[논문]볼락(Sebastes inermis) 근육단백질 유전자의 성장단계별 발현 양상과 parvalbumin 유전자 클로닝

장요순

볼락(Sebastes inermis) 근육단백질 유전자의 성장단계별 발현 양상과 parvalbumin 유전자 클로닝
Expression Pattern of Skeletal-Muscle Protein Genes and Cloning of Parvalbumin mRNA in Dark-banded Rockfish (Sebastes inermis) 원문보기

Korean journal of Ichthyology = 한국어류학회지, v.23 no.1, 2011년, pp.1 - 9

초록
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ACP (annealing control primer)를 사용하여 DDRT (differential display reverse transcription)-PCR 방법으로 볼락의 성장단계에 따라 발현량 차이를 나타내는 DEG (differentially expressed gene)를 확보하였다. ACP 120개를 분석하여 18개월령 근육조직에서보다 6개월령 근육조직에서 발현량이 많은 DEG 16개와 6개월령 근육조직에서보다 18개월령 근육조직에서 발현량이 더 많은 DEG22개의 염기서열을 분석하였다. DEG 염기서열을 BLAST 검색한 결과, parvalbumin (PVALB) 등 18개의 유전자(PVALB, NDKB, TPM, TnI, GAPDH, CKM2, factor 2 SERF2, AMPD, TRICA, ARHGAP15, ESD, hsp70, COL1A2, GST, Midllip1, MYL1, SERCA1B, FTH1)와 69~95%의 상동성을 나타냈다. Real time PCR 분석법으로 6개월령 근육조직에서 발현량이 많은 DEG14와 PVALB 유전자의 성장단계별 발현양상을 조사한 결과, 볼락이 성장함에 따라 발현량이 감소하였으며, 특히 PVALB 유전자는 6개월령 이후에는 발현량이 극히 적었다. 6개월령 근육조직에서보다 18 개월령 근육조직에서 발현량에서 많았던 CKM2 유전자는 성장함에 따라 발현량이 계속 증가하였고, 4세 이후에는 발현량이 감소하였다. DEG의 조직특이적 발현양상을 분석한 결과, DEG14는 근육, 간, 신장, 및 비장조직에서 발현되었으며, PVALB 유전자는 근육과 신장조직에서 발현되었고, 간과 비장조직에서는 발현되지 않았다. CKM2 유전자는 근육, 신장 및 비장조직에서 발현되었고, 간 조직에서는 발현되지 않았다. PVALB 유전자의 mRNA 크기는 659 bp 이며, 110개의 아미노산으로 구성되어 있다. Parvalbumin과 CKM2 유전자는 성장속도가 빠른 어류 선발에 이용할 수 있는 분자마커 개발에 활용하고자한다.

