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문제 정의
- 본 연구에서는 사람과 유사한 대형 동물인 돼지의 신장을 이용하여 탈세포화 기법으로 바이오 스캐폴드를 생산하였고, 이후 몇 가지 분석을 통하여 바이오 장기로서의 가능성을 확인해 보았다. 하지만 이후 추가적인 연구를 통하여 임상적 활용도에 대한 정밀 검증이 이루어져야 할 것이다.
- 원숭이는 사람과 가장 가깝긴 하나 사육이 어렵고, 심한 윤리적 문제를 수반하는 반면, 돼지는 가축으로서 다루기 쉬울 뿐 아니라, 이미 형질전환 등의 기술력을 바탕으로 유전자 분석이 많이 진행되어있어 상대적으로 연구가 용이하며, 사람과 유사한 구조적, 생리적 특성을 갖고 있는 장점이 있다(5). 본 연구에서는 사람의 신장 크기와 유사한 돼지의 신장을 이용하여 바이오 스캐폴드를 제작하여 바이오 장기로서의 가능성을 검토하고자 하였다.
- 따라서 본 연구에서는 사람에서 이식대기자 수가 가장 많은 신장을 대상으로 사람과 크기, 생리적, 구조적으로 유사한 동물인 돼지를 활용하여 탈세포화(decellularization) 기법으로 신장 바이오 스캐폴드를 생산하였다. 이후 탈세포화 정도와 혈관구조의 형태학적 분석을 통하여 바이오 인공장기로서의 가능성을 검토하고자 하였다.
제안 방법
- 신장 적출 술은 남 등의 방법에 준하여 실시하였다(1). 돼지를 앙와위로 보정하고, 복부를 정중 절개 하여 신장이 충분히 노출 되도록 하였다. 신동맥과 신정맥을 분리, 절제한 후 신장을 적출 하였다.
- 돼지의 신장에서 탈세포화 기법으로 바이오 스캐폴드를 생산하고 탈세포화 정도와 혈관구조의 형태학적 분석을 통하여 바이오 생체장기로서의 가능성을 검토한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 또한 영상의 폭을 넓게 얻기 위하여 trapezoidal 기능을 활용하였으며 바이오 스캐폴드 제작 전의 정상 신장(native kidney)과 바이오 스캐폴드를 동시에 비교·관찰 할 때는 동일 조건을 유지하기 위하여 dual B-mode를 활용하였다.
- 멸균 증류수에 희석한 1% SDS 용액을 연동식 펌프를 이용하여 신동맥에 설치된 튜브로 관류 하였다. 관류 속도는 평균 약 100 ml/min으로 유지하였으며 너무 낮거나 높은 압력으로 인하여 신장의 형태가 변형되지 않도록 관류압을 조절하면서 외관상 흰 색상을 보일 때까지 충분히 관류 하였다.
- 시료는 제작된 바이오 스캐폴드와 정상 돼지의 신장 조직 20 mg을 사용하였고 DNA 추출은 일반적인 방법으로 제조사의 프로토콜에 따라 시행하였으며(Qiazen, DNeasy blood & tissue kit, Cat. No 69504), 분광광도계(Beckman coulter DU730)로 정량 하였다.
- 돼지를 앙와위로 보정하고, 복부를 정중 절개 하여 신장이 충분히 노출 되도록 하였다. 신동맥과 신정맥을 분리, 절제한 후 신장을 적출 하였다. 신장 적출 이후 신동맥에 실리콘 튜브를 설치하여 저온 UW-solution으로 혈액을 충분히 세척하였다.
- ). 신장 적출 술을 위해 tiletamine과zolazepam의 합제(Zoletil50, Virbac)를 3 mg/kg 용량으로 근육주사 하고, propofol 을(Provive 1%, Myungmoon pharm. Co., LTD.) 2~4 mg/kg 용량으로 귀 정맥에 주사하여 유도 마취를 하였고, 2% isoflurane (I-Fran liquid, Hana pharm Co., LTD) 으로 흡입 마취하여 시술기간 동안 마취를 유지하였다. 혈액 응고 방지를 위해 술 전에 heparin (Heparin sodium, JW Pharmaceutical)을 350 IU/kg의 용량으로 귀 정맥에 투여 하였다.
