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문제 정의
- 본 연구는, 강력한 항산화 물질로 알려져 있는 성분인 quercetin을 함유하고 있는 이질풀을 추출하여 항산화 활성 및 세포 내 ROS 생성 저해능을 확인하고, 피부 임상 자극 평가를 통하여 피부 안전성을 확인하여 항노화 화장품 소재로서 적용 가능성을 보고자 한다.
- 본 연구에서는 신규 천연 화장품 소재 개발을 위하여 이질풀 추출물(Geranium nepalense subsp. thunbergii Extracts)을 이용하여 항산화 효능 여부 및 화장품 소재로서의 응용 가능성에 대한 연구를 하였다. 이질풀은 항산화 성분인 quercetin을 비롯하여 tannin, (-)epicatechin, kaempferitin, kaepferol-7-rhamnoside, brevifolin, corilagin, pyrogallol, ellagitannin, geraniin, gallic acid, succinic acid, quercetin, protocatechuic acid 등 다양한 생리활성 성분을 전초에 포함하고 있으며, 전국 각지에 분포하고 있어 손쉽게 얻을 수 있다는 장점을 가지고 있다.
제안 방법
- 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 정량은 Mosmann[14]의 방법을 변형하여 실시하였다. 실험에 사용된 세포로는 HaCaT을 이용하였다.
- HaCaT세포에 이질풀 추출물을 농도별로 처리한 후, 농도 증가에 따른 세포 생존율에 미치는 영향을 측정하였다. 그 결과, 최고 시료 처리 농도인 100 µg/mL까지 처리하였을 때에도 세포 독성은 보이지 않았고, 따라서 이질풀 추출물의 세포 독성은 없거나 미미하다고 사료된다(Figure 1).
- 양성 대조군으로는 quercetin을 사용하였다. Quercetin의 독성 여부를 판단하기 위하여 일차적으로 MTT assay 법을 이용하여 세포 독성 평가를 수행하였고(Figure 3), 시험 농도를 결정하여 ROS 생성 저해능 평가를 수행하였다. 평가 결과, 이질풀 추출물과 quercetin 모두 농도 의존적인 ROS 생성 저해능을 확인할 수 있었다.
- 이때 대조군으로는 추출물 대신 메탄올을 사용하였다. 실험군과 대조군에 대한 흡광을 측정 후, DPPH 라디칼 소거 효능을 환산하여 그 결과를 나타내었다.
- 이질풀 추출물에 대한 자유 라디칼 소거능을 DPPH 방법을 변형하여 측정하였다[15]. 간단히 기술하면, 이질풀 추출물 및 양성 대조군인 quercetin을 24-well plate의 각 well에 500 uL씩 넣은 후, 메탄올에 0.
- 이질풀 추출물을 사람의 피부 각질 형성 세포인 HaCaT에 농도별로 처리하여 세포 독성 여부를 확인하였으며, 시험 농도 내(10 ~100 µg/mL)에서 이질풀 추출물은 세포 독성을 나타내지 않았다.
- 이질풀 추출물의 피부 자극 유발 여부를 평가하기 위하여 인체 첩포 시험(Human patch test)을 통하여 인체에 대한 1차 자극 시험을 수행하였다.
- 이질풀의 세포 내 ROS 생성 저해능을 측정하기 위하여 DCFH-DA를 이용한 형광법을 이용하였으며, 형광 물질의 발생 강도를 ELISA reader를 이용하여 측정하였다. 양성 대조군으로는 quercetin을 사용하였다.
- 이질풀 추출물을 사람의 피부 각질 형성 세포인 HaCaT에 농도별로 처리하여 세포 독성 여부를 확인하였으며, 시험 농도 내(10 ~100 µg/mL)에서 이질풀 추출물은 세포 독성을 나타내지 않았다. 항산화 효능을 확인하기 위하여 이질풀 추출물에 대한 자유 라디칼 소거능을 DPPH 방법을 변형하여 측정하였다. 시험군과 대조군에 대한 흡광을 측정한 후 DPPH 라디칼 소거 효능을 환산한 결과, 대조군인 quercetin과 비교하여 우수한 DPPH 라디칼 소거 활성을 확인할 수 있었다.
