In general, cloned pigs have been produced using the somatic cell nuclear transfer (SCNT) technique with various types of somatic cells; however, the SCNT technique has disadvantages not only in its low efficiency but also in the development of abnormal clones. This study aimed to compare early embr...
In general, cloned pigs have been produced using the somatic cell nuclear transfer (SCNT) technique with various types of somatic cells; however, the SCNT technique has disadvantages not only in its low efficiency but also in the development of abnormal clones. This study aimed to compare early embryonic development and quality of SCNT embryos with those of induced pluripotent stem cells (iPSCs) NT embryos (iPSC-NTs). Ear fibroblast cells were used as donor cells and iPSCs were generated from these cells by lentiviral transduction with human six factors (Oct4, Sox2, c-Myc, Nanog, Klf4 and Lin28). Blastocyst formation rate in iPSC-NT (23/258, 8.9%) was significantly lower than that in SCNT (46/175, 26.3%; p < 0.05). Total cell number in blastocysts was similar between two groups, but blastocysts in iPSC-NT had a lower number of apoptotic cells than in SCNT (2.0 ± 0.6 vs. 9.8 ± 2.9, p < 0.05). Quantitative PCR data showed that apoptosis-related genes (bax, caspase-3, and caspase-9) were highly expressed in SCNT than iPSC-NT (p < 0.05). Although an early development rate was low in iPSC-NT, the quality of cloned embryos from porcine iPSC was higher than that of embryos from somatic cells. Therefore, porcine iPSCs could be used as a preferable cell source to create a clone or transgenic animals by using the NT technique.
In general, cloned pigs have been produced using the somatic cell nuclear transfer (SCNT) technique with various types of somatic cells; however, the SCNT technique has disadvantages not only in its low efficiency but also in the development of abnormal clones. This study aimed to compare early embryonic development and quality of SCNT embryos with those of induced pluripotent stem cells (iPSCs) NT embryos (iPSC-NTs). Ear fibroblast cells were used as donor cells and iPSCs were generated from these cells by lentiviral transduction with human six factors (Oct4, Sox2, c-Myc, Nanog, Klf4 and Lin28). Blastocyst formation rate in iPSC-NT (23/258, 8.9%) was significantly lower than that in SCNT (46/175, 26.3%; p < 0.05). Total cell number in blastocysts was similar between two groups, but blastocysts in iPSC-NT had a lower number of apoptotic cells than in SCNT (2.0 ± 0.6 vs. 9.8 ± 2.9, p < 0.05). Quantitative PCR data showed that apoptosis-related genes (bax, caspase-3, and caspase-9) were highly expressed in SCNT than iPSC-NT (p < 0.05). Although an early development rate was low in iPSC-NT, the quality of cloned embryos from porcine iPSC was higher than that of embryos from somatic cells. Therefore, porcine iPSCs could be used as a preferable cell source to create a clone or transgenic animals by using the NT technique.
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문제 정의
본 연구에서 돼지 iPSC를 생산하고 이를 이용하여 핵이식 복제란의 생산 효율을 검토하였다. 배반포 발육율에 있어서 iPSCNT (23/258, 8.
본 연구에서는 돼지 체세포 및 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC)를 이용하여 핵이식 복제란의 생산 효율을 검토하고, 생산된 배반포의 apoptosis와 전능성 인자의 유전자 발현을 조사하여 공여세포로서의 iPSC와 핵이식란의 질적 특성과의 연관성을 검토하기 위하여 실시하였다.
제안 방법
3회 계대배양 후 CELLBANKER® 1 동결액으로 동결 보존하였으며 일부는 iPSC 생산에 이용하였다.
미수정란의 염색체 제거는 10 mg/mL Hoechst 33342 및 5 mg/mL cytochalasin B (CB)가 함유된 PBS (modified phosphate buffered saline; mPBS)액 내에서 염색체의 유무를 확인하여 탈핵하였다. Donor세포는 injection pipette으로 흡입하여 탈핵을 실시한 구멍을 통하여 탈핵란 세포 질의 위란강내로 주입하였다.
배양 6일차에 생성된 배반포에 대하여 FastLane Cell cDNA Kit (Qiagen, Valencia, USA)을 이용하여 cDNA를 제공된 방법 에 따라 준비하였다. Real-Time RT-PCR은 Rotor-Gene SYBR Green PCR Kit (Qiagen, USA) 및 7500 Fast Real-Time PCR System (Life Technologies, USA)를 이용하여 분석하였다. 분석에 사용된 primer는 Table 1에 제시하였다.