- 제작된 신장 바이오 스캐폴드의 혈관 온전성 평가를 위하여 X선 투시검사를 실시하였다. 예비 실험을 통하여 신장의 모든 혈관이 가장 잘 시각화되는 조영제의 적정양인 4 ml를 사용하였고, 이후 신정맥으로 유출된 조영제로 인해 정확한 영상의 판독이 방해되는 것을 방지하기 위하여 조영제 주입전 신정맥을 일시적으로 결찰 하였다. 조영제 주입시 공기 유입이 되지 않도록 주의하면서 신동맥에 연결된 실리콘 튜브에 iohexol (Omnipaque® 350, GE Healthcare)을 천천히 주입하며 실시간으로 조영제의 흐름 양상을 관찰 하였다.
- 75 mm 그리고 초당 15 mm의 table 이동 속도의 조건으로 시행하였다. 이 후 얻어진 CT 미가공 데이터(raw data) 영상을 3차원 재구성 프로그램(Rapidia, Infinitt, Korea)을 이용하여 3차원 최대강도투사(Maximum Intensity Projection, MIP) 영상으로 재구성 하였다.
- 제작된 bioscaffold의 신동맥에 조영제(Iopromide, Ultravist 370INJ, Bayer Korea) 4 ml를 주입 후 얻은 컴퓨터단층촬영 (CT) 검사는 다중검출기 컴퓨터단층촬영기(Lightspeed Plus, GE healthcare, USA)에서 관전압120 kVp, 관전류 180 mAs, pitch 0.75, 절편두께 3.75 mm 그리고 초당 15 mm의 table 이동 속도의 조건으로 시행하였다. 이 후 얻어진 CT 미가공 데이터(raw data) 영상을 3차원 재구성 프로그램(Rapidia, Infinitt, Korea)을 이용하여 3차원 최대강도투사(Maximum Intensity Projection, MIP) 영상으로 재구성 하였다.
- 제작된 바이오 스캐폴드의 구조 및 에코 변화 관찰을 위하여 초음파 검사를 시행 하였다. 초음파검사 장비는 HD11XE(Philips Co.
- 제작된 신장 바이오 스캐폴드의 혈관 온전성 평가를 위하여 X선 투시검사를 실시하였다. 예비 실험을 통하여 신장의 모든 혈관이 가장 잘 시각화되는 조영제의 적정양인 4 ml를 사용하였고, 이후 신정맥으로 유출된 조영제로 인해 정확한 영상의 판독이 방해되는 것을 방지하기 위하여 조영제 주입전 신정맥을 일시적으로 결찰 하였다.
- 조영제 주입시 공기 유입이 되지 않도록 주의하면서 신동맥에 연결된 실리콘 튜브에 iohexol (Omnipaque® 350, GE Healthcare)을 천천히 주입하며 실시간으로 조영제의 흐름 양상을 관찰 하였다.
- 탈세포화 이후, 제작된 바이오 스캐폴드에 남아있는 핵 및 세포 내용물의 양을 측정하기 위하여 정상 장기와 바이오 스캐폴드 조직에서 DNA 양을 측정 하였다. 정상 신장의 DNA 양은 373.
- 핵 및 세포 내용물의 제거 정도를 평가하기 위하여 DNA를 추출한 후 정량하였다. 시료는 제작된 바이오 스캐폴드와 정상 돼지의 신장 조직 20 mg을 사용하였고 DNA 추출은 일반적인 방법으로 제조사의 프로토콜에 따라 시행하였으며(Qiazen, DNeasy blood & tissue kit, Cat.
- , LTD) 으로 흡입 마취하여 시술기간 동안 마취를 유지하였다. 혈액 응고 방지를 위해 술 전에 heparin (Heparin sodium, JW Pharmaceutical)을 350 IU/kg의 용량으로 귀 정맥에 투여 하였다. 신장 적출 술은 남 등의 방법에 준하여 실시하였다(1).