대상 데이터
- 건강한 성인 남녀 20명을 대상으로 CTFA 가이드라인(The Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association. Inc. Washington, D.C., 20036, 1991)에 따라 실시하였다. Finn chamber에 1 mg/mL의 농도로 희석된 시료 20 µL를 적하시킨 후, 이를 시험 부위인 인체의 팔 한쪽에 첩포하고 테이프로 고정시켰다.
- 세포배양을 위해 Dulbecco's modified Egale's medium (DMEM), Fetal bovine serum (FBS), antibiotics (penicillin 100 unit/mL, streptomycin 100 unit/mL)은 HyCloneⓇ (Thermo, USA)에서 구입하여 실험에 사용하였다.
- 실험에 사용된 세포는 HaCaT을 사용하였으며, 10 % FBS, penicillin (100 unit/mL), Strptomycin (100 unit/mL)이 첨가된 DMEM 배지로 5 % CO2, 37℃에서 배양하였다.
- 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 정량은 Mosmann[14]의 방법을 변형하여 실시하였다. 실험에 사용된 세포로는 HaCaT을 이용하였다. HaCaT을 1 × 105 cells/well의 농도로 준비한 96-well plate에 이질풀 추출물을 농도 별로 투여하여 CO2 배양기에서 24 h 동안 배양하였다.
- 실험에 사용한 시약은 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH, Sigma, USA), 3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2-tetrazolium bromide (MTT, Sigma, USA)을 사용하였다. 실험에 사용된 세포주는 HaCaT (Human keratinocyte)을 미국 세포주은행(American Type culture collection: ATCC, USA)에서 분양 받아 사용하였다. 세포배양을 위해 Dulbecco's modified Egale's medium (DMEM), Fetal bovine serum (FBS), antibiotics (penicillin 100 unit/mL, streptomycin 100 unit/mL)은 HyCloneⓇ (Thermo, USA)에서 구입하여 실험에 사용하였다.
- 실험에 사용한 시약은 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH, Sigma, USA), 3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2-tetrazolium bromide (MTT, Sigma, USA)을 사용하였다. 실험에 사용된 세포주는 HaCaT (Human keratinocyte)을 미국 세포주은행(American Type culture collection: ATCC, USA)에서 분양 받아 사용하였다.
- 이질풀의 세포 내 ROS 생성 저해능을 측정하기 위하여 DCFH-DA를 이용한 형광법을 이용하였으며, 형광 물질의 발생 강도를 ELISA reader를 이용하여 측정하였다. 양성 대조군으로는 quercetin을 사용하였다. Quercetin의 독성 여부를 판단하기 위하여 일차적으로 MTT assay 법을 이용하여 세포 독성 평가를 수행하였고(Figure 3), 시험 농도를 결정하여 ROS 생성 저해능 평가를 수행하였다.
- 세포배양을 위해 Dulbecco's modified Egale's medium (DMEM), Fetal bovine serum (FBS), antibiotics (penicillin 100 unit/mL, streptomycin 100 unit/mL)은 HyCloneⓇ (Thermo, USA)에서 구입하여 실험에 사용하였다. 피부 자극 실험을 위하여 Finn Chamber (Alpharma AS, Norway)를 사용하였고, EILSA reader는 PerkinElmer사의 VICTOR3Ⓡ를 사용하였다. 형광발현을 위한 2',7'-dichlorfluorescein-diacetate (DCFH-DA)는 Invitrogen사의 Molecular ProbesⓇ를 사용하였다.
- 형광발현을 위한 2',7'-dichlorfluorescein-diacetate (DCFH-DA)는 Invitrogen사의 Molecular ProbesⓇ를 사용하였다.
이론/모형
- 05 %로 측정되었다. 또한, 이질풀 추출물의 세포 내 ROS 생성 저해능을 확인하기 위하여, DCFH-DA를 이용한 형광법을 이용하였다. HaCaT 세포에 이질풀 추출물을 처리하여 세포 내 ROS 생성 저해능을 측정한 결과, IC50값은 이질풀 추출물과 quercetin에서 각각 43.
- 세포 내에 생성되는 ROS의 생성 저해능을 평가하는 방법으로 DCFH-DA에 의한 형광법을 이용하였다. 간단히 기술하면, ROS의 생성은 DCF를 이용한 형광물질 발생의 강도를 가지고 측정하며, reduced 또는 acetylated된 형태의 DCF은 세포 내에 있는 esterase와 세포 내에 생성되는 ROS들의 산화작용에 의해 아세테이트 그룹이 제거되면 형광물질(fluorescein isothiocyanate , FITC)을 방출하는 원리를 이용한다.