Abstract ▼ AI-Helper

Differentially Expressed Gene (DEG) was obtained from Differential Display Reverse Transcription (DDRT)-PCR using Annealing Control Primer (ACP) to search and clone genes related to developmental stages of Sebastes inermis. By using 120 ACPs, the nucleotide sequences obtained from 16 DEGs showing higher expression in 6-month-old skeletal muscle than 18-month-old ones and from 22 DEGs displaying stronger expression in 18-month-old than 6-month-old were analyzed and BLAST was conducted. The results identified that DEGs shared 69~95% homology with genes of parvalbumin (PVALB), nucleoside diphosphate kinase (NDK) B, tropomyosin (TPM), troponin I (TnI), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), muscle-type creatine kinase (CKM2), small EDRK-rich factor 2 (SERF2), adenosine monophosphate deaminase (AMPD), Trimeric intracellular cation channel type A (TRICA), Rho GTPase-activating protein 15 (ARHGAP15), S-formylglutathione hydrolase (Esterase D; ESD), heat shock protein 70 (hsp70), type 1 collagen alpha 2 (COL1A2), glutathione S-transferase, Mid1-interacting protein 1 (Mid1lip1), myosin light chain 1 (MYL1), sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase 1B (SERCA1B), and ferritin heavy subunit (FTH1). Expression pattern by developmental stage of DEG14 and PVALB exhibiting strong expression in 6-month-old skeletal muscle was investigated using real time PCR. Expression was reduced as Sebastes inermis grew. Expression of PVALB gene was extremely low after 6 months of age. Expression of CKM2 showed higher expression in 18-month-old skeletal muscle than in 6-month-old muscles, and increased continuously until 4 years old, after which CKM2 expression became gradually reduced. By analysis of tissue-specific expression patterns of DEG, DEG14 was expressed mainly in skeletal muscle, liver, kidney and spleen tissues, whereas PVALB expression was expressed in skeletal muscle and kidney, but not in liver and spleen tissues. CKM2 was expressed in skeletal muscle, kidney, and spleen tissues, but not in liver tissues. PVALB gene was composed of 110 amino acids, which constituted 659 bp nucleotides. The results reported here demonstrate that the expression patterns of parvalbumin and CKM2 could be used as molecular markers for selecting fishes exhibiting fast growth.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구는 볼락 근육조직에서 발현되는 근육특이 단백질 (MSP, muscle-specific protein)의 성장단계별 발현양상을 비교하여, 성장단계에 따라 특이적으로 발현되는 유전자를 선발한 후, 빠른 성장능력을 가진 어류를 성장 초기에 선발할 수 있는 분자마커 개발 후보 유전자를 확보하고자 수행하였다. 어류의 성장단계별 근육조직에서 차등발현 유전자를 확보한 기존의 연구는 보고된 바 없으며, 성장 초기에 발현량이 많은 parvalbumin 유전자는 분자마커 개발에 이용하기 위하여 근육조직에서 발현되는 mRNA 영역을 클로닝 하였으며, 성장속도에 차이를 나타낸 볼락의 개체간 parval bumin 유전자 발현양상과 유전정보는 향후 분자마커 개발 관련 연구에 활용하고자 한다.
볼락의 연령별 근육조직에서 발현량 차이를 나타낸 연구 결과를 토대로 기능을 추정하고 이후의 연구에 활용하고자 조직 특이적인 발현양상을 분석하였다. DEG14, parvalbu min, creatine kinase muscle-type 2 (CKM2) 유전자의 조직 특이적인 발현양상을 조사한 결과(Fig.
이 연구는 한국해양연구원의「동해온배수와 심층수 활용에 기반을 둔 해양식량어류자원의 유전적 관리체계 구축」 연구과제의 지원을 받아 수행되었다.

