인 활성 차이는 Lee(2003a)에 의한 보고에서도 in vivo 실험에서 decursin과 decursinol angelate를 처리한 후 종양 크기를 측정한 결과 각각 40.
- 따라서 decursinol angelate을 포함하고 있는 당귀 추출물은 인체에 무해하면서도 친환경적으로 밀 붉은녹병, 들깨 녹병, 잔디 녹병 등의 녹병을 방제하는데 크게 기여할 것으로 예상된다. 추후 제품으로 개발하기 위해서는 추출물의 가격에 대한 평가, 최적 제제 개발, 포장에서의 다양한 식물병에 대한 약효 검점 및 안전성시험 등이 진행되어야 한다.
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