대상 데이터
- 기존의 연구에서 바이오 스캐폴드 제작을 위하여 SDS, Trypsin/EDTA, Triton-X 등 다양한 종류의 탈세포화 용액이 사용되어왔다. 본 연구에서는 현재까지 보고에서 가장 보편적으로 사용되어온 SDS용액을 사용하였다(6,10). 몇몇 연구에서 탈세포화 용액의 조성에 따라 바이오 스캐폴드의 구조 및 성분 차이 등을 보고한 예가 있기는 하나, 최선의 방법에 대해서는 아직 연구가 부족하며 논란의 여지가 있다(21).
- 실험동물은 체중 38-42 kg인 4개월령 Landrace종 돼지 4마리를 사용하였다(Orient bio INC.). 신장 적출 술을 위해 tiletamine과zolazepam의 합제(Zoletil50, Virbac)를 3 mg/kg 용량으로 근육주사 하고, propofol 을(Provive 1%, Myungmoon pharm.
이론/모형
- 신장 적출 이후 신동맥에 실리콘 튜브를 설치하여 저온 UW-solution으로 혈액을 충분히 세척하였다. 동물의 사육과 실험은 강원대학교 동물실험 지침에 따라 수행되었다.
- 그러나 바이오 스캐폴드를 활용한 장기 재생 연구는 아직까지 랫드 등의 실험동물 수준에서의 보고가 대부분일 뿐 돼지 등 대동물을 이용한 연구는 미미한 실정이다(16). 따라서 본 연구에서는 사람에서 이식대기자 수가 가장 많은 신장을 대상으로 사람과 크기, 생리적, 구조적으로 유사한 동물인 돼지를 활용하여 탈세포화(decellularization) 기법으로 신장 바이오 스캐폴드를 생산하였다. 이후 탈세포화 정도와 혈관구조의 형태학적 분석을 통하여 바이오 인공장기로서의 가능성을 검토하고자 하였다.
- 현재까지 혈관의 보존성을 증명하기 위하여 X-선 투시검사, 미세 컴퓨터 단층촬영(micro CT), 부식성 캐스트(corrosion cast) 등이 이용되고 있다(11,14). 부식성 캐스트의 경우 입체적으로 혈관을 잘 시각화 시킬 수 있는 반면, 고 위험성 물질이라 다루기가 용이하지 않은 반면 X-ray 투시검사는 조영제가 혈관을 따라 흘러 들어가는 모습을 통해 실시간으로 신동맥 및 정맥의 평가가 가능하고, 컴퓨터 단층 촬영 역시 신장의 혈관을 입체적으로 시각화 시킬 수 있을 뿐만 아니라 상대적으로 안전성이 높아 선행 연구에서 사용되어왔으며 본 연구에서도 이들 방법을 활용하였다(11). 본 연구에서 제작된 바이오 스캐폴드는 결과적으로 주요 동맥과 정맥의 조영상이 확인되어 모세혈관을 통한 동정맥의 연속성이 잘 유지된 것으로 판단되었다.
- 혈액 응고 방지를 위해 술 전에 heparin (Heparin sodium, JW Pharmaceutical)을 350 IU/kg의 용량으로 귀 정맥에 투여 하였다. 신장 적출 술은 남 등의 방법에 준하여 실시하였다(1). 돼지를 앙와위로 보정하고, 복부를 정중 절개 하여 신장이 충분히 노출 되도록 하였다.
- China)를 사용하였다. 초음파검사 기법은 분리된 검체의 전체를 영상화시킬 수 있으면서 공기에 의한 간섭을 최소화할 수 있는 수조 초음파 검사법(water bath scanning)을 이용하였다.
성능/효과
- 둘째, 신장의 수질, 피질 등 형태학적 구조가 보존되어 바이오 스캐폴드의 지지구조가 유지되었다.
- 정상 신장과 비교하였을 때, 신장 바이오 스캐폴드의 수질과 피질부에서 에코성이 감소된 것이 관찰되었으며 특히 수질부분에서의 에코감소가 현저하게 관찰 할 수 있었다(Fig 2C, D). 또한 신장실질조직의 에코성 저하에 따라 신장의 혈관이 더욱 뚜렷하게 고에코성으로 관찰되었다(Fig 2E, F). 이러한 초음파 영상적 특징은 신장실질의 세포 물질 감소와 혈관계의 온전한 보전에 기인한 것으로 사료 된다.
