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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는, 향후 한의학에서 많이 이용되고 있는 독활을 활용한 대장암의 항암치료에 대한 기초자료를 제공하기 위해 대장암세포에 대한 항암활성과 그 기전을 구명하고자 하였다.
제안 방법
- cells로 24 시간 배양한 후, RAc-E70를 농도별로 24 시간 동안 처리하였다. 24 시간 후 각 well에 MTT (1 ㎎/㎖) 용액 50 ㎕씩 첨가하여 2 시간 동안 다시 배양시킨후, well 바닥에 형성된 formazan이 흩어지지 않게 상등액을 제거하고 DMSO를 100 ㎕ 첨가하여 천천히 녹인 후 UV/Visible spectrophotometer (Xma-3000PC, Human Corporation Co., Seoul, Korea)를 이용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- GSK3β 의존성 cyclin D1 단백질 분해는 cyclin D1의 Thr286의 인산화와 밀접한 관련이 있다고 알려져 있기 때문에(Alao, 2007), RAc-E70의 cyclin D1 Thr286 인산화와 LiCl에 의한 GSK3β 억제의 RAc-E70 유도 cyclin D1 Thr286 인산화에 대한 영향을 평가하였다.
- HA-tagged wild type cyclin D1 construct의 transient transfection은 PolyJet DNA transfection reagent (SignaGen Laboratories, Rockville, MD, USA)를 이용하여 수행되었다. 6 well plate에 배양된 HCT116 세포에 1㎍ construct와 PolyJet DNA transfection reagent가 희석된 plasmid mixture를 처리하여 24 시간 동안 배양시켜 실험에 사용하였다.
- RAc-E70에 의해 유도되는 cyclin D1 단백질 수준 감소가 cyclin D1의 전사조절에 기인한 것인지 확인하기 위해 RAc-E70이 처리된 HCT116과 SW480 세포에서 RT-PCR을 이용하여 cyclin D1 mRNA 발현을 확인하였다. 그 결과, RAc-E70은 25 ㎍/㎖에서는 HCT116 세포의 cyclin D1 mRNA 발현변화가 없었으나, 50 ㎍/㎖ 농도에서는 감소 되었다 (Fig.
- Total RNA 추출은 RAc-E70이 처리된 HCT116과 SW480 세포로부터 RNeasy Mini kit (QIAGEN GmbH., Hilden, Germany)를 이용하여 수행되었고, cDNA는 1㎍의 total RNA를 Verso cDNA kit (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)를 이용하여 제조되었다. PCR은 PCR master mix kit (Promega Co.
- 05% tween-20이 포함된 tris-buffered saline (TBS-T)로 5 분간 3 회 세척하였다. 그 후 2 차 항체는 5% non-fat dry milk에 용해시켜 membrane에 상온에서 1 시간 처리하였고, TBS-T로 5 분간 3회 세척 후 membrane은 ECL western blotting substrate (Amersham Biosciences Co., Little Chalfont, England)를 이용하여 단백질을 확인하였다.
- 그리하여 RAc-E70에 의해 유도되는 cyclin D1 단백질 분해와 관련된 kinase를 규명하기 위해, HCT116 세포에 ERK1/2 억제제인 PD98059, p38 억제제인 SB203580 그리고 GSK3β 억제제인 LiCl를 각각 2 시간 동안 전처리 후, RAc-E70을 6 시간 동안 처리하고 western blot을 이용하여 cyclin D1 단백질 수준을 확인하였다.
- , 2015). 그리하여, RAc-E70이 cyclin D1 단백질 수준을 감소시키는지 확인하기 위해, RAc-E70이 처리된 HCT116과 SW480 세포에서 western blot을 이용하여 cyclin D1 단백질을 확인하였다. 그 결과 RAc-E70은 유의적으로 HCT116과 SW480에서 cyclin D1 단백질의 수준을 감소시켰다 (Fig.
- 대장암 세포인 HCT116과 SW480을 96 well plate에서well 당 1×105 cells로 24 시간 배양한 후, RAc-E70를 농도별로 24 시간 동안 처리하였다.
- 독활 [Aralia cordata var. continentalis (Kitagawa) Y.C.Chu]의 70% 에탄올 추출물 (RAc-E70)을 이용하여 대장암 세포주인 HCT116과 SW480 세포생육 억제활성을 측정하기 위해 MTT assay를 수행하였다. RAc-E70은 HCT116과 SW480세포의 생육을 유의적으로 각각 25 ㎍/㎖에서 16.