제안 방법

, 2004)에 따라 DEG (differentially expressed gene)를 screening하였다. 두 가닥 cDNA는 PCR의 첫 번째 단계에서 합성하였으며, 희석된 한 가닥 cDNA 50 ng, dT-ACP2 (10 卩M) 1 皿, 10 卩M arbit rary ACP 1 [1L, 2x Master Mix 10 |1L를 혼합하여 94°C 에서 분, "C에서 3분, 72°C에서 1분간 반응시켰다. 두 가닥 cDNA의 합성이 끝난 다음 두 번째 단계의 PCR은 94°C에서 40초, 65°C에서 40초, 72°C에서 40초의 조건으로 40회 반응하였다.
RACE PCR에 사용한 primer는 GC 함량이 50〜70%, 길이는 23〜28염기, Tm 값은 70°C 이상이 되도록 설계하여 합성하였으며, 5' 및 3'- RACE-Ready cDNA는 total RNA 1 fig을 5'-CDS primer [5‘- (T)25VN₃)와 3, -CDS primer A [5AAGCAGTGGTATC AACGCAGAGTAC(T)3oVN-3']와 SMART II A oligo [5‘- AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3']를 이용하여 합성하였다.5, 및 3JRACEPCR은 10배 희석한 cDNA 2.5 卩L, primer 10 pM, 10x Universal Primer A (5‘- CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCA ACGCAGAGTACGCGGG-3') 5 jxL, dNTP mix 10 mM, 50xBD polymerase mix를 최 종부피 가 50 piL가 되도록 조정하여, 94°C에서 30초, 72°C에서 3분간 5회 반응시켰고, 94°C 에서 30초, 70°C에서 30초, 72°C에서 3분의 조건으로 5회 추가로 반응시킨 후에 94°C에서 30초, 68°C에서 30초, 72°C 에서 3분 조건으로 25회 반응시켰다. PCR 산물은 2% aga rose gel 전기영동으로 확인하였고, target 단편을 회수하여 pGEM T easy vector system을 사용하여 TA cloning하였다.
1). DEG는 cDNA 단편의 크기를 300bp〜 1 kb 범위로 정하였으며, 동일한 ACP로 만들어진 단편들의 상대적인 밝기를 고려하여 선발하였다. Fig.
5 卩L, primer 10 pM, 10x Universal Primer A (5‘- CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCA ACGCAGAGTACGCGGG-3') 5 jxL, dNTP mix 10 mM, 50xBD polymerase mix를 최 종부피 가 50 piL가 되도록 조정하여, 94°C에서 30초, 72°C에서 3분간 5회 반응시켰고, 94°C 에서 30초, 70°C에서 30초, 72°C에서 3분의 조건으로 5회 추가로 반응시킨 후에 94°C에서 30초, 68°C에서 30초, 72°C 에서 3분 조건으로 25회 반응시켰다. PCR 산물은 2% aga rose gel 전기영동으로 확인하였고, target 단편을 회수하여 pGEM T easy vector system을 사용하여 TA cloning하였다.
Real-time PCM] 사용할 target 유전자의 primer (Table 1)는 poly(A) + 부근이 증폭되고, 증폭 단편의 크기는 70〜200 bp이며, Tm 값이 58~60°C가 되도록 설계하였다. Pre-PCR로 primer■ 및 cDNA 상태를 확인하였다. cDNA 5 ng, primer (forward+ reverse, 10 pM) 0.
포함하는 단편을 얻었다. RACE PCR에 사용한 primer는 GC 함량이 50〜70%, 길이는 23〜28염기, Tm 값은 70°C 이상이 되도록 설계하여 합성하였으며, 5' 및 3'- RACE-Ready cDNA는 total RNA 1 fig을 5'-CDS primer [5‘- (T)25VN₃)와 3, -CDS primer A [5AAGCAGTGGTATC AACGCAGAGTAC(T)3oVN-3']와 SMART II A oligo [5‘- AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3']를 이용하여 합성하였다.5, 및 3JRACEPCR은 10배 희석한 cDNA 2.
한 가닥 cDNA를 합성하였다. Real-time PCM] 사용할 target 유전자의 primer (Table 1)는 poly(A) + 부근이 증폭되고, 증폭 단편의 크기는 70〜200 bp이며, Tm 값이 58~60°C가 되도록 설계하였다. Pre-PCR로 primer■ 및 cDNA 상태를 확인하였다.
Pre-PCR로 primer■ 및 cDNA 상태를 확인하였다. cDNA 5 ng, primer (forward+ reverse, 10 pM) 0.8 卩L, SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, USA) 10 皿를 첨가하여 최종 부피가 20 由가 되도록 조정한 후, 95°C에서 30초, 60°C에서 30초, 72°C에서 30초의 조건으로 40회 반응시켰다. 양적인 분석을 위하여 동일 유전자에 대해 3회 반복 실험하였으며, real-time PCR 분석은 Applied Biosystem prism 7900 Sequence De- tection System (Applied Biosy아ems, USA)을 사용하여 수행하였다.
사용하여 비교하였다. 동일한 양의 mRNA로부터 ACP에 의해 생성된 유전자 단편을 전기영동하여 6개월령 근육조직에서 발현량 차이를 나타낸 DEG (differentially expressed gene) 16개와 18개 월령 근육조직에서 발현량 차이를 나타낸 22개의 DEG를 확인하였다(Fig. 1). DEG는 cDNA 단편의 크기를 300bp〜 1 kb 범위로 정하였으며, 동일한 ACP로 만들어진 단편들의 상대적인 밝기를 고려하여 선발하였다.
두 가닥 cDNA는 PCR의 첫 번째 단계에서 합성하였으며, 희석된 한 가닥 cDNA 50 ng, dT-ACP2 (10 卩M) 1 皿, 10 卩M arbit rary ACP 1 [1L, 2x Master Mix 10 |1L를 혼합하여 94°C 에서 분, "C에서 3분, 72°C에서 1분간 반응시켰다. 두 가닥 cDNA의 합성이 끝난 다음 두 번째 단계의 PCR은 94°C에서 40초, 65°C에서 40초, 72°C에서 40초의 조건으로 40회 반응하였다. 증폭산물은 2% agarose gel에 전기영동하고, EtBr로 염색하였다.