- 이러한 초음파 영상적 특징은 신장실질의 세포 물질 감소와 혈관계의 온전한 보전에 기인한 것으로 사료 된다. 또한 전자 주사 현미경(Low-Vacuum Scanning Electron Microscope, S-3500N, Hitachi)을 통해 관찰 하였을 때, 사구체가 보존된 것을 확인 할 수 있었다(Fig 3).
- 부식성 캐스트의 경우 입체적으로 혈관을 잘 시각화 시킬 수 있는 반면, 고 위험성 물질이라 다루기가 용이하지 않은 반면 X-ray 투시검사는 조영제가 혈관을 따라 흘러 들어가는 모습을 통해 실시간으로 신동맥 및 정맥의 평가가 가능하고, 컴퓨터 단층 촬영 역시 신장의 혈관을 입체적으로 시각화 시킬 수 있을 뿐만 아니라 상대적으로 안전성이 높아 선행 연구에서 사용되어왔으며 본 연구에서도 이들 방법을 활용하였다(11). 본 연구에서 제작된 바이오 스캐폴드는 결과적으로 주요 동맥과 정맥의 조영상이 확인되어 모세혈관을 통한 동정맥의 연속성이 잘 유지된 것으로 판단되었다.
- 바이오 생체 장기로서 갖추어야 할 중요한 또 하나의 요소로서 장기의 지지구조 및 미세구조 보존을 들 수 있다. 본 연구에서 제작한 바이오 스캐폴드는 절단면의 육안적 소견과 초음파 검사상 피질, 수질을 비롯한 대부분의 구조가 정상 신장과 유사하게 보존되었으며, 주사 전자 현미경을 통하여 사구체 구조가 관찰 되었다. 하지만 이외에도 신장의 기능을 담당하는 네프론 등의 미세구조와 관련하여 추가적인 연구가 필요하다.
- 초음파 검사 상에서 돼지 신장 바이오 스캐폴드가 정상과 유사한 양상으로 피질과 수질이 분명하게 구분 되는 것을 확인 하였으며(Fig 2A, B), 신우와 요관의 구조 역시 온전히 보존 된 것을 확인 할 수 있었다(Fig 2C, D). 정상 신장과 비교하였을 때, 신장 바이오 스캐폴드의 수질과 피질부에서 에코성이 감소된 것이 관찰되었으며 특히 수질부분에서의 에코감소가 현저하게 관찰 할 수 있었다(Fig 2C, D). 또한 신장실질조직의 에코성 저하에 따라 신장의 혈관이 더욱 뚜렷하게 고에코성으로 관찰되었다(Fig 2E, F).
- 정상 신장의 DNA 양은 373.48 ± 34.41 μg/ml에서 탈세포화 과정 이후, 0.42 ± 0.29 μg/ml로 감소되었고, 세포의 잔존률이 정상에 비해 0.11%로 대부분의 세포성분이 제거된 것을 확인 하였다(Table 1).
- 제작한 바이오 스캐폴드의 혈관구조의 온전성을 평가하기 위하여 X선 투시검사를 시행 한 결과 바이오 스캐폴드내 신동맥과 신정맥의 연속성이 확인되었다(Fig 4A, B, C). 조영제가 신동맥을 따라 흘러 들어가서 미세 혈관구조를 따라 신장 전체로 분포 된 후 신정맥을 통해 배출되는 모습이 관찰되었다.
- 첫째, 본 연구의 돼지 신장 바이오 스캐폴드는 DNA가 완전히 제거되어 이식면역의 주조직적합 항원인 세포성 항원이 제어되었다.