- , 1997). 따라서 RAc-E70이 cyclin D1 단백질 분해를 유도하는지 확인하기 위해, HCT116 세포에 단백질 분해효소 억제제인 MG132를 2 시간 전처리하고 50 ㎍/㎖ 농도의 RAc-E70을 6 시간 동안처리 후 western blot을 이용하여 cyclin D1 단백질을 확인하였다. 그 결과, MG132가 처리된 세포에서는 RAc-E70에 의해 유도되는 cyclin D1 단백질의 감소가 억제되었다 (Fig.
- 파쇄된 독활 10 g에 70% 에탄올 200 ㎖을 첨가하여 상온에서 교반하면서 48 시간 동안 추출하였다. 추출 후 filter paper (No. 2, Whatman Co., Maidstone, England)로 여과, 40℃ 이하의 중탕에서 감압 환류 냉각장치 (N-1110S, EYELA, Tokyo, Japan)로 농축, 그리고 동결건조를 실시하였다. 모든 시료는 실험 전까지 –80℃ 냉동 보관하였으며, 추출물은 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 용해하여 실험에 사용하였다.
대상 데이터
- 그리고 western blot 분석을 위한 항체인 cyclin D1, phospho-cyclin D1 (Thr286), HA-tag 및 β-actin은 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구매되었다.
- 대장암 세포의 배양을 위해 사용된 배지인 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)/F-12 1 : 1 modified medium (DMEM/F-12)는 Lonza (Morristown, NJ, USA)에서 구매하였다.
- 본 연구에서 사용된 대장암 세포주인 HCT116과 SW480은 한국세포주은행에서 구매되었고, 세포는 10% fatal bovine serum (FBS), 100 U/㎖ penicillin and 100 ㎍/㎖ streptomycin이 포함된 DMEM/F-12 배지로 37℃에서 5% CO2 하에서 유지하였다. 시료처리를 위해 독활의 70% 에탄올 추출물 (RAc-E70)은 DMSO로 용해하였고, 대조구는 DMSO를 0.
- 본 연구에서 사용된 한약재 시료인 독활 [Aralia cordata var. continentalis (Kitagawa) Y.C.Chu]은 경상북도 경산시에 위치한 한약재 전문회사인 휴먼허브에서 구매되었고, 추가적으로 안동대학교 생약자원학과 구진숙 교수에 의해 동정되었다.
- 하에서 유지하였다. 시료처리를 위해 독활의 70% 에탄올 추출물 (RAc-E70)은 DMSO로 용해하였고, 대조구는 DMSO를 0.1%를 초과하지 않는 범위에서 사용하였다. 대장암세포인 HCT116과 SW480의 증식억제는 MTT assay로 측정하였다.
- 대장암 세포의 배양을 위해 사용된 배지인 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)/F-12 1 : 1 modified medium (DMEM/F-12)는 Lonza (Morristown, NJ, USA)에서 구매하였다. 특이적 효소 억제제인 PD98059, SB203580, LiCl 및 MG132와 대장암 세포의 생육억제효능을 평가하기 위한 3-(4,5-dimethylthizaol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)사에서 구매하였다. 그리고 western blot 분석을 위한 항체인 cyclin D1, phospho-cyclin D1 (Thr286), HA-tag 및 β-actin은 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구매되었다.
데이터처리
- 모든 결과는 3 회 반복 측정 후 평균 ± 표준편차로 나타내었고, 처리간 유의성은 Student’s t-test로 검증하여 p-value 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판정하였다(Microsoft Exel 2010, Microsoft, Redmond, WA, USA).
이론/모형
- (A), (B); HCT116 and SW480 cells were plated overnight and then treated with RAc-E70 at the indicated concentrations for 24 hours. Cell growth was measured using MTT assay. *p < 0.
- 1%를 초과하지 않는 범위에서 사용하였다. 대장암세포인 HCT116과 SW480의 증식억제는 MTT assay로 측정하였다.
성능/효과
- 그리하여, RAc-E70이 cyclin D1 단백질 수준을 감소시키는지 확인하기 위해, RAc-E70이 처리된 HCT116과 SW480 세포에서 western blot을 이용하여 cyclin D1 단백질을 확인하였다. 그 결과 RAc-E70은 유의적으로 HCT116과 SW480에서 cyclin D1 단백질의 수준을 감소시켰다 (Fig. 1C). 또한 RAc-E70은 처리 후 3 시간부터 cyclin D1 단백질 수준을 감소시켰다 (Fig.