목적하는 cDNA 단편은 SMART™RACE cDNA Ampli- fication Kit (Clontech, USA)을 이용하여 cDNA 말단 염기서열을 포함하는 단편을 얻었다. RACE PCR에 사용한 primer는 GC 함량이 50〜70%, 길이는 23〜28염기, Tm 값은 70°C 이상이 되도록 설계하여 합성하였으며, 5' 및 3'- RACE-Ready cDNA는 total RNA 1 fig을 5'-CDS primer [5‘- (T)25VN₃)와 3, -CDS primer A [5AAGCAGTGGTATC AACGCAGAGTAC(T)3oVN-3']와 SMART II A oligo [5‘- AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3']를 이용하여 합성하였다.
발현량 차이를 나타낸 단편은 pGEM T easy vector (Pro- mega, USA)를 이용하여 클로닝하였고, DEG 클론은 Big- Dye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Bio systems, USA)A5_ 반응시켰다. 정제한 염기서열 반응 산물은 ABI 3730x1 DNA Analyzer (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 염기서열을 결정하였고, Chromasv2.
볼락의 근육, 간, 신장 및 비장조직을 각각 100 mg씩 취한 -F, TRIzol® Reagent (Invitrogen, USA) 1 mL을 첨가하여 homogenizer로 파쇄하였다. 상온에서 5분간 반응시킨 후 chloroform 0.
볼락의 성장단계 관련 기능성 유전자를 탐색하여 확보하기 위하여 성장초기인 6개월령 근육조직과 성장의 절정기인 18개월령 근육조직에서 발현되는 유전자를 120개의 ACP를 사용하여 비교하였다. 동일한 양의 mRNA로부터 ACP에 의해 생성된 유전자 단편을 전기영동하여 6개월령 근육조직에서 발현량 차이를 나타낸 DEG (differentially expressed gene) 16개와 18개 월령 근육조직에서 발현량 차이를 나타낸 22개의 DEG를 확인하였다(Fig.
볼락의 성장초기인 6개월령 근육조직에서 최대 발현양상을 나타낸 p<irvalbumin 유전자를 어류의 초기성장관련 분자 마커 개발에 활용하기 위하여 RACE-PCR 방법으로 mRNA 영역을 클로닝하였다. 염기서열을 분석한 결과(Fig.
성장단계에 따라 차등발현 양상을 나타낸 DEG 중 6개 월령 근육조직에서 발현량이 많은 parvallmmin과 기능이 밝혀지지 않은 DEG14, 18개월령 근육조직에서 발현량이 많은 creatine kinase muscle-type 2 (CKM2) 유전자의 발현양상을 연령이 다른 근육조직 시료를 이용하여 실시간 mRNA 정량법으로 비교하였다(Fig.2). DEG14는 6개월령 근육조직에서 가장 많이 발현되며 성장함에 따라 발현량이 감소하였으며, 4세어에서는 발현량이 거의 없었다.
성장단계에서 차등발현 양상을 나타내어 선발한 DEG는 염기서열을 분석하여 유전자 정보를 확보하고 대략적인 기능을 파악하였다 (Table 2). 36개의 DEG 중 2개는 기능이 밝혀지지 않은 유전자에 해당하였고, 18개월령 근육조직보다 6개월령 근육조직에서 발현량이 많은 DEG는 parvab bumin (PVALB), nucleoside diphosphate kinase (NDK) B, tropomyosin (TPM), troponin I (Tnl) 유전자에 해당하였고, 69〜95%의 상동성을 나타내었다, 18개월령 근육조직에서 발현량이 많은 DEG는 glyceraldehyde-3-phosphate dehy drogenase (GAPDH), muscle-type creatine kinase (CKM2), small EDRK-rich factor 2 (SERF2), adenosine monophos phate deaminase (AMPD), Trimeric intracellular cation chan nel type A(TRICA) RHO GTPase-ACTIVATING PROTEIN 15 (ARHGAP15), S-formylglutathione hydrolase (Esterase D; ESD), heat shock protein 70 (hsp70), type 1 collagen alpha 2 (COL1A2), glutathione S-transferase, Midi-interacting pro tein 1 (Midllipl), myosin light chain 1 (MYL1), sarcoplasmic/ endoplasmic reticulum calcium ATPase IB (SERCA1B), fer ritin heavy subunit (FTH₁) 유전자에 해당하였다.
8 卩L, SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, USA) 10 皿를 첨가하여 최종 부피가 20 由가 되도록 조정한 후, 95°C에서 30초, 60°C에서 30초, 72°C에서 30초의 조건으로 40회 반응시켰다. 양적인 분석을 위하여 동일 유전자에 대해 3회 반복 실험하였으며, real-time PCR 분석은 Applied Biosystem prism 7900 Sequence De- tection System (Applied Biosy아ems, USA)을 사용하여 수행하였다.
2)에서 성장초기에 발현량이 급증하고 이후에는 발현량이 거의 없음을 확인하였다. 이와 같은 연구결과는 6개월령 Clarias macrocephalus^ parvalbumin 4 유전자의 발현량이 가장 많았다는 Poompuang and Panprommin(2010)의 보고와 일치하였으며, 볼락의 초기 성장과 관련된 분자마커 개발에 활용하기 위하여 mRNA 영역을 클로닝하여 유전정보를 확보하였다. 볼락의 연령이 증가함에 따라 발현량이 증가하여 성장이 둔화됨에 따라 발현량도 감소한 CKM2 유전자 또한 성장관련 유전자로 판단된다.
근육조직으로부터 분리. 정제한 total RNA 3 p, g, GeneFishing™ DEG Kits (Seegene, Korea) 내 10 卩M dT- ACP1 (5, -CGTGAATGCTGCGACTACGATIIIII(T)18)-3/ 2 卩L, 5x reaction buffer 4 piL, dNTPmix (each 2 mM) 5 [1L, RNasin®RNase Inhibitor (40 U/^iL, Promega) 0.5 卩L, M-MLV RTase (200 Promega) 1 皿를 첨가하여 42°C에서 1 시간 30분 동안 반응시켜 합성하였다. 합성된 한 가닥 cDNA 는 5배 희석하여 실험에 이용할 때까지 -20°C에 보관하였다.