분석에 사용된 primer는 Table 1에 제시하였다. Real-Time RTPCR의 증폭조건은 95℃에서 1분간 pre-incubation 과정을 거친 후 95도에서 15초 동한 denaturation 후 60℃에서 1분간 annealing의 과정을 40회 반복하도록 조작하였다. 각 유전자에 대한 발현량은 2ΔΔCT 방법을 이용하여 비교하였다.
이 후 24시간째에 세포를 회수하고 줄기세포 배양액(DMEM/F12, 10% Knockout Serum Replacement (KSR; Invitrogen), 10% FBS (Invitrogen), 50 units/mL penicillin (GIBCO), 50 μg/ mL streptomycin (GIBCO), 2 mM L-glutamine (GIBCO), 0.1 mM nonessential amino acids (NEAAs, GIBCO), 1 uM β-mercaptoethanol, 20 ng/mL basic fibroblast growth factor-2 (bFGF; R&D Systems), 20 ng/mL leukemia inhibitory factor (LIF; Sigma))을 이용하여 mitomycin C가 처리된 mouse embryonic fibroblasts (iMEFs)로 옮겨 배양하였다.
4로 나타났다(Kwon 등, 2017b). 이러한 특성을 가지 고 있는 돼지 iPSC를 핵이식 공여세포로 이용하였을 경우 배반포 발육율 및 초기배의 특성을 분석하였다.
이는 본 연구에 사용된 iPSC의 경우 리프로그래밍 인자들이 게놈에 integration되는 형태로서 이식된 iPSC에 silencing 되지 않은 리프로그래밍 인자에 의해 핵이식 난자 내에서 리프로그래밍이 정상적으로 이루어지지 않았을 것으로 사료된다. 하지만 iPSC-NT 복제란의 경우 SCNT란에 비해 유의적으로 낮게 apoptosis가 발생하여 이와 관련된 유전자의 발현을 분석하였다.
핵이식란은 0.1 mM MgSO4, 0.05 mM CaCl2, 0.05 mg/mL BSA를 첨가한 0.3 M mannitol 액을 이용하였으며, 1.5 kV/cm의 직류(DC)전류를 30 μsec 간 2회 통전하였다.
핵이식란의 전기융합은 BTX 2001 Electro Cell Manipulator (BTX) 및 1.0 mm폭의 wire chamber를 사용하여 전기융합을 실시하였다. 핵이식란은 0.
대상 데이터
이후 10 mg/mL Hoechest 33342가 함유된 Prolong antifade Kit (Molecular Probes)을 이용하여 슬라이드에 고정하였다. Apoptotic cell은 epifluorescent microscope (Nikon)하에서 검사 하였다.
돼지 iPSC은 Kwon 등(2013)에 의해 생산된 세포를 이용하였다(Kwon 등, 2013). LIF에 의존적이며, 돔 형태의 콜로니를 형성하고, 지지세포가 없이 matrigel이 코팅된 배양접시에서 배양 시에도 AP가 강하게 발현되는 특징을 가지고 있다[Fig.
돼지 체세포 및 iPSC은 이전 연구에서 생산된 세포를 이용하였다(Kwon 등, 2013). 돼지 체세포는 국립축산과학원의 MGH(Massachusetts General Hospital) 미니돼지의 귀조직 일부를 회수하여 분리 및 배양하였다. 회수한 귀조직은 잘게 잘라 0.
데이터처리
모든 처리에 대한 실험은 3회 이상 반복 실시하였으며, 세포수를 제외한 모든 결과에 대해 Statistical Analysis System (SAS Institute, Inc., USA)의 General Linear Models 절차를 이용 한 Duncan’s multiple range test로 유의성을 검토하였다.
, USA)의 General Linear Models 절차를 이용 한 Duncan’s multiple range test로 유의성을 검토하였다. 세포수는 t-test를 이용하여 유의성을 검토하였다. 유의차는 p < 0.
이론/모형
iPSC의 생산은 Lentiviral transduction은 viPS Vector Kit (Thermo Fisher Scientific)을 이용하였으며, 제조사의 방법에 준하여 실시하였다. 돼지 귀세포는 1.
각 유전자에 대한 발현량은 2ΔΔCT 방법을 이용하여 비교하였다.
배양 6일차에 생성된 배반포에 대하여 FastLane Cell cDNA Kit (Qiagen, Valencia, USA)을 이용하여 cDNA를 제공된 방법 에 따라 준비하였다. Real-Time RT-PCR은 Rotor-Gene SYBR Green PCR Kit (Qiagen, USA) 및 7500 Fast Real-Time PCR System (Life Technologies, USA)를 이용하여 분석하였다.