성능/효과
- 100 µg/mL 이상의 농도를 처리하였을 때 시험군과 대조군 모두 우수한 DPPH 라디칼 소거능을 확인할 수 있었다(Figure 2).
- HaCaT 세포에 이질풀 추출물을 처리하여 세포 내 ROS 생성 저해능을 측정한 결과, IC50값은 이질풀 추출물과 quercetin에서 각각 43.22, 102.35 µg/mL로 측정되어 이질풀 추출물의 우수한 항산화 효능을 확인할 수 있었다.
- 그 결과, 최고 시료 처리 농도인 100 µg/mL까지 처리하였을 때에도 세포 독성은 보이지 않았고, 따라서 이질풀 추출물의 세포 독성은 없거나 미미하다고 사료된다(Figure 1).
- 동일 농도(50 µg/mL)를 처리하였을 때 이질풀 추출물의 DPPH 라디칼 소거능은 약 98.33 %로 측정되었으며, quercetin의 경우 78.05 %로 측정되었다.
- 35 µg/mL로 측정되어 이질풀 추출물의 우수한 항산화 효능을 확인할 수 있었다. 또한 피부 임상 자극 평가를 통하여 이질풀 추출물이 피부에 자극을 유발시키지 않는 안전한 소재임을 확인하였다. 이상의 결과로서 이질풀 추출물은 항산화 효능에 있어서 우수한 효능을 나타냄을 확인하였으며, 따라서 항산화 및 항노화의 기능성 화장품 소재로서의 적용이 가능할 것으로 사료된다.
- 항산화 효능을 확인하기 위하여 이질풀 추출물에 대한 자유 라디칼 소거능을 DPPH 방법을 변형하여 측정하였다. 시험군과 대조군에 대한 흡광을 측정한 후 DPPH 라디칼 소거 효능을 환산한 결과, 대조군인 quercetin과 비교하여 우수한 DPPH 라디칼 소거 활성을 확인할 수 있었다. 동일 농도(50 µg/mL)를 처리하였을 때 이질풀 추출물의 DPPH 라디칼 소거능은 약 98.
- 시험군과 대조군을 비교하여 보면, 시험 농도 내(10 ~ 100 µg/mL)에서 이질풀 추출물이 양성 대조군인 quercetin 보다 우수한 ROS 생성 저해능을 나타내었다.
- 이질풀 추출물을 50 µg/mL의 농도로 처리하였을 때, 98.33 %의 DPPH 라디칼 소거능을 나타내었고, 양성 대조군인 quercetin의 경우 동일 농도 처리 시 78.05 %의 DPPH 라디칼 소거능을 나타내었다.
- Quercetin의 독성 여부를 판단하기 위하여 일차적으로 MTT assay 법을 이용하여 세포 독성 평가를 수행하였고(Figure 3), 시험 농도를 결정하여 ROS 생성 저해능 평가를 수행하였다. 평가 결과, 이질풀 추출물과 quercetin 모두 농도 의존적인 ROS 생성 저해능을 확인할 수 있었다. 시험군과 대조군을 비교하여 보면, 시험 농도 내(10 ~ 100 µg/mL)에서 이질풀 추출물이 양성 대조군인 quercetin 보다 우수한 ROS 생성 저해능을 나타내었다.
- 피부 질환 및 기타 질환을 나타내지 않은 건강한 성인 남녀 20명을 대상으로 인체에 대한 피부 자극 시험을 평가한결과, patch를 첩포하지 않은 부위와 비교하여 이질풀 추출물을 처리한 부위에 자극이 유발되지 않았으며 피부에 적용하기에 안전한 소재임을 확인할 수 있었다(Table 1). 이는 이질풀 추출물이 피부에 직접적으로 도포되는 화장품 소재로 적용하기에 안전한 소재일 것으로 판단된다.
후속연구
- 또한 피부 임상 자극 평가를 통하여 이질풀 추출물이 피부에 자극을 유발시키지 않는 안전한 소재임을 확인하였다. 이상의 결과로서 이질풀 추출물은 항산화 효능에 있어서 우수한 효능을 나타냄을 확인하였으며, 따라서 항산화 및 항노화의 기능성 화장품 소재로서의 적용이 가능할 것으로 사료된다.
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