대상 데이터

경남 통영시 소재의 한국해양연구원 통영 MRC에서 일반적인 관리방법으로 사육된 6, 18, 30개월령과 4년생 볼락을 각 10개체씩 확보하여 근육 조직, 간 조직, 신장 및 비장조직을 유전자 분석에 사용하였다.

데이터처리

1 Cycle Sequencing Kit (Applied Bio systems, USA)A5_ 반응시켰다. 정제한 염기서열 반응 산물은 ABI 3730x1 DNA Analyzer (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 염기서열을 결정하였고, Chromasv2.30과 BioEdit V5.0.6 프로그램을 이용하여 염기서열을 분석하였다.

이론/모형

합성된 한 가닥 cDNA 는 5배 희석하여 실험에 이용할 때까지 -20°C에 보관하였다. ACP-based PCR 방법 (Kim et al., 2004)에 따라 DEG (differentially expressed gene)를 screening하였다. 두 가닥 cDNA는 PCR의 첫 번째 단계에서 합성하였으며, 희석된 한 가닥 cDNA 50 ng, dT-ACP2 (10 卩M) 1 皿, 10 卩M arbit rary ACP 1 [1L, 2x Master Mix 10 |1L를 혼합하여 94°C 에서 분, "C에서 3분, 72°C에서 1분간 반응시켰다.