- 초음파 검사 상에서 돼지 신장 바이오 스캐폴드가 정상과 유사한 양상으로 피질과 수질이 분명하게 구분 되는 것을 확인 하였으며(Fig 2A, B), 신우와 요관의 구조 역시 온전히 보존 된 것을 확인 할 수 있었다(Fig 2C, D). 정상 신장과 비교하였을 때, 신장 바이오 스캐폴드의 수질과 피질부에서 에코성이 감소된 것이 관찰되었으며 특히 수질부분에서의 에코감소가 현저하게 관찰 할 수 있었다(Fig 2C, D).
- 연동식 펌프를 이용해 1% SDS용액을 관류시키는 방법으로 만들어진 돼지 신장 바이오 스캐폴드는 정상과 비교하여 육안적으로 신장의 외형이 그대로 유지되었으며, 관류 12시간 후 신장은 외견상 완전히 탈색되어 더 이상의 탈색은 관찰되지 않았다(Fig 1A, B). 탈색 후 스캐폴드의 절단면을 관찰한 결과 피질, 수질을 비롯한 모든 신장구조가 분명하게 관찰 되었고, 정상과 유사하게 보존된 육안적 소견을 보였다(Fig 1C, D).
후속연구
- 물론 탈세포화로 인한 세포성 항원은 제거되었으나 바이오 스캐폴드의 골격을 구성하는 세포 외 기질의 단백질 구조에 대한 이식항원이 존재할 가능성도 고려해 보아야 한다(21). 급성거부반응의 주요 면역항원들 에 비하면 매우 미미하기는 하나 세포 외 기질의 이종항원 가능성과 관련한 추가 연구가 진행될 필요가 있다.
- 몇몇 연구에서 탈세포화 용액의 조성에 따라 바이오 스캐폴드의 구조 및 성분 차이 등을 보고한 예가 있기는 하나, 최선의 방법에 대해서는 아직 연구가 부족하며 논란의 여지가 있다(21). 따라서 각 장기 별, 크기 별 최적의 탈세포화를 위한 용액의 조성, 기법, 시간 등에 관련한 추가 연구가 이루어져야 할 것으로 사료된다.
- 위의 결론을 종합하면, 본 연구의 돼지 바이오 스캐폴드는 바이오 장기로서의 가능성이 있다고 판단되며, 향후 세포의 생착, 분화에 중요한 인자인 세포 외 기질 등의 성분 분석 및 재세포화에 관련한 종합적인 연구를 통하여 실제 바이오 장기로서의 가능성에 대한 세밀한 분석이 추가로 진행되어야 할 것으로 사료된다.
- 세포 외 기질의 보존은 세포의 주입과 관련된 최적의 세포 생존 및 분화 환경을 조성한다는 관점에서 매우 중요하다(14,16). 이러한 성분들은 다양한 면역염색과 분자생물학적 분석을 통하여 이루어지며 기능적 평가 측면에서 본 연구에 이어 추가로 진행되어야 할 것이다.
- 장기에 주입되는 탈세포화 용액의 관류 속도 또한 각 장기의 구조 및 혈관 보존 등에 중요한 역할을 할 것으로 생각된다. 랫드의 신장을 이용한 Ross 등의 선행연구에서 관류 속도는 랫드의 평균 신장 혈압인 90-120 mmHg와 유사한 100 mmHg로 유지하였으나(12), Wainwright 등의 돼지의 심장을 이용한 연구에서는 돼지의 평균 심장 박출량의 1/2~1/4 수준인 1~1.
- 본 연구에서 제작한 바이오 스캐폴드는 절단면의 육안적 소견과 초음파 검사상 피질, 수질을 비롯한 대부분의 구조가 정상 신장과 유사하게 보존되었으며, 주사 전자 현미경을 통하여 사구체 구조가 관찰 되었다. 하지만 이외에도 신장의 기능을 담당하는 네프론 등의 미세구조와 관련하여 추가적인 연구가 필요하다.
- 본 연구에서는 사람과 유사한 대형 동물인 돼지의 신장을 이용하여 탈세포화 기법으로 바이오 스캐폴드를 생산하였고, 이후 몇 가지 분석을 통하여 바이오 장기로서의 가능성을 확인해 보았다. 하지만 이후 추가적인 연구를 통하여 임상적 활용도에 대한 정밀 검증이 이루어져야 할 것이다.
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