최근 다양한 방법을 이용한 돼지 iPSC이 생산되고 있으며, 6-factor를 이용하여 iPSC을 생산하였을 경우 4-factor를 이용한 경우보다 chimera 생산 효율이 높은 것으로 보고되었다(West 등, 2011; Fujishiro 등, 2012). 본 연구에서는 6-factor를 이용 하여 생산된 iPSC을 핵이식에 이용하였다. 본 연구에서 이용한 iPSC은 LIF에 의존적이며, 마우스 줄기세포와 유사한 형태로 배양이 가능하였다.
성능/효과
두 처리 모두에서 생산된 배반포의 세포수는 차이가 없었으나, SCNT 유래 배반포에서 iPSC-NT 유래 배반포에 비해 apoptosis가 높게 나타났다(2.0 ± 0.6 vs. 9.8 ± 2.9, p < 0.05).
본 연구에서 이용한 iPSC은 LIF에 의존적이며, 마우스 줄기세포와 유사한 형태로 배양이 가능하였다. 또한 60회 이상 계대배양 하여도 줄기세포의 특성을 유지하고 있었으며, 이후 3-germ layer로 분화될 수 있는 테라토마 형성도 가능하였다. 돼지 iPSC의 세포주기를 분석한 결과 G0/G1, S, G2/M기 분포는 각각 37.
1]. 또한 면역형광 염색방법을 이용하여 줄기세포 인자의 발현을 검토한 결과, Oct4와 Nanog가 강하게 발현되었다. 핵이식 공여세포로 이용하기 위하여 trypsin-EDTA가 함유된 PBS액으로 처리하였을 경우 단일세포로 쉽게 분리가 되었으며, 핵/세포질 비율이 높게 나타났으며, 실체현미경 하에서 쉽게 interphase 핵의 형태를 확 인할 수 있었다[Fig.
배반포 발육에 있어서는 SCNT 구가 25.5% (39/153)로 iPSCNT의 5.9% (11/187)보다 유의적으로 높게 나타났다(p < 0.05).
따라서 공여세포의 epigenetic 상태와 리프로그래밍을 위한 transgene의 발현여부가 핵이식 성공에 크게 영향하는 것으로 사료된다. 본 연구 결과 분할율은 차이가 없었으나 이후 배반포 발육율이 현저히 떨어졌다. 이는 본 연구에 사용된 iPSC의 경우 리프로그래밍 인자들이 게놈에 integration되는 형태로서 이식된 iPSC에 silencing 되지 않은 리프로그래밍 인자에 의해 핵이식 난자 내에서 리프로그래밍이 정상적으로 이루어지지 않았을 것으로 사료된다.
따라서 TUNEL assay를 통한 apoptosis 분석자료는 초기배를 질적으로 판단할 수 있는 중요한 기준으로 활용될 수 있다. 본 연구에서 iPSC-NT 복제란의 경우 Caspase-3 및 Caspase-9과 이들에 의해 조절되는 Bcl-xL의 유전자 발현이 SCNT란에 비해 높게 나타났다. 이전 연구에서 형태적으로 우수한 grade I 난자의 경 우 grade IV 난자에서 보다 Bax 발현이 낮게 나타났으며, Bcl-2 발현이 Bax 보다 높게 나타난 반면, grade IV 난자의 경우 Bcl-2 발현이 Bax 보다 낮게 나타나 Bcl/Bax 비율에 따라 apoptosis가 조절되는 것으로 보고하였다(Yang과 Rajamahendran, 2002).
본 연구에서는 6-factor를 이용 하여 생산된 iPSC을 핵이식에 이용하였다. 본 연구에서 이용한 iPSC은 LIF에 의존적이며, 마우스 줄기세포와 유사한 형태로 배양이 가능하였다. 또한 60회 이상 계대배양 하여도 줄기세포의 특성을 유지하고 있었으며, 이후 3-germ layer로 분화될 수 있는 테라토마 형성도 가능하였다.
생산된 배반포의 apoptosis를 검토한 결과, SCNT 구 유래 배반포의 경우 9.8 ± 2.9로 나타났으며, iPSC-NT 구의 경우에 는 2.0 ± 0.6으로 나타나 유의적으로 apoptosis가 낮게 나타났다(Fig. 2, p < 0.05).