성능/효과

Parval- bumin은 성장초기의 근육에서만 발현되는 것으로 판단된다. CKM2 유전자는 성장함에 따라 발현량이 증가되어 30개월령 근육조직에서 가장 많이 발현되었으며 성장이 둔화됨에 따라 발현량도 감소하는 양상을 보였다. 이와 같은 결과는 parvalbumin 유전자는 어류의 성장초기에 근육 성장에 관여하는 유전자 그룹에 속하며, CKM2 유전자는 성장절정기까지 작용하는 유전자 그룹에 포함됨올 시사한다.
Poom-puang and Panprommin(2010)은 Clarias macrocephalus가 6개월령에 도달했을 때, parvalbumin 4 유전자가 가장 많이 발현된다고 보고하였다. Creatine kinase (muscle-type) 2 유전자는 연령이 증가함에 따라 발현량도 증가했으며, 30개월령 근육조직에서 최대 발현량을 나타내어, 6개월령 근육조직에서 발현량의 1.8배가 되었다. 4세어 근육조직에서는 발현량이 감소되었으며, 그 양은 30개월령 근육조직에서 발현하는 양의 50%이었다.
특이적인 발현양상을 분석하였다. DEG14, parvalbu min, creatine kinase muscle-type 2 (CKM2) 유전자의 조직 특이적인 발현양상을 조사한 결과(Fig. 3), DEG14는 근육조직을 포함하여 간, 신장 및 비장 조직에서도 모두 발현되었으며, parvalbumin 유전자는 근육과 신장조직에서는 발현되었으나 간과 비장조직에서는 발현되지 않았다. CKM2 유전자는 근육, 신장 및 비장조직에서는 발현되었으나 간 조직에서는 발현되지 않았다.
2). DEG14는 6개월령 근육조직에서 가장 많이 발현되며 성장함에 따라 발현량이 감소하였으며, 4세어에서는 발현량이 거의 없었다. Pawalbumiii 유전자는 성장초기인 6개월령에 가장 많이 발현되었고, 연령이 증가함에 따라 발현량이 급격히 감소하였다.
CKM2 유전자는 근육, 신장 및 비장조직에서는 발현되었으나 간 조직에서는 발현되지 않았다. Parvalbumin과 CKM2 유전자가 간 조직에서는 발현되지 않은 결과로 이들 유전자를 근육 성장 관련 분자마커 개발에 활용이 가능함을 확인하였다.
DEG14는 6개월령 근육조직에서 가장 많이 발현되며 성장함에 따라 발현량이 감소하였으며, 4세어에서는 발현량이 거의 없었다. Pawalbumiii 유전자는 성장초기인 6개월령에 가장 많이 발현되었고, 연령이 증가함에 따라 발현량이 급격히 감소하였다. Parval- bumin은 성장초기의 근육에서만 발현되는 것으로 판단된다.
볼락 근육조직에서 클로닝한 parvalbumin의 mRNA 염기서열을 BLAST 검색한 결과, mRNA 수준에서는 Siniperca chuatsi parvalbumin 3 mRNA와 88% (569/652), Sparus aurata parvalbumin-like protein mRNA과 87% (575/666), Epinephelus coioides parvalbumin 2 mRNA과 87% (565/652), Oreochromis mossambicus parvalbumin과 86% (484/566), Lepidorhombus whiffiagonis parvalbumin과 80% (522/654)가 일치하였다. 아미노산 수준에서는 Epinephelus &疗。让/es의 parvalbumin 2오* 92개의 아미노산이 동일하여 84%의 일치성을 나타냈고, Sparus aurata parvalbumin-like protein과 81% (89/110), Siniperca chuatsi parvalbumin 3과 81% (89/110), Oreochromis mossambicus parvalbumin과 80% (88/110) 그리고 Cyprinus carpio parvalbumin과 80% (88/110)가 일치하였다.
Parvalbumin 유전자와 CKM2 유전자가 근육조직에서는 발현되지만, 간조직에서 발현되지 않은 결과는 이들 유전자가 어류의 기초대사 관련 유전자가 아님을 시사하며, 근육대사 관련 유전자로 어류의 근육성장 관련 분자 마커 개발에 활용 가능함을 제시한다. 본 연구에서 확인한 parvalbumin과 CKM2 유전자의 발현양상 분석 결과로는 이들 유전자가 어류의 성장에 관여하는 정확한 기능을 해명할 수 없지만, 초기 성장에 작용하는 유전자와 성장절정기에 작용하는 유전자가 다르며, 동일한 유전자도 성장단계에 따라 발현량이 다른 사실을 확인하였다. 어류의 성장단계별 발현 유전자와 발현양상 분석결과를 비롯하여 성장 관련 분자마커 적용사례는 아직까지 보고된 바 없으나, 성장 차이를 보인 개체를 선발한 후, parvalbumin과 CKM2 유전자의 발현양상을 각각 비교하고, 기능영역 내 변이 또는 발현 조절영역 내 변이를 분석하는 방법을 적용하면 어류의 성장관련 분자마커 개발이 가능할 것으로 판단된다.