- 따라서 RAc-E70이 cyclin D1 단백질 분해를 유도하는지 확인하기 위해, HCT116 세포에 단백질 분해효소 억제제인 MG132를 2 시간 전처리하고 50 ㎍/㎖ 농도의 RAc-E70을 6 시간 동안처리 후 western blot을 이용하여 cyclin D1 단백질을 확인하였다. 그 결과, MG132가 처리된 세포에서는 RAc-E70에 의해 유도되는 cyclin D1 단백질의 감소가 억제되었다 (Fig. 2B). 또한, RAc-E70에 의해 유도되는 cyclin D1 단백질 분해를 재 증명하기 위해, HCT116세포에 HA-tagged wild type cyclin D1 construct를 transfection하고 RAc-E70을 처리한 결과, RAc-E70은 HA-cyclin D1의 수준을 감소시켰다 (Fig.
- 그리하여 RAc-E70에 의해 유도되는 cyclin D1 단백질 분해와 관련된 kinase를 규명하기 위해, HCT116 세포에 ERK1/2 억제제인 PD98059, p38 억제제인 SB203580 그리고 GSK3β 억제제인 LiCl를 각각 2 시간 동안 전처리 후, RAc-E70을 6 시간 동안 처리하고 western blot을 이용하여 cyclin D1 단백질 수준을 확인하였다. 그 결과, PD98059와 SB203580이 처리된 HCT116 세포에서는 RAc-E70에 의해 유도되는 cyclin D1 단백질의 수준감소가 나타났으나 (Fig. 3A, B), LiCl이 처리된 HCT116 세포에서는 RAc-E70에 의해 유도되는 cyclin D1 단백질의 수준감소가 억제되었다 (Fig. 3C). 본 결과는 RAc-E70에 의해 유도되는 cyclin D1 단백질 분해는 GSK3β 의존성이라는 것을 의미한다.
- RAc-E70에 의해 유도되는 cyclin D1 단백질 수준 감소가 cyclin D1의 전사조절에 기인한 것인지 확인하기 위해 RAc-E70이 처리된 HCT116과 SW480 세포에서 RT-PCR을 이용하여 cyclin D1 mRNA 발현을 확인하였다. 그 결과, RAc-E70은 25 ㎍/㎖에서는 HCT116 세포의 cyclin D1 mRNA 발현변화가 없었으나, 50 ㎍/㎖ 농도에서는 감소 되었다 (Fig. 2A). 그러나 SW480 세포에서는 RAc-E70에 의해 유도되는cyclin D1 mRNA 발현감소가 나타나지 않았다 (Fig.
- 그 결과, RAc-E70은 처리 1 시간에 cyclin D1의 Thr286을 인산화 시켰고 (Fig. 3D), LiCl에 의한 GSK3β 억제는 RAc-E70 유도 cyclin D1의 Thr286 인산화를 억제하였다 (Fig. 3E).
- 2B). 또한, RAc-E70에 의해 유도되는 cyclin D1 단백질 분해를 재 증명하기 위해, HCT116세포에 HA-tagged wild type cyclin D1 construct를 transfection하고 RAc-E70을 처리한 결과, RAc-E70은 HA-cyclin D1의 수준을 감소시켰다 (Fig. 2C). 본 결과로 RAc-E70에 유도되는 cyclin D1 단백질의 수준감소는 cyclin D1 단백질 분해에 기인하는 것으로 판단된다.
- 본 결과는 RAc-E70에 의해 유도되는 cyclin D1 단백질 분해는 GSK3β 의존성이라는 것을 의미한다.
- 2A). 본 결과는 RAc-E70에 의해 유도되는 cyclin D1 단백질 수준 감소는 단백질 분해에 기인하는 것으로 판단된다.
- 본 결과는 RAc-E70유도 cyclin D1 단백질의 분해는 GSK3β 의존성 cyclin D1 Thr286의 인산화와 밀접한 관련이 있다는 것을 의미한다.
- 2C). 본 결과로 RAc-E70에 유도되는 cyclin D1 단백질의 수준감소는 cyclin D1 단백질 분해에 기인하는 것으로 판단된다.
- 이상의 연구 결과로 미루어 볼 때, 독활 에탄올 추출물은 GSK3β 의존성 cyclin D1 Thr286의 인산화를 유도하여 cyclin D1 단백질의 분해를 유도하고, 이것은 대장암세포의 생육억제와 관련이 있는 것으로 판단된다.
후속연구
- 이상의 연구 결과로 미루어 볼 때, 독활 에탄올 추출물은 GSK3β 의존성 cyclin D1 Thr286의 인산화를 유도하여 cyclin D1 단백질의 분해를 유도하고, 이것은 대장암세포의 생육억제와 관련이 있는 것으로 판단된다. 또한, 본 결과는 항암을 위한 대체보완의학 소재로 독활의 활용이 가능할 것으로 판단된다.
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