초기배발육과 연관된 유전자인 Oct4와 Dnmt3b의 발현을 검토한 결과 Oct4와 Dnmt3b 모두 iPSC-NT 유래 배반포에서 높게 발현되었다. 전능성 관련 인자의 발현은 초기배의 리프로그래밍에 있어서 중요한 역할을 가지고 있으며, 배 발달 과정에서 크게 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(Eckardt와 McLaughlin, 2004).
Fan 등(2013)은 일반적으로 사용하고 있는 핵이식 기술을 이용하여 생산한 11,923개의 돼지 iPSC-NT 복제란을 71 두의 대리모에 이식하여 그 중 25%에서 임신을 확인하였으나 산 자는 얻지 못하였다. 하지만 핵이식 전 iPSC에 histone acetylation 유도제를 처리하여 배반포 발육율이 향상됨을 확인하였으며, transgene의 발현을 제어하기 위하여 Dox system을 이용하여 iPSC을 생산하고 분화를 유도한 후 핵이식 공여세포로 사용하여 iPSC-NT 산자를 얻을 수 있었다. 따라서 공여세포의 epigenetic 상태와 리프로그래밍을 위한 transgene의 발현여부가 핵이식 성공에 크게 영향하는 것으로 사료된다.
또한 면역형광 염색방법을 이용하여 줄기세포 인자의 발현을 검토한 결과, Oct4와 Nanog가 강하게 발현되었다. 핵이식 공여세포로 이용하기 위하여 trypsin-EDTA가 함유된 PBS액으로 처리하였을 경우 단일세포로 쉽게 분리가 되었으며, 핵/세포질 비율이 높게 나타났으며, 실체현미경 하에서 쉽게 interphase 핵의 형태를 확 인할 수 있었다[Fig. 1].
후속연구
전능성 인자(Oct-4)의 유전자 발현의 경우 iPSC-NT 유래 배반포에서 높게 나타났다. 결과적으로 iPSC-NT 핵이식란의 경우 초기 발육율은 낮으나 생산된 배반포는 질적으로 우수한 것으로 나타나 iPSC을 핵이식 공여세포로서 다양하게 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
체세포복제 효율은 어떤 요인들로부터 영향을 받는 가?
체세포 핵이식 기술(somatic cell nuclear transfer; SCNT)은 유용 물질을 생산하거나 장기이식을 위한 형질전환 동물을 생산하기 위한 효과적인 방법으로 다양한 종류의 형질전환 동물의 생산에 이용되고 있다(Lai 등, 2002; Lutz 등, 2013; Kwon 등, 2017a). 하지만 체세포 복제동물 생산 효율은 일반적으로 1-3% 내외로 매우 낮은 것으로 알려져 있으며(Van Thuan 등, 2010), 체세포복제 효율은 공여세포의 종류, 체외배양 기술 및 핵이식 방법 등 다양한 요인들에 의해 기인되는 공여세포와 수핵란 세포 질간의 불완전한 상호작용에 의한 것으로 여겨지고 있다(Narbonne와 Gurdon, 2012). 최초의 체세포 핵이식 복제동물인 복제양 Dolly의 경우 조기 노화가 진행되었으며, 비정상적으로 짧아진 telomere가 그 원인으로 보고되었다(Shiels 등, 1999).
체세포 핵이식 기술은 무엇인가?
체세포 핵이식 기술(somatic cell nuclear transfer; SCNT)은 유용 물질을 생산하거나 장기이식을 위한 형질전환 동물을 생산하기 위한 효과적인 방법으로 다양한 종류의 형질전환 동물의 생산에 이용되고 있다(Lai 등, 2002; Lutz 등, 2013; Kwon 등, 2017a). 하지만 체세포 복제동물 생산 효율은 일반적으로 1-3% 내외로 매우 낮은 것으로 알려져 있으며(Van Thuan 등, 2010), 체세포복제 효율은 공여세포의 종류, 체외배양 기술 및 핵이식 방법 등 다양한 요인들에 의해 기인되는 공여세포와 수핵란 세포 질간의 불완전한 상호작용에 의한 것으로 여겨지고 있다(Narbonne와 Gurdon, 2012).
돼지 iPSC를 생산하고 이를 이용하여 핵이식 복제란의 생산 효율을 검토한 결과는 어떠한가?
전능성 인자(Oct-4)의 유전자 발현의 경우 iPSC-NT 유래 배반포에서 높게 나타났다. 결과적으로 iPSC-NT 핵이식란의 경우 초기 발육율은 낮으나 생산된 배반포는 질적으로 우수한 것으로 나타나 iPSC을 핵이식 공여세포로서 다양하게 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
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