4), 볼락의 parvalbumin mRNA 크기는 659 bp 이었으며, 110 개의 아미노산으로 이루어진 작은 단백질을 암호화하는 것올 확인하였다. 볼락 근육조직에서 클로닝한 parvalbumin의 mRNA 염기서열을 BLAST 검색한 결과, mRNA 수준에서는 Siniperca chuatsi parvalbumin 3 mRNA와 88% (569/652), Sparus aurata parvalbumin-like protein mRNA과 87% (575/666), Epinephelus coioides parvalbumin 2 mRNA과 87% (565/652), Oreochromis mossambicus parvalbumin과 86% (484/566), Lepidorhombus whiffiagonis parvalbumin과 80% (522/654)가 일치하였다. 아미노산 수준에서는 Epinephelus &疗。让/es의 parvalbumin 2오* 92개의 아미노산이 동일하여 84%의 일치성을 나타냈고, Sparus aurata parvalbumin-like protein과 81% (89/110), Siniperca chuatsi parvalbumin 3과 81% (89/110), Oreochromis mossambicus parvalbumin과 80% (88/110) 그리고 Cyprinus carpio parvalbumin과 80% (88/110)가 일치하였다.
볼락의 성장초기인 6개월령 근육조직에서 차등발현 양상을 나타내어 선발한 14개의 DEG중 6개를 차지한 parval-bumin 유전자는 근육 내에서 칼슘이온과 결합하는 단백질로 연령별 발현양상 분석 결과(Fig. 2)에서 성장초기에 발현량이 급증하고 이후에는 발현량이 거의 없음을 확인하였다. 이와 같은 연구결과는 6개월령 Clarias macrocephalus^ parvalbumin 4 유전자의 발현량이 가장 많았다는 Poompuang and Panprommin(2010)의 보고와 일치하였으며, 볼락의 초기 성장과 관련된 분자마커 개발에 활용하기 위하여 mRNA 영역을 클로닝하여 유전정보를 확보하였다.
발현양의 차이가 있었다. 성장 초기인 6개월령 근육조직에서는 thin filament protein에 속하는 tropomyosin과 troponin 유전자의 발현량이 많은 반면에, 18개월령 근육조직에서는 thick filament protein인 myosin 유전자의 발현량이 많았으며, 18개월령 근육조직 유래 DEG에서도 tropo- myosin과 troponin 유전자는 확인되지 않았다. 이와 같은 연구 결과로부터 어류의 근육 성장에 관여하는 근육단백질 관련 유전자는 성장시기에 따라 발현되는 유전자가 다름을 알 수 있었으며, 연령에 따라 발현량 차이를 나타낸 근육 단백질 유전자의 발현양상을 어류의 성장패턴과 성장 속도를 예측할 수 있는 분자마커 개발에 활용할 수 있을 것으로 판단하였다.
어류가 성장함에 따라 근육이 생성되고, 성장 시기에 따라 작용하는 근육단백질 종류와 발현량 차이를 조사하기 위하여 성장 초기인 6개월령 근육조직과 성장 절정기인 18 개월령 근육조직의 mRNA를 비교하여 분석한 결과, Table 2에 나타낸 것과 같이 연령에 따라 발현되는 유전자의 종류와 발현양의 차이가 있었다. 성장 초기인 6개월령 근육조직에서는 thin filament protein에 속하는 tropomyosin과 troponin 유전자의 발현량이 많은 반면에, 18개월령 근육조직에서는 thick filament protein인 myosin 유전자의 발현량이 많았으며, 18개월령 근육조직 유래 DEG에서도 tropo- myosin과 troponin 유전자는 확인되지 않았다.
영역을 클로닝하였다. 염기서열을 분석한 결과(Fig. 4), 볼락의 parvalbumin mRNA 크기는 659 bp 이었으며, 110 개의 아미노산으로 이루어진 작은 단백질을 암호화하는 것올 확인하였다. 볼락 근육조직에서 클로닝한 parvalbumin의 mRNA 염기서열을 BLAST 검색한 결과, mRNA 수준에서는 Siniperca chuatsi parvalbumin 3 mRNA와 88% (569/652), Sparus aurata parvalbumin-like protein mRNA과 87% (575/666), Epinephelus coioides parvalbumin 2 mRNA과 87% (565/652), Oreochromis mossambicus parvalbumin과 86% (484/566), Lepidorhombus whiffiagonis parvalbumin과 80% (522/654)가 일치하였다.

후속연구

볼락의 연령이 증가함에 따라 발현량이 증가하여 성장이 둔화됨에 따라 발현량도 감소한 CKM2 유전자 또한 성장관련 유전자로 판단된다. Parvalbumin 유전자와 CKM2 유전자가 근육조직에서는 발현되지만, 간조직에서 발현되지 않은 결과는 이들 유전자가 어류의 기초대사 관련 유전자가 아님을 시사하며, 근육대사 관련 유전자로 어류의 근육성장 관련 분자 마커 개발에 활용 가능함을 제시한다. 본 연구에서 확인한 parvalbumin과 CKM2 유전자의 발현양상 분석 결과로는 이들 유전자가 어류의 성장에 관여하는 정확한 기능을 해명할 수 없지만, 초기 성장에 작용하는 유전자와 성장절정기에 작용하는 유전자가 다르며, 동일한 유전자도 성장단계에 따라 발현량이 다른 사실을 확인하였다.
어류의 성장단계별 근육조직에서 차등발현 유전자를 확보한 기존의 연구는 보고된 바 없으며, 성장 초기에 발현량이 많은 parvalbumin 유전자는 분자마커 개발에 이용하기 위하여 근육조직에서 발현되는 mRNA 영역을 클로닝 하였으며, 성장속도에 차이를 나타낸 볼락의 개체간 parval bumin 유전자 발현양상과 유전정보는 향후 분자마커 개발 관련 연구에 활용하고자 한다.
본 연구에서 확인한 parvalbumin과 CKM2 유전자의 발현양상 분석 결과로는 이들 유전자가 어류의 성장에 관여하는 정확한 기능을 해명할 수 없지만, 초기 성장에 작용하는 유전자와 성장절정기에 작용하는 유전자가 다르며, 동일한 유전자도 성장단계에 따라 발현량이 다른 사실을 확인하였다. 어류의 성장단계별 발현 유전자와 발현양상 분석결과를 비롯하여 성장 관련 분자마커 적용사례는 아직까지 보고된 바 없으나, 성장 차이를 보인 개체를 선발한 후, parvalbumin과 CKM2 유전자의 발현양상을 각각 비교하고, 기능영역 내 변이 또는 발현 조절영역 내 변이를 분석하는 방법을 적용하면 어류의 성장관련 분자마커 개발이 가능할 것으로 판단된다.
성장 초기인 6개월령 근육조직에서는 thin filament protein에 속하는 tropomyosin과 troponin 유전자의 발현량이 많은 반면에, 18개월령 근육조직에서는 thick filament protein인 myosin 유전자의 발현량이 많았으며, 18개월령 근육조직 유래 DEG에서도 tropo- myosin과 troponin 유전자는 확인되지 않았다. 이와 같은 연구 결과로부터 어류의 근육 성장에 관여하는 근육단백질 관련 유전자는 성장시기에 따라 발현되는 유전자가 다름을 알 수 있었으며, 연령에 따라 발현량 차이를 나타낸 근육 단백질 유전자의 발현양상을 어류의 성장패턴과 성장 속도를 예측할 수 있는 분자마커 개발에 활용할 수 있을 것으로 판단